Introduction
乳腺癌是影响世界各地的女性人口中最常见的恶性肿瘤之一。超过130万例乳腺癌，每年全世界1,2报告。虽然肿瘤细胞已被传统上被视为生物学均匀和高度增殖，它已成为明显的是，乳腺癌是遗传和临床异质性。耐流行抗癌药物是先进乳腺癌的标志，导致通过它的癌症进展和远处转移3的便利在大多数患者的死亡率。
微RNA（miRNAs）是一类通过阻断mRNA翻译或介导的mRNA降解4调节基因表达的小RNA分子约22个核苷酸长的。超过2000种不同的miRNA迄今已在人类中，它们与人类疾病5识别。越来越的研究阵列甲肝Ë证实的miRNA可以作为癌基因和肿瘤抑制基因的功能，并且经常在肿瘤中6失调。通过控制细胞周期进程，衰老，凋亡和自噬的主要调节的miRNA强烈影响所有初级肿瘤发生的，与这些肿瘤细胞运动性，侵入和转移7的沿。
miRNA表达异常，已与临床意义，如分期，分化程度，预后和应对辅助治疗8也被相关。特别是，增加的miR-146表达与肺癌患者9预后差相关。另一项研究已经证明了miRNA-let7b失去表达是与恶性表型，因此，生存差6。理解表达的miRNA在细胞类型和结构是理解机制的重要组成部分，通过它miRNA表达影响细胞改变和组织表型10。发现在基质细胞被分泌某些miRNA的取在由上皮细胞并在它们的靶标特异性作用。本着同样的精神中，miR-212和miR-132是由间质分泌和调节乳腺发育11期间导管生长所需的上皮-间质相互作用。本文的总体目标是解释一个详细的协议，并通过miRNA的原位杂交技术检测乳腺癌组织中的miRNA表达。我们优化所有条件以测定乳腺癌患者样品中的miRNA-489的表达水平。为此，我们使用标有DIG在我们的实验锁核酸（LNA）探针。它的一些核苷酸的有一个LNA修饰，即，亚甲基桥连接的2'氧原子和4'核糖主链固定，使得它保持“锁定就位”杂交后的碱基的碳原子上。其结果，这是更为困难用于杂交复合变性12,13。
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Protocol
这项研究是经全南大学和顺医院的机构审查委员会和南卡罗来纳大学。乳腺癌旁正常乳腺组织组成的TMA样品进行了全南国立大学和顺医院，韩国生物库网络的成员的生物银行提供的。
1.溶液的制备
- 准备1升DNA酶和RNA酶自由水。请使用酸二乙酯（DEPC）处理过的水的所有化学解决方案。治疗1升水中，用500μL的DEPC孵育在室温下3小时。高压灭菌水以灭活DEPC。
注意：不要吸入DEPC因为它是已知的致癌物质。 - 用DEPC处理过的水从10倍PBS准备1X PBS。
- 制备20×SSC（溶解175.3克NaCl和在800毫升水88.2克柠檬酸钠，用盐酸的14 N溶液几滴调节pH至7.0并定容至1L用笏尔），4％多聚甲醛，95％乙醇，80％的乙醇用DEPC处理过的水。
- 加入8毫升三乙醇胺和1.05 590毫升DEPC处理过的水的毫升盐酸，并添加1.5毫升乙酸酐乙酰化。
- 在缓冲液制备50微克/微升蛋白酶K（50毫摩尔Tris盐酸，于DEPC pH 8.0的处理过的水）。
- 制备的500微升甲酰胺，250微升20×SSC，100微升的50×Denhardt氏溶液，12.5微升叔RNA的，2.5微升鲱鱼精DNA，RVC 30微升和0.02克封闭试剂和50微升的组成的杂交缓冲DEPC的水。准备好新鲜。
2.乳腺组织切片
- 切5μm的福尔马林固定，石蜡包埋切片用切片机和适用于充电幻灯片14上的部分。
注意：这里使用的乳腺组织是从韩国生物库网络事先准备好的。
3.组织准备
- 除去来回石蜡浸渍滑入科普林缸2倍在新鲜的二甲苯10分钟每m为组织和再水合5分钟孵育的组织切片中在DDH 2 O递减的乙醇（100％，95％和80％）浓度执行在通风橱中此步骤。
- 沉浸于DEPC所述组织处理水5分钟。在这一点上使周围疏水屏障笔组织切片边界。
- 固定用4％PFA的组织15分钟，随后用PBS洗涤。
- 浸入所述组织中的0.3％的Triton X-100 / PBS中进行10分钟，随后用PBS洗涤。
- 孵育样品与在37℃下50微克/微升蛋白酶K溶液15分钟。然后孵育用三乙醇胺和乙酸酐的组织切片，在室温下5分钟，随后用PBS洗涤。没有的PBS洗涤是必需的蛋白酶K处理和三乙醇胺/乙酸酐处理之间。
4.杂交
- 彻底洗净INCU组织软化的组织切片在室温下用杂交缓冲液进行2至3小时。通常为120微升杂交缓冲液是足以覆盖组织切片。
- 稀释5'-DIG标记LNA探针在120微升杂交液15:00的终浓度。作为原料浓度通常为40纳克/微升，加入3微升的库存120微升杂交缓冲液，并在95℃下孵育混合物5分钟。
- 在潮湿室孵育在54°C（Tm）的带探头一夜之间组织切片。通常情况下120微升足以覆盖一个部分。通过使用两个湿纸巾创建湿度。室的理想的尺寸是8英寸10英寸。
- 注意：Tm为可能是不同的miRNA不同。 54℃是用于提的miR-489。
5.严格清洗
- 洗5倍SSC组织7分钟（杂交步骤后，RNA酶条件是不再需要）。
- 洗净组织切片机智^ h 1X SSC在57℃7分钟两次。
- 在57℃下接触，用0.2X SSC组织切片7分钟。
- 洗用0.2×SSC的组织切片，在室温下7分钟。
- 孵育在PBS组织切片10分钟。
6.阻塞
- 孵育所述组织部分与在潮湿室（为了使封闭缓冲液中加2ml胎牛血清，10微升吐温20和3微升的BSA在18米PBS中。保存在4封闭缓冲液阻断在室温下缓冲液1小时 C）。
7.一抗孵化和发展
- 稀释1：300的抗DIG-AP抗体在封闭缓冲液并在4℃孵育用抗体的组织切片过夜。
- 用洗涤缓冲液洗切片3次，每次5分钟（通过显影试剂盒中提供缓冲液）。
- 开发与碱性磷酸酶商业试剂盒产生CY-3荧光灯的组织切片。 <利>清洗用洗涤缓冲液的部分5分钟。染色部用100μl2.5毫微克/微升的Hoechst染料的5分钟，然后用5分钟洗涤用洗涤缓冲液。
- 安装具有根据制造商的协议安装缓冲器的部分。使用每个组织切片15微升，并擦拭组织的过度安装溶液擦拭。密封采用透明指甲油，以防止泄露的幻灯片。
- 观察与10X镜头所以总放大倍率使用部分荧光显微镜100X。
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Representative Results
人乳腺癌组织用于测定的miRNA-489的表达。乳腺腺管和上皮细胞被发现表达显著较高的miRNA-489比两个相邻的患者肿瘤组织（1B 图1A和）的水平。这清楚地表明了miRNA-489的表达已在肿瘤组织中丢失了，表明miRNA的-489的肿瘤抑制活性。为了进一步证实来自同一患者这些结果，肿瘤组织和邻近的正常组织进行比较。如在图2A和2B观察到的，正常组织被发现表达更多的miRNA-489比其邻近的肿瘤组织。 10微米图像显示比例尺。图像是通过使用10X透镜。
图1：的miR-489在正常乳腺组织中的表达。这两个正常管道结构和肿瘤细胞上显示相同部分。组织是从不同的乳腺癌患者。正常乳腺导管和乳腺表达的miRNA-489不存在肿瘤组织的同时。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：的miR-489在乳腺癌患者对表达的组织微阵列用于研究乳腺癌患者的miR-489表达。一位代表对患者在这里显示。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本研究的目的是确定在原位杂交使用的miRNA乳腺癌组织的miRNA的表达水平。必须指出，在该实验中，所有条件为乳腺癌组织优化。进一步的优化可能需要的其它类型的组织。所有解决方案必须用DEPC水进行，也可以使用所有的容器应用DEPC处理过的水冲洗，随后高压灭菌。即使是轻微的RNase污染可以用实验的最终结果产生干扰。作为miRNA的是一个非常短的序列，其有必要使用的LNA探针，以便于与目标更好的杂交。此外，组织固定，用无RNA酶的蛋白酶K处理后，是绝对必要的，否则蛋白质可以用与内源miRNA的探针的杂交造成干扰。此外，温育与探针的组织部分之前，后者必须煮沸至95 °C到任何展开二级结构。
孵育过夜后，将其与在协议上述温度变化的SSC的浓度，以减少非特异性结合洗是重要的。对荧光的发展，孵育组织部分与底物至少1小时。最好是观察部在整个孵育所以能够避免过度开发。一定要安装与随试剂盒提供的安装媒体部分。
有一个应在考虑的一个限制因素。如果目标miRNA表达的组织下，将很难使用这种技术来检测其表达。它始终是最好执行此协议与阳性对照，如U6因此该技术可以确认，所有试剂都保证是工作，他们是RNA酶。
有可能在弱标志的情况下，而不是使用DIG标记的探针的生物素标记的探针人与DIG标记探针。信号放大是通过使用生物素抗生物素蛋白系统成为可能。亲有生物素很强的亲和力。通过采取这一亲和力的优点，有可能用抗生物素蛋白 - 生物素双工其与碱性磷酸酶连接来标记生物素探针。通过使用这种策略，可以扩增对低丰度的miRNA信号为好。
miRNA的领域正在迅速崛起，因为miRNA的关键细胞过程中发挥关键作用，并与肿瘤发生，发展是密切相关的。此外，这些miRNA也可以用作癌症诊断生物标志物。一些研究已经表明miRNA表达与临床参数之间的强相关性，例如肿瘤阶段提示在癌症预后miRNA表达的可能的应用。这种技术也可以用于在其他类型的癌症的miRNA表达分析。例如中，miR-182和miR-503的表达在结肠癌症患者组织使用SI分析涂杂交15。
传统的基因表达分析可以揭示在组织的miRNA表达水平，但它不能揭示从结构的miRNA被表达的位置。通过使用这种技术，可以很容易地找到miRNA表达水平，以及位置。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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