Introduction
Brystkræft er blandt de mest almindelige maligne sygdomme, der påvirker den kvindelige befolkning over hele kloden. Over 1,3 millioner tilfælde af brystkræft rapporteres hvert år på verdensplan 1,2. Selv tumorceller har traditionelt været betragtet som biologisk homogen og yderst proliferativ, er det blevet klart, at brystkræft er genetisk og klinisk heterogen. Modstand mod fremherskende lægemidler mod cancer er kendetegnende for avancerede brystkræft, hvilket fører til dødeligheden i de fleste patienter gennem sin lettelse af kræft progression og afstand metastaser tre.
MikroRNA'er (miRNA) er en klasse af små RNA-molekyler omkring 22 nukleotider lange, der regulerer genekspression ved at blokere mRNA-translation eller mediering mRNA nedbrydning 4. Mere end 2.000 forskellige miRNA er hidtil blevet identificeret hos mennesker, som er knyttet til sygdomme hos mennesker 5. Et stigende antal undersøgelser have påvist, at miRNA kan fungere som onkogener og tumor undertrykkere og er ofte dysreguleret i tumorer 6. miRNA kraftigt påvirke hele den primære tumorigenese ved styring de store regulatorer af cellecyklusprogression, ældning, apoptose og autophagy, sammen med de af tumorcellemotilitet, invasion og metastase 7.
Afvigende miRNA udtryk er også blevet forbundet med kliniske implikationer såsom scenen, differentiering, prognose og respons på adjuverende behandling 8. Især steg MIR-146-ekspression er korreleret med dårlig prognose i lungekræftpatienter 9. En anden undersøgelse har vist, at mistet ekspression af miRNA-let7b er forbundet med maligne fænotyper og følgelig ringe overlevelse 6. Forståelse af de typer af celler og strukturer, der udtrykker miRNA er en vigtig del af at forstå mekanikken hvorigennem ændringer i miRNA udtryk indflydelse celle ogvæv Fænotypers 10. Visse miRNA fundet at blive udskilt i stromale celler taget i af epitelceller og specifikt handle på deres mål. På samme måde, er miR-212 og miR-132 udskilles af stroma og regulere epitel-stromale interaktioner, der kræves for duktalt udvækst under mælkekirtlerne udvikling 11. Det overordnede formål med denne artikel er at forklare en detaljeret protokol til at opdage miRNA udtryk i brystkræft væv gennem miRNA in situ hybridisering. Vi har optimeret alle forhold at analysere niveauerne af miRNA-489-ekspression i brystkræft patientprøver. Til dette formål anvendte vi en grave mærket låst nukleinsyre (LNA) probe i vores eksperiment. Nogle af dens nukleotider havde en LNA modifikation, dvs. en methylenbro forbinder 2 'oxygenatom og 4' carbonatom af ribose backbone som fastsætter nukleotid, således at den forbliver "låses" fast efter hybridisering. Som følge heraf er det meget vanskeligerefor det hybridiserede kompleks til at denaturere 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af Chonnam National University Hwasun Hospital og University of South Carolina. TMA prøver bestående af brystkræft og matchede tilstødende normale brystvæv blev leveret af Biobank af Chonnam National University Hwasun Hospital, et medlem af Korea Biobank Network.
1. Fremstilling af opløsning
- Forbered 1 L DNase og RNase-frit vand. Gør alle kemiske løsninger ved hjælp af diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlet vand. Treat 1 I vand med 500 pi DEPC og inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur. Autoklaver vand for at inaktivere DEPC.
Forsigtig: Undgå indånding DEPC da det er kendt kræftfremkaldende stof. - Forbered 1x PBS fra 10x PBS hjælp DEPC behandlet vand.
- Forbered 20x SSC (opløses 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumcitrat i 800 ml vand, pH indstilles til 7,0 med et par dråbe 14 N opløsning af HCI og justere lydstyrken til 1 l med watER), 4% paraformaldehyd, 95% ethanol, 80% ethanol under anvendelse af DEPC behandlet vand.
- Tilsæt 8 ml triethanolamin og 1,05 ml af HCI i 590 ml DEPC-behandlet vand, og der tilsættes 1,5 ml eddikesyreanhydrid til acetylering.
- Forbered 50 pg / pl proteinase K i buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0 i DEPC behandlet vand).
- Forbered hybridiseringsbuffer bestående af 500 pi formamid, 250 pi 20x SSC, 100 pi 50x Denhardts opløsning, 12,5 pi t-RNA, 2,5 pi af sild sperma DNA, 30 pi RVC, 0,02 g blokeringsreagens og 50 pi DEPC vand. Forbered frisk.
2. Breast Vævssnit
- Skær 5 um formalin-fikseret paraffinindlejrede sektioner med mikrotom og anvende afsnit til at opkræve slide 14.
Bemærk: brystvæv bruges her var forberedt tidligere fra Korea Biobank Network.
3. Tissue Forberedelse
- Fjern paraffin from vævet ved nedsænkning glider ind Coplin-skål 2x med fersk xylen i 10 min hver og rehydrere vævssnittet af 5 min inkubationer i faldende koncentrationer af ethanol (100%, 95% og 80%) i Hedeselskabet 2 O. Udfør dette trin i et stinkskab.
- Fordybe vævet i DEPC behandlet vand i 5 min. På dette punkt gør grænser omkring vævssnit med hydrofob barriere pen.
- Fastgør vævet med 4% PFA i 15 minutter efterfulgt af en vask med PBS.
- Fordybe vævet i 0,3% Triton X-100 / PBS i 10 minutter efterfulgt af en vask med PBS.
- Inkuber prøve med 50 pg / pl proteinase K opløsningen i 15 minutter ved 37 ° C. Derefter inkuberes vævssnit med triethanolamin og eddikesyreanhydrid i 5 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af en vask med PBS. Nr PBS vask kræves mellem proteinase K-behandling og triethanolamin / eddikesyreanhydrid behandling.
4. Hybridisering
- Vask vævet grundigt og INCUbate vævet sektion med hybridiseringspuffer i 2 til 3 timer ved stuetemperatur. Typisk 120 pi hybridiseringspuffer er nok til at dække vævssnittet.
- Fortynd 5'-DIG-mærket LNA sonde til en slutkoncentration på 3:00 i 120 pi hybridiseringsopløsning. Som saldoen koncentration sædvanligvis er 40 ng / pl, tilsættes 3 pi lager til 120 pi hybridiseringsbuffer og inkuberes blandingen ved 95 ° C i 5 min.
- Inkuber vævssnit med probe natten over ved 54 ° C (Tm) i et fugtigt kammer. Typisk 120 pi er nok til at dække et afsnit. Opret fugtighed ved anvendelse af to våde papirhåndklæder. Den ideelle størrelse kammer er 10 inches med 8 inches.
- Bemærk: Tm kan være forskellige for forskellige miRNA. 54 ° C er omtale for miR-489.
5. stringensskylning
- Vask vævet med 5x SSC i 7 min (efter hybridisering trin, RNase gratis betingelser ikke længere påkrævet).
- Vask vævssnit with 1x SSC i 7 min to gange ved 57 ° C.
- Vask vævssnittet med 0,2 x SSC i 7 minutter ved 57 ° C.
- Vask vævssnittet med 0,2 x SSC i 7 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber vævssnit i PBS i 10 min.
6. Blokering
- Inkubér vævssnittet med blokerende buffer ved stuetemperatur i 1 time i et fugtigt kammer (For at få blokerende buffer overføres 2 ml FBS, 10 pi Tween-20 og 3 pi BSA i 18 m PBS. Store blokerende buffer ved 4 ° C).
7. Primært antistof Inkubation og Udvikling
- Fortynd 1: 300 anti-DIG-AP antistof i blokeringspuffer og inkuberes vævssnittet med antistof ved 4 ° C natten over.
- Vask sektionerne med vaskebuffer 3 gange, i 5 min hver (buffer tilvejebragt af Development Kit).
- Udvikle vævssnittet med et kommercielt kit for alkalisk phosphatase, der producerer CY-3 florescent lys. <li> Vask afsnittet med vaskebuffer i 5 minutter. Stain sektion med 100 pi 2,5 ng / pl Hoechst farvestof i 5 minutter efterfulgt af en 5 min vask med vaskebuffer.
- Monter sektion med montering puffer ifølge fabrikantens protokol. Brug 15 pi pr vævssnit og tørre overdreven montering løsning med væv tørre. Forsegl dias med klar neglelak for at forhindre lækage.
- Overhold afsnittet fluorescerende mikroskop hjælp med 10X objektiv så total forstørrelse er 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Human brystcancer væv blev anvendt til at bestemme miRNA-489-ekspression. Brystkirtel kanal og epitelceller blev fundet at udtrykke signifikant højere miRNA-489 niveauer end tilstødende tumorvæv hos to patienter (figur 1A og 1B). Dette viser tydeligt, at miRNA-489 ekspression er blevet tabt i tumorvæv, hvilket tyder tumor-undertrykkende aktivitet af miRNA-489. For yderligere at bekræfte disse resultater, tumorvæv og tilstødende normalt væv fra den samme patient blev sammenlignet. Som observeret i figur 2A og 2B, blev den normale væv fundet at udtrykke mere miRNA-489 end dens tilstødende tumorvæv. 10 um i billederne indikerer skala bar. Billeder blev taget ved hjælp af 10X objektiv.
Figur 1: Ekspression af MIR-489 i normalt brystvæv. Begge normale kanalstruktur og tumorceller er vist på samme sektion. Væv er fra forskellige brystkræftpatienter. Normal mamma kanal og mælkekirtler udtrykke miRNA-489, mens fraværende i tumorvæv. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Ekspression af MIR-489 i Breast Cancer Patient Pair væv micro-array blev anvendt til at undersøge MIR-489 ekspression i en patient med brystcancer. En repræsentant patient par er vist her. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne undersøgelse var at bestemme niveauet af miRNA ekspression i brystkræft væv under anvendelse miRNA in situ hybridisering. Det skal bemærkes, at i dette eksperiment blev alle forhold optimeret for brystkræft væv. Yderligere optimering kan være nødvendige til andre vævstyper. Alle løsninger skal foretages med DEPC vand, og alle beholdere, der skal anvendes, bør skylles med DEPC behandlet vand og efterfølgende autoklaveres. Selv lille RNase forurening kan forstyrre det endelige resultat af forsøget. Som miRNA er en meget kort sekvens, er det nødvendigt at anvende en LNA sonde til at lette bedre hybridisering med target. Endvidere efter vævsfiksering, behandling med RNase-fri Proteinase K er absolut nødvendigt ellers proteiner kan forstyrre hybridisering af proben med det endogene miRNA. Derudover før inkubering vævssnittet med proben, bør det koges til 95 ° C til udfolde nogensekundære strukturer.
Efter inkubering natten over, er det vigtigt at vaske med varierende koncentrationer af SSC ved ovennævnte i protokol temperatur for at reducere ikke-specifik binding. Til udvikling af fluorescens, inkuberes vævssnit med substrat i mindst 1 time. Det er tilrådeligt at observere tykkelse overalt inkubation så overdevelopment kan undgås. Sørg for at montere sektion med de voksende medie, der leveres med kittet.
Der er en begrænsende faktor, at man skal tage i betragtning. Hvis målet miRNA udtryk er lavere i væv, vil det være svært at opdage sit udtryk ved hjælp af denne teknik. Det er altid tilrådeligt at udføre denne protokol med en positiv kontrol såsom U6 så teknikken kan bekræftes, og alle reagenser er sikret at arbejde, og de er RNase fri.
Det er muligt at anvende biotin-mærket probe i stedet for DIG-mærket probe i tilfælde af svage tegnal med DIG-mærket probe. Signalforstærkning er mulig ved anvendelse af biotin-avidin system. Avidin har en stærk affinitet til biotin. Ved at udnytte denne affinitet, er det muligt at mærke biotin probe med avidin-biotin duplex, som er vedhæfte med alkalisk phosphatase. Ved at bruge denne strategi, er det muligt at forstærke signalet til lav rigelige miRNA samt.
Feltet af miRNA er hastigt voksende, da miRNA spiller kritiske roller i centrale cellulære processer og er stærkt knyttet til udviklingen af kræft. Desuden kan disse miRNA også anvendes som biomarkør ved cancer diagnose. Flere studier har indikeret en stærk korrelation mellem miRNA-ekspression og kliniske parametre såsom tumor stadie tyder mulige anvendelse af miRNA udtryk i kræft prognose. Denne teknik kan også anvendes til miRNA ekspressionsanalyse i andre typer cancer. For eksempel blev der udtryk for miR-182 og miR-503 analyseret i tyktarmskræft patient væv ved hjælp i situ hybridisering 15.
Traditionelle genekspression analyse kan afsløre miRNA ekspressionsniveauet i væv, men det kan ikke afsløre det sted, hvorfra struktur miRNA bliver udtrykt. Ved at bruge denne teknik, kan man nemt finde miRNA udtryk niveau samt placering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
