Introduction
Meme kanseri dünya genelinde kadın nüfusu etkileyen en yaygın maligniteler arasında yer alıyor. Meme kanseri 1.3 milyon vaka dünya çapında 1,2 yılda bildirilmektedir. Tümör hücreleri, geleneksel biyolojik homojen ve yüksek proliferatif olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, meme kanseri genetik ve klinik heterojen olduğunu belirgin hale gelmiştir. Yaygın antikanser ilaçlara direnç kanser ilerleme ve mesafe metastazı 3 onun kolaylaştırılması yoluyla hastaların çoğunluğunda mortaliteye neden ilerlemiş meme kanserlerinin bir özelliğidir.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) mRNA translasyonunu bloke veya mRNA bozulmasını 4 aracılık gen ekspresyonunu düzenleyen yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda küçük RNA molekülleri sınıfıdır. 2.000 'den fazla farklı miRNA'lar kadar insan hastalıkları 5 ile bağlantılı olan, insanları tespit edilmiştir. çalışmalar artan bir dizi havE miRNA'lar onkojenlerin ve tümörleri giderici olarak işlev görebilir ve genellikle tümör 6 düzensiz olduğunu göstermiştir. miRNA'lar kuvvetle tümör hücre hareketi, invazyon ve metastaz 7 olanlarla birlikte hücre döngüsü ilerlemesinin, yaşlanma, apoptoz ve otofaji önemli regülatörleri kontrol ederek birincil tümörogenez tüm etkileyebilir.
Aberrant miRNA ifade aynı zamanda sahne, farklılaşma, prognozu ve adjuvan tedavi 8 yanıt olarak klinik etkileri ile ilişkili olmuştur. Özellikle, miR-146 ifadesi akciğer kanserli hastalarda 9 kötü prognoz ile ilişkilidir arttı. Başka bir çalışmada, miRNA let7b kayıp sentezleme Sonuç olarak, zayıf yaşama 6, habis fenotipler ile bağlantılı ve göstermiştir. miRNA'lar ifade eden hücrelerin ve yapı türlerini anlamak olduğunu mekaniğini anlamak önemli bir parçası geçtiği miRNA ifade etkisi hücrede değişiklikler veDoku 10 fenotip. stromal hücrelerde salgılandığı bulunmuştur belirli miRNA'ların epitel hücreleri tarafından alınır ve özel olarak hedef doğrultusunda hareket edilir. Aynı şekilde, miR-212 ve miR-132 meme bezi gelişimi sırasında 11 duktal büyümesi için gerekli epitel-stromal etkileşimleri stroma tarafından salgılanan ve regüle edilir. Bu çalışmanın genel amacı in situ hibridizasyon miRNA ile meme kanseri dokularında miRNA ifade algılamak için ayrıntılı bir protokol açıklamaktır. Biz meme kanseri hasta örneklerinde miRNA 489 ifadesinin seviyelerini analiz etmek için tüm şartları optimize ettik. Bu amaçla, işaretlenmiş DIG eden deneyde nükleik asit (LNA) prob kilitli kullanılır. Bunu nükleotid bazı, yani, bir LNA modifikasyonu sahip 2 ', oksijen atomu ve 4' de hibridizasyon sonrası "yerine kilitli" kalacak şekilde nükleotidi giderir riboz omurga karbon atomu bağlayan bir metilen köprüsü. Bunun bir sonucu olarak, çok daha zorhibridize kompleksi 12,13 denatüre etmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Kurumsal Gözden Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi Yönetim Kurulu ve Güney Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Meme kanseri ve eşleşen bitişik normal meme doku oluşan TMA örnekleri Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi, Kore Biobank Ağının bir üye Biobank tarafından temin edildi.
1. Solüsyon Hazırlama
- DNaz ve RNaz içermeyen su 1 L hazırlayın. diethylpyrocarbonate (DEPC) arıtılmış su kullanan tüm kimyasal çözümler olun. DEPC 500 ul su ile 1 L tedavi ve oda sıcaklığında 3 saat inkübe edilir. DEPC inaktive su Otoklav.
Dikkat: karsinojen bilindiğinden DEPC teneffüs etmeyin. - DEPC arıtılmış su kullanılarak 10x PBS 1x PBS hazırlayın.
- 20x SSC (NaCl 175.3 g ve 800 ml su içinde sodyum sitrat 88.2 g çözülür hazırlanması HCI 14 N çözelti bir kaç damla 7.0 pH ayarlamak ve wat 1 L ses seviyesini ayarlamakER),% 4 paraformaldehit,% 95 etanol,% 80 etanol DEPC işlenmiş su ile.
- 8 trietanolamin ilave edildi ve DEPC ile muamele edilmiş su 590 ml HCI 1.05 ml ilave edilir ve asetilasyonu için asetik anhidrid 1.5 ml ilave ediniz.
- tampon maddesi içinde 50 ug / ml proteinaz K hazırlama (50 mM Tris-HCI, DEPC pH 8.0 su muamele edilmiş).
- formamid 500 ul 20x SSC 250 ul, 50x Denhardt çözeltisi, 100 uL, t-RNA 12.5 ul, ringa sperm DNA'sı 2.5 ul, RVC 30 ul, bloke reaktif ve 50 ul 0.02 g oluşan hibridizasyon tamponu hazırlayın DEPC su. taze hazırlayın.
2. Meme Doku Bölümler
- Mikrotom ile 5 mikron formalin ile fikse parafine gömülü bölümleri kesmek ve slayt 14 şarj etmek bölüm uygulayın.
Not: Burada kullanılan meme dokusu Kore Biobank Network önceden hazırlanmıştır.
3. Doku Hazırlanması
- fro parafin kaldır10 dakika boyunca, taze ksilen Coplin kavanoza 2x her bir slayt daldırarak doku m ve GKD 2 O etanol (% 100,% 95 ve% 80) ve azalan konsantrasyonlarda 5 dakika inkubasyon doku bölümü rehidrasyonu Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin.
- DEPC doku 5 dakika arıtılmış su bırakın. Bu noktada hidrofobik bariyer kalemle doku bölümünde etrafında sınırları yapmak.
- PBS ile yıkama, ardından 15 dakika boyunca% 4 PFA doku çözmek.
- PBS ile yıkama, ardından 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 / PBS doku bırakın.
- 37 ° C'de 15 dakika boyunca 50 ug / ml Proteinaz K çözeltisi ile örnek inkübe edin. Daha sonra PBS ile bir yıkama ve ardından, oda sıcaklığında 5 dakika için, trietanolamin ve asetik anhidrid ile doku bölümleri inkübe edin. Hiçbir PBS yıkama Proteinaz K tedavisi ve trietanolamin / asetik anhidrit tedavisi arasında gereklidir.
4. Melezleme
- İyice ve incu doku yıkayınOda sıcaklığında 2 ila 3 saat için hibritleme tampon maddesi ile asitleme doku kesiti. Tipik 120 ul hibridizasyon tamponu doku bölümünü karşılamak için yeterli olduğunu.
- Seyreltik 5'-DIG 120 ul hibridizasyon çözeltisi içinde 3 uM nihai konsantrasyona kadar LNA etiketlenmiş prob. stok konsantrasyonu genellikle 40 ng / | il olduğu için, 120 ul hibridizasyon tamponu stok 3 ul ilave et ve 5 dakika boyunca 95 ° C'de karışım inkübe edin.
- nemli bir oda içinde 54 ° C'de (Tm) prob gece boyunca doku bölümü inkübe edin. Tipik 120 ul bir bölüm karşılamak için yeterlidir. İki ıslak kağıt havlu kullanılarak nem oluşturun. odasının ideal boyutu 8 inç 10 inç.
- Not: Tm Farklı miRNA için farklı olabilir. 54 ° C miR-489 için söz olduğunu.
5. sıkılık yıkama
- 7 dakika boyunca 5x SSC ile doku yıkayın (melezleme aşamasından sonra, RNaz ücretsiz koşullar artık gerekli vardır).
- doku kesiti wit yıkayın57 ° C 'de iki kez 7 dakika süre ile H, 1x SSC.
- 57 ° C 'de, 7 dakika için 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın.
- Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın.
- 10 dakika boyunca PBS içinde doku kesiti inkübe edin.
6. Engelleme
- (Tampon PBS 18 m 2 mi FBS, Tween-20, 10 ul BSA 3 ul bloke yapmak için. Mağazası 4 ° C'de tampon bloke nemli bir oda içinde, 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici tampon ile doku kesiti inkübe ° C).
7. Birincil Antikor Kuluçka ve Kalkınma
- bloke edici tampon içinde 300, anti-DIP-AP antikor ve gece boyunca 4 ° C 'de antikor ile doku kesiti inkübe: 1 seyreltin.
- Her biri 5 dakika (geliştirme kiti tarafından sağlanan tampon maddesi) için, yıkama tamponu ile 3 kez bölümleri yıkayın.
- CY-3 floresan ışık üretir alkalin fosfataz için bir ticari kit ile doku bölümü geliştirin. <li> 5 dakika boyunca yıkama tamponu ile bölüm yıkayın. Yıkama tamponu ile 5 dakika yıkama ve ardından, 5 dakika boyunca 2.5 ng / ml Hoechst boya, 100 ul Leke bölümü.
- üreticinin protokolüne göre bir tampon montaj bölümüne monte edin. Doku Bölüm başına 15 ul kullanın ve doku ile aşırı montaj çözümü silin silin. sızıntı önlemek için şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür.
- 10X objektif yani toplam büyütme kullanarak bölüm floresan mikroskop gözlemleyin 100X olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan göğüs kanseri dokusu miRNA 489 ekspresyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Meme bezi kanalı ve epitel hücreler bitişik iki hastada tümör dokusunda (Şekil 1A ve 1B) önemli ölçüde daha yüksek MiRNA-489 seviyelerini ifade bulunmuştur. Bu açıkça miRNA 489 ifadesi miRNA 489 tümör baskılayıcı aktivite düşündüren, tümör dokusunda kayıp olduğunu göstermektedir. daha da aynı hastadan alınan, bu sonuçlar, tümör dokusu ve bitişik normal doku doğrulamak için karşılaştırılmıştır. Şekil 2A ve 2B'de görüldüğü gibi, normal doku bitişik tümör dokusu daha miRNA 489 eksprese olduğu bulunmuştur. Görüntülerde 10 mikron çaplı bar gösterir. Görüntüler 10X lens kullanarak alınmıştır.
Şekil 1: normal meme dokusunda miR-489 sentezlenmesi. Hem normal hem de kanal yapısı ve tümör hücreleri, aynı bölümde gösterilir. Dokular, farklı meme kanseri hastalarında vardır. Normal meme kanalı ve meme bezi tümör dokusunda ise yok miRNA 489 ifade eder. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Göğüs kanseri hastasından çifti Mir-489 sentezlenmesi doku mikro dizi, bir göğüs kanseri hasta miR-489 ekspresyonunu incelemek için kullanılmıştır. Bir temsilci hasta çifti burada gösterilmektedir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, in situ hibridizasyon miRNA kullanarak meme kanseri dokularında MiRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için yapıldı. Deneyde, tüm koşullar meme kanseri dokusu için optimize olduğu not edilmelidir. Ayrıntılı optimizasyon diğer doku tipleri için gerekli olabilir. Bütün çözeltiler DEPC su ile yapılmalıdır ve kaplar DEPC işlenmiş, su ile durulandı ve daha sonra otoklavlanmalıdır kullanılır. Hatta hafif RNaz kirlenme deney nihai sonucu etkileyebilir. MiRNA çok kısa bir dizisi olduğu için, hedef daha hibridizasyon kolaylaştırmak için bir LNA prob kullanmak gereklidir. Ayrıca, RNaz içermeyen Proteinaz K doku fiksasyon, tedaviden sonra, aksi proteinler endojen miRNA'nın ile sondanın hibridizasyon müdahale edebilir kesinlikle gereklidir. Buna ek olarak, sonda ile doku kesiti inkübe edildi, ikinci 95 kaynatılması gereken herhangi açılmak C °ikincil yapılar.
gece boyunca inkübe edildikten sonra, spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için bir protokol, yukarıda sözü edilen ısıda SSC konsantrasyonları ile yıkamak için önemlidir. floresans geliştirilmesi için, en az 1 saat süre ile alt-tabaka ile doku kesiti inkübe edin. O overdevelopment önlenebilir, böylece, kuluçkalama boyunca bölümü gözlemlemek için tavsiye edilir. kiti ile sağlanan montaj medya ile bölümüne monte edildiğinden emin olun.
tek dikkate almalısınız bir sınırlayıcı faktör vardır. Hedef miRNA ifade dokuda düşükse, bu tekniği kullanarak ifade algılamak için zor olacak. Teknik teyit edilebilir ve tüm reaktifler çalışma sağlanacaktır ve ücretsiz RNAaz ari, böylece bu tür U6 olarak bir pozitif kontrol ile bu protokolü gerçekleştirmek için her zaman tavsiye edilir.
Zayıf bir işaret söz konusu olduğunda değil, DIG etiketli prob biyotin etiketli sonda kullanmak mümkündürDIG Al etiketlenmiş prob. Sinyal büyütme biyotin-avidin sistemi ile mümkündür. Avidin biotin için güçlü bir yakınlık vardır. Bu afinite yararlanarak, alkalin fosfataz ile bağlamak olduğunu avidin-biotin dubleks ile biyotin probu etiketlemek mümkündür. Bu strateji kullanılarak, hem de düşük bol miRNA için sinyal yükseltmek mümkündür.
miRNA'ların önemli hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve güçlü bir kanser gelişimi ile bağlantılıdır çünkü miRNA'nın alanı hızla ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu miRNA'ların kanser tanısında belirteç olarak da kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda kanser prognozu miRNA ifade olası uygulama düşündüren tümör evresi olarak miRNA ifade ve klinik parametreler arasında güçlü bir korelasyon göstermiştir. Bu teknik, diğer kanser türlerinde MiRNA ifade analizi için kullanılabilir. Örneğin, miR-182 ve miR-503 ekspresyonu si kullanılarak kolon kanseri dokularında incelenditu melezleme 15.
Geleneksel gen ekspresyon analizi dokusunda miRNA ifade seviyesini ortaya çıkarabilir ancak miRNA ifade ediliyor hangi yapı dan konumu veremiyoruz. Bu tekniği kullanarak, kolayca konumu yanı sıra miRNA ifade seviyesini bulabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
