Introduction
乳がんは世界中の女性人口に影響を与える最も一般的な悪性腫瘍の一つです。乳癌の130万以上の例は世界的に毎年1,2報告されています。腫瘍細胞は、伝統的に、生物学的に均一で高い増殖性とみなされてきたが、乳癌は遺伝的および臨床的に不均一であることが明らかになってきています。流行している抗がん剤に対する耐性は、癌の進行と距離転移3のその促進を通じ、大多数の患者の死亡率につながる、先進的な乳癌の特徴です。
マイクロRNA（miRNA）はmRNAの翻訳を遮断またはmRNA分解4を媒介することにより遺伝子発現を調節する約22ヌクレオチド長の小RNA分子のクラスです。 2,000人以上の異なるmiRNAは、これまでヒト疾患5にリンクされている人間、で同定されています。研究の増加アレイは、肝炎Eは、miRNAが癌遺伝子及び腫瘍抑制因子として機能することができ、多くの場合、腫瘍6の異常調節されていることを実証しました。 miRNAは強く腫瘍細胞の運動性、浸潤および転移7のものと一緒に、細胞周期の進行、老化、アポトーシスおよびオートファジーの主要な調節因子を制御することにより、一次腫瘍形成のすべてに影響を与えます。
異常なmiRNA発現はまた、ステージ、分化、予後およびアジュバント療法8に対する応答として臨床的意義と関連しています。具体的には、のmiR-146の発現が、 肺癌患者9における予後不良と相関して増加しました。別の研究では、miRNA-let7bの失われた式は、悪性の表現型にリンクされていると、結果的に、低い生存率6されていることを実証しました。 miRNAを発現する細胞と構造の種類を理解することは、miRNAの発現に影響を与える細胞の変化、それを通して力学を理解することの重要な部分であり、組織は10を表現型。間質細胞で分泌されることがわかっ特定のmiRNAは、上皮細胞によって取り込まれ、具体的にその標的に作用しています。同じ静脈では、のmiR-212およびmiR-132は、間質から分泌され、乳腺発達11時の乳管伸長に必要な上皮-間質相互作用を調節しています。この論文の全体的な目的は、in situハイブリダイゼーションにおける miRNAを介して乳癌組織におけるmiRNAの発現を検出するための詳細なプロトコルを説明することです。我々は、乳癌患者サンプル中のmiRNA-489の発現のレベルをアッセイするために、すべての条件を最適化しました。この目的のために、我々は、DIGがロックされた核酸（LNA）、我々の実験でプローブを標識しました。そのヌクレオチドのいくつかは、それは、2 '酸素原子と4'は、ハイブリダイゼーション後の「適所にロックされた」ままになるようにヌクレオチドを固定リボース骨格の炭素原子を連結するメチレン架橋であり、LNA修飾を有していました。結果として、それははるかに困難ですハイブリダイズした複合体は、12,13を変性するために。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は、全南大学校和順病院、サウスカロライナ大学の治験審査委員会によって承認されました。乳がんと一致した隣接する正常な乳房組織で構成されるTMAサンプルは全南大学校和順病院、韓国バイオバンクネットワークのメンバーのバイオバンクから提供されました。
1.溶液の調製
- DNアーゼおよびRNaseフリー水1リットルを準備します。ジエチル（DEPC）処理水を使用して、すべての化学溶液を作ります。 DEPCの500μlの水1Lを治療し、室温で3時間インキュベートします。 DEPCを不活性化するために水をオートクレーブ。
注意：それは発癌物質知られているので、DEPCを吸入しないでください。 - DEPC処理水を使用して、10×PBSから1×PBSを準備します。
- 、20×SSC（塩化ナトリウムの175.3グラムと800ミリリットルの水でクエン酸ナトリウムの88.2グラムを溶解を準備HClを14 N溶液数滴でpHを7.0に調整し、ワットで1Lにボリュームを調整ER）、4％パラホルムアルデヒド、95％エタノール、80％エタノールDEPC処理水を用いました。
- 8トリmlのDEPC処理水590ミリリットル中のHClの1.05ミリリットルを加え、アセチル化のための無水酢酸1.5ミリリットルを追加します。
- バッファ中の50μg/μlのプロテイナーゼK（50 mMトリス - 塩酸、pHが8.0をDEPCで処理水を）を準備します。
- ホルムアミド500μlの、20×SSCを250μl、50×デンハルト溶液100μl、T-RNAの12.5μlを、ニシン精子DNA2.5μlの、RVCの30μlの、ブロッキング試薬及び50μlに0.02グラムで構成されるハイブリダイゼーション緩衝液を準備しますDEPC水の。新鮮な準備をします。
2.乳房組織切片
- ミクロトームで5μmのホルマリン固定パラフィン包埋切片をカットし、スライド14を充電するためのセクションを適用します。
注：ここで使用される乳房組織は、韓国バイオバンクネットワークから先に調製しました。
3.組織標本
- あちこちパラフィンを削除します10分間新鮮なキシレンでコプリンジャーの2倍に各々のスライドを浸漬することにより、組織をMとのddH 2 Oにエタノール（100％、95％及び80％）の濃度を減少させるで5分間のインキュベーションによって組織切片を再水和ドラフト内で、この手順を実行します。
- 5分間のDEPC処理水で組織を浸します。この時点で、疎水性バリアペンで組織切片の周りに境界線を作ります。
- PBSで洗浄した15分間、4％PFAで組織を修正しました。
- PBSで洗浄し、続いて10分間、0.3％トリトンX-100 / PBSで組織を浸します。
- 37℃で15分間の50μg/μlのプロテイナーゼK溶液で試料をインキュベートします。その後PBSで洗浄し、続いて室温で5分間、トリエタノールアミンおよび無水酢酸で組織切片をインキュベートします。いいえPBS洗浄は、プロテイナーゼK処理およびトリエタノールアミン/無水酢酸処理の間に必要とされません。
4.ハイブリダイゼーション
- 徹底的にincu組織を洗います室温で2〜3時間のためのハイブリダイゼーション緩衝液を用いBATE組織切片。典型的には、120μlのハイブリダイゼーション緩衝液は、組織切片をカバーするのに十分です。
- 希釈5'-DIGは、120μlのハイブリダイゼーション溶液中の午後3時の最終濃度にLNAプローブを標識しました。ストック濃度は、通常、40 ngの/μlであるように、120μlのハイブリダイゼーション緩衝液に株式の3μlを添加し、95℃で5分間混合物をインキュベートします。
- 加湿チャンバー内で54°C（Tm）がでプローブ一晩で組織切片をインキュベートします。典型的には、120μlの1部をカバーするのに十分です。 2湿ったペーパータオルを使用して湿度を作成します。室の理想的なサイズは8インチ×10インチです。
- 注意：Tmは異なるmiRNAのために異なる場合があります。 54°Cは、miR-489のための言及です。
5.ジェンウォッシュ
- 7分間の5倍のSSCで組織を洗浄（ハイブリダイゼーション工程の後に、RNaseを含まない条件がもはや必須ではありません）。
- 組織切片のウィットを洗います二回57℃で7分間の時間1×SSC。
- 57℃で7分間、0.2×のSSCで組織切片を洗浄します。
- 室温で7分間、0.2×のSSCで組織切片を洗浄します。
- 10分間、PBS中の組織切片をインキュベートします。
6.ブロッキング
- バッファは、PBSの18メートルで、BSAのTween-20を3μlの10μlのを2ミリリットルのFBSを追加ブロッキングようにするには（湿潤チャンバー内で1時間室温でブロッキング緩衝液で組織切片をインキュベートします。Storeは4でブロッキング緩衝液 °C）。
7.一次抗体インキュベーション開発
- ブロッキング緩衝液中に300抗DIG-AP抗体と4℃で一晩抗体を用いた組織切片をインキュベート：1に希釈します。
- 5分ごと（開発キットにより提供バッファ）のために、洗浄緩衝液で3回のセクションを洗ってください。
- CY-3蛍光光を生成するアルカリホスファターゼのための市販のキットを用いて組織切片を開発します。 <李>は5分間の洗浄バッファーでセクションを洗ってください。洗浄緩衝液で5分間洗浄した5分間2.5 ngの/μlのヘキスト染料を100μlとステインセクション。
- 製造業者のプロトコルに従ってバッファを搭載してセクションをマウントします。組織切片あたり15μLを使用して、組織拭くと、過剰なマウントソリューションを拭いてください。漏れを防止するために、明確なマニキュアでスライドを密閉します。
- トータルの倍率は100倍である10倍レンズを使用したセクションの蛍光顕微鏡を観察します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ヒト乳癌組織のmiRNA-489の発現を決定しました。乳腺管上皮細胞は、隣接する二人の患者における腫瘍組織（ 図1Aおよび1B）よりも有意に高かったmiRNA-489レベルを発現することが見出されました。これは明らかなmiRNA-489の発現がmiRNA-489の腫瘍抑制活性を示唆し、腫瘍組織では失われていることを示しています。さらに、これらの結果を確認するために、同じ患者からの腫瘍組織と隣接する正常組織を比較しました。 図2Aおよび図2Bに観察されたように、正常組織は、その隣接する腫瘍組織よりも多くのmiRNA-489を発現することが見出されました。画像内の10μmのスケールバーを示しています。画像は、10倍レンズを使用して撮影しました。
図1：正常な乳房組織におけるmiR-489の発現両方通常のダクト構造および腫瘍細胞が同じセクションに表示されます。組織は、異なる乳癌患者からのものです。正常な乳管および乳腺不在ながら、腫瘍組織におけるmiRNA-489を発現します。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：乳癌患者ペアにおけるmiR-489の発現の組織マイクロアレイは、乳癌患者におけるmiR-489の発現を研究するために使用しました。一つの代表的な患者のペアはここに示されています。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究の目的は、in situハイブリダイゼーションのmiRNAを用いた乳癌組織におけるmiRNA発現のレベルを決定することでした。なお、この実験では、全ての条件が乳癌組織のために最適化されたことに注意しなければなりません。さらなる最適化は、他の組織タイプのために必要になることがあります。全ての溶液は、DEPC水で行う必要があり、使用されるすべての容器はDEPC処理水ですすぎ、続いてオートクレーブ処理されるべきです。わずかなのRNaseの混入は、実験の最終的な結果を妨害することができます。 miRNAが非常に短い配列であるので、標的とのより良いハイブリダイゼーションを容易にするために、LNAプローブを使用することが必要です。また、組織固定、治療後にRNaseフリープロテイナーゼKが絶対に必要であるとそれ以外のタンパク質は、内因性のmiRNAとのプローブのハイブリダイゼーションを妨害する可能性があります。また、プローブを用いて組織切片をインキュベートする前に、後者が95にゆでする必要があります いずれかを展開するためにCを°二次構造。
一晩インキュベートした後、非特異的結合を低減するためのプロトコルで上記温度でSSCの濃度を変化させて洗浄することが重要です。蛍光の開発のために、少なくとも1時間のための基板との組織切片をインキュベートします。乱開発を防止することができるように、インキュベーション全体のセクションを観察することをお勧めします。キットに付属の取り付けメディアのセクションをマウントしてください。
1を考慮して取るべき1制限要因があります。標的miRNAの発現は、組織内の小さい場合には、この技術を用いてその発現を検出することは困難であろう。技術が確認することができ、全ての試薬が作業するようにし、彼らは自由のRNaseされているので、このようなU6などのポジティブコントロールでこのプロトコルを実行するために、常にお勧めします。
弱い符号の場合には代わりにDIG標識プローブのビオチン標識プローブを使用することが可能ですDIGとアルは、標識プローブ。信号増幅はビオチン - アビジン系を用いることにより可能です。アビジンは、ビオチンに対する強い親和性を有します。この親和性を利用して、アルカリホスファターゼで取り付けているアビジン - ビオチンデュプレックスとビオチンプローブをタグ付けすることが可能です。この戦略を用いることにより、同様に低い豊富なmiRNAのための信号を増幅することができます。
miRNAは、キー細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすと強く癌発生にリンクされているので、miRNAの分野は急速に、浮上しています。さらに、これらのmiRNAは、癌診断におけるバイオマーカーとして使用することができます。いくつかの研究は、このような癌の予後におけるmiRNA発現の可能なアプリケーションを示唆している腫瘍段階として、miRNAの発現と臨床パラメーターとの間に強い相関を示しています。この技術はまた、他の癌タイプにおけるmiRNA発現分析のために使用することができます。例えば、のmiR-182及びmiR-503の発現は、Si中の使用結腸癌患者組織において分析しました。TUハイブリダイゼーション15。
従来の遺伝子発現解析は、組織におけるmiRNA発現レベルを明らかにすることができるが、それは、miRNAが発現されている構造の位置を明らかにすることができません。この技術を用いて、一方が容易にmiRNA発現レベルならびに場所を見つけることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
