Abstract
与小分子药物的发现，筛选肽激动剂要求的肽，以产生浓度 - 响应曲线的连续稀释。筛选的肽，得到复杂的附加层作为常规的基于针尖 - 样品处理方法暴露肽塑料制品的一个大的表面面积，提供用于通过吸附肽损失增加的机会。防止过度暴露于塑料制品通过加入塑料降低肽损失，因而在效价的预测最小误差，我们先前已经描述了非接触式的声学分配用于肽激动剂1的体外高通量筛选的好处。这里我们讨论了在利用在小鼠胰高血糖素样肽1受体（GLP-1R）筛选肽激动剂的例子中微滴定板的肽系列稀释的非接触声学制备一个完全集成的自动化解决方案。我们的方法允许高-throughput细胞为基础的分析来筛选激动剂，很容易扩展到支持增加的样品通量，或允许检测板拷贝数量增加（ 例如 ，对于更多的靶细胞系面板）。
Introduction
针对GLP-1R是2型糖尿病2的治疗已建立的药物靶标。对于该受体的天然肽激动剂，GLP-1，具有2-3分钟3 的体内半衰期。 GLP-1的其G蛋白偶联靶受体的结果在下游生产通过天然G蛋白偶联的第二信使cAMP对腺苷酸环化酶的活化的结合。累积的cAMP测量提供了可靠的测定法来监测受体激活和筛选活性GLP-1类似物与优选的物理化学性质。这样的测定需要测试样品的连续稀释来构建浓度 - 响应曲线，而这移交肽样品时，是特别复杂。从基于尖连续稀释准备的潜在错误先前已经1,4,5描述。肽将吸附到塑料制品，造成不可靠的效力的估计。肽损失，可以通过T为最小化他纳入缓冲器牛血清白蛋白（BSA）和使用硅化塑料制品的，但蛋白质结合的仍无法预测。特别是，在实验容器GLP-1的结合的变体已经描述6。有在实验室塑料制品中使用可从提示和微量滴定板成水测定缓冲液浸出，并与蛋白质功能7,8干扰该稳定剂进一步复杂化。因此，方法，以减少暴露于塑料制品是必要的，以增加测量的准确度。
声学液体分配器集中的高频声信号到流体样品的表面上，从而导致在精确纳升液滴喷射到相邻测定板9。利用声学弹射的是制药行业的准备和大量的合成化合物库的筛选标准，而且技术已经很好的验证了小moleculES 10。据我们所知，我们是来形容声配药重组和合成肽的制备第一组和我们先前已经报道了更高的精度比传统的基于技巧的方法1。
本文介绍了在完全自动化的处理板的机器人系统由非接触式声学传递肽序列和直接稀释配制的整合。许多围绕样本声传输方法先前已被描述11。我们利用两步法来制备中间库存浓度和以串行稀释肽类似物为全剂量反应曲线的产生。制备的肽温育的细胞表达靶小鼠GLP-1R，并且我们使用市售均相时间分辨荧光（HTRF）测定法来测量这些细胞中的cAMP积累作为肽激动剂ACTIV的读出性。该测定是健壮和适合于高通量384孔格式和常规应用到分析开发和药物筛选项目12。
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Protocol
1.肽序列稀释
- 制备测定缓冲液：汉克斯缓冲补充有25mM的HEPES，0.1％BSA和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），pH 7.4的盐溶液（HBSS）。
- 使用批量试剂分配器5微升测定缓冲液系统添加到每个孔5 384孔低体积试验平板。
- 使用内部软件以5微升体积除一个384孔平板的每一个以及每个制造商的说明建立的分配程序。
- 沉浸在分析缓冲液和总理点胶盒管。
- 放置384孔板载体上的低体积试验板。
- 按开始。
- 冲淡一切肽样品，无论存储车辆，在测定缓冲液产生100倍的股票肽。
注意：需要筛选肽可在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或二甲基亚砜（DMSO），为被认为适当的（如，DMSO瓦特提供病有与二级修饰如聚乙二醇化）的肽具有有害影响。 - 免除25微升100X肽股成列的声学合格384孔微孔板聚丙烯1-5。该板指定“源板”。确保源板，而不是目的板，是平底，并符合特定声公差由电声乐器的制造商定义。
- 免除25微升100X参考控制入井A23和源板A的A24
- 将10微升检测缓冲液到列11-15和30微升检测缓冲液到源盘A的21-22列
- 将10微升分析缓冲液为列6-10和16-20列第二声学合格的384孔微孔板聚丙烯的。该板指定“源板B'。
- 离心机源板A和B在300 XG 1分钟。包括适当的平衡板。
- 使用声fluið分配器集成到自动化机器人系统，制备三个顺序1：从第1列中的源A的100倍的肽股100中间稀释液（在测定缓冲液）
注：编程需要重新格式化板和（由声学流体分配器的制造商提供）剂量反应软件允许源A和源B（参见图1板布局）之间的三声传输。步骤1.9特性的细节运用在受自动机械手控制这个实验室使用的液体分配器（见材料表 ）：- 载源板和检测板成机器人的板酒店部分。
- 开放式自动化机器人的软件和负载板格式化和剂量反应程序扩展协议。点击“运行”。
注：自动化指示声流体分配器从源头板列1-5转移250 NL到源盘B 6-10列和第二ACOUSTIç流体分配器能够处理更大的液体体积与15微升分析缓冲液混合回填。然后自动化源盘B传送到集成离心机在300 XG 1分钟离心机（一种适当的平衡板是包括所有的离心步骤）。源板B被返回到声学流体分配器250 NL的转移从源盘B的6-10列到源板A的11-15列和用15微升测定缓冲回填混合。自动化传输源板，以集成离心机在300 XG 1分钟离心机。然后源板A被返回到声学流体分配器250 NL的转移从源盘A的11-15列到源盘B的16-20列和用15微升测定缓冲回填混合。自动化然后在300 XG 1分钟源盘B传送到集成离心机和离心机。
注：最后剂量响应协议指示声学分配传送从各4连续稀释源板孔中所需的体积（在源板A和源盘B两者）来构造在测定板一式两份的完整的11点曲线（预填充有5微升测定缓冲液在上面的步骤1.2 ）。自动化转移测定板，以集成离心机和离心机在300×g离心1分钟。
2.细胞的制备
- 在20毫升测定缓冲液37ºC水浴悬浮迅速表达靶小鼠GLP-1受体解冻冷冻保存的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
- 离心细胞悬浮液，在室温下（RT）200 xg离心5分钟。包括适当的平衡。
- 弃上清，重悬在10毫升分析缓冲液细胞沉淀。
- 稀释细胞库存1:1台盼蓝和使用自动细胞计数器测定活细胞密度。悬浮细胞以每毫升1.6×10 6个细胞测定缓冲液（相当于每逢8000细胞测定板的1）。
- 使用批量试剂分配器5微升细胞悬液加入到测定板（含于5μl测定缓冲液连续稀释的肽）的每个孔中，并孵育在室温30分钟。
3. HTRF cAMP的检测分析
- 带来HTRF cAMP测定试剂盒RT下在使用前30分钟。
- 准备每个HTRF试剂（穴和D2）分别在裂解液1:20稀释（专利配方，通过cAMP的检测化验的制造商提供）。
注意：注意：裂解液中含有氟化钾（KF），这是有毒的致畸胎13。有关处理，含有KF检测板应密封并焚烧，任何液体废物处置，必须顺着水槽之前，稀释<1 mmol / L的水。 - 使用批量试剂分配器5微升穴试剂加入到测定板的所有孔中。
- 使用批量试剂分配器5微升D2试剂加入到柱纳秒测定板1-22。
- 立即手动移液5微升裂解缓冲液进入测定板的孔A23-D24，得到非特异性结合（NSB）对照孔，和5μld2的试剂的成孔E23-P24。
- 离心机检测板1分钟，在室温200 XG混合井。
- 覆盖试验板，以减少蒸发和光致漂白，并在室温孵育1小时。
- 用在320nm处激发和发射在620nm，并使用板读数器665纳米测量荧光共振能量转移（FRET）信号。
4.数据分析
- 使用平均NSB从所有孔减去背景。
- 从665纳米/ 620纳米比率计算Δ％˚F如下：
比率=（A 665nm / A 620nm处 ）×10 4
三角洲F =（（采样率-比NSB）/比例NSB））×100
其中，比例NSB =没有D2试剂孔。 - 计算％ACTIVAT未刺激的细胞与细胞之间的离子与最大GLP-1的配体刺激的如下：
％活化=（Δ％FSAMPLE - ％DeltaFunstimulated细胞）/（％DeltaFGLP-1刺激的细胞 - ％DeltaF未刺激细胞）×100 - 通过参考控制1所限定分析通过4参数后勤分析;图作为％活化浓度-响应曲线。
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Representative Results
我们经常使用两步法通过声传递稀释肽。用于第一步骤中，用自动化对准的声学分配装置被用来创建四个库存肽跨两个源板中间稀释液（ 图1a，b） 中 。对于第二个步骤中，我们使用的声分配器从源板A和B，以进一步稀释库存稀释创建为每个测试肽（ 图1c）11点浓度范围。每种肽的浓度范围是在重复烧制，左跨越测定板权利，允许16个不同的肽，以每384孔测定板（ 图1c）进行筛选。进行测定缓冲回填，以确保每个孔的恒定体积在整个测定板（ 图1d）。参考肽阳性对照也以最大有效浓度转移到目的地板。
耳鼻喉科“FO：保持-together.within页=”1“>将板用荧光板读数器，以及用于容纳在重复16的肽，例如板的热图中示出（ 图2a）读所用的的cAMP积累测定法是一个倒置的竞争测定法，从而低的值（示为紫色）代表的的cAMP。高浓度时的数据表示为浓度-反应曲线重复点的再现性是明显的（ 图2b）。试样1（行A， 图2a）表示用于测定的阳性对照。样品2，3和4（行B，C和D分别图2a）均无效，等同于图2b平面的行。样品5-16（行E至P）表示活性测试的肽。该方法允许对在广泛的效力范围完整的浓度 - 响应曲线的生成。流程图，详细说明了整个工作流程中显示 
图1：板布局声学分配连续稀释法的描述。 （A，B）384孔源板A的布局与含有25微升的100×储备浓度的每种肽（例如具有每源板80的肽可能），100×阳性对照，测定缓冲液只井回填B和了三片1：按来源板之间的自动声学传递和准备回填各个肽的100系列稀释。 （c）一个单一的测定板布局表示在横跨板重复16肽的11点浓度范围。 （ 四 ）在10微升最终测定体积的11点的浓度范围内典型的分配协议。所有目的地井具有测定缓冲回填以提供恒定的最终转印沃 100 NL每lume明好。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图2：热图和剂量反应曲线热图显示了在A665处的荧光。 （ 一 ）11点的浓度范围为横跨板重复16的肽。紫指示营地（最大值）的高浓度，红色表示的环磷酸腺苷（分）低浓度。 （ 二 ）由出对小鼠GLP-1R表达细胞（16个化合物），范围为GLP-1受体激动剂肽活动的单一平板测定代表肽浓度-响应曲线。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图3：。整个工作流程的筛选过程详细的流程图 ，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述自动声学分配的成功应用到在3×10 6个要求小于1微升样品的浓度范围连续稀释的肽样品。这种方法的主要优点是通过经由还原样品暴露于所通常所需的试剂转移和混合试验容器和塑料制品（如枪头）最小化的肽吸附到塑料制品，以提高数据质量。虽然声学分配不能完全排除使用塑料制品的，它确实显著酌减。此外，消除基于尖部-移液还消除了样品的交叉污染，和错误不会在整个系列稀释传播，从而允许浓度-反应曲线14,15的可靠和可重复的准备。
其他团体已报道溶解在DMSO中至试验化合物的直接声传输细胞长期测定（> 48小时）随着时间的推移16,17比测定板并孵育反转其他不需要混合步骤。 DMSO是极性高并且是更适合于具有比必须准备并存储在PBS生物样品的水溶液混合。因此，采用一种自动化的方法为肽样品的声传输时，我们采用附加回填和离心步骤，以确保彻底混合，从而允许精确的样品连续稀释。我们的经验表明，单独离心不足以确保水样的完全混合，因此，一个“湿转印'方法的开发，包括声传输的成水性缓冲液的现有10微升体积，随后的15微升回填同样的水缓冲。这是不可能的火肽成干源板，然后回填土因为人们可能为小分子，如肽水溶液将迅速EVAporate和肽会不可逆地吸附到干燥的塑料板。虽然没有帮助水样混合，仍然需要离心，以确保声传递的水平样本半月板。多重中间转印，回填离心步骤列入消耗是有些时候，虽然比不上手工编写大量的样品，并采用自动化的无人监管允许的吞吐量。其他人报告手动化合物在96-孔板17混合的需要。这里，我们已经完全自动化的过程中，除去人工干预的需要，当使用DMSO是不可能的。仪器和耗材的成本会限制在某些环境中使用这种工艺。如果是这样的情况下，建议基于针尖连续稀释总是在DMSO进行，如果试验样品的性质适合于本（ 例如，合成肽）。如果样品不能用DMSO进行处理（ 例如，聚乙二醇化肽）应谨慎解释效力数据时使用，因为我们先前已经显示增加的BSA浓度将不能完全防止吸附1甚至列入。
声，尖少传输具有与测定的小型化是必不可少的，如果样本是稀缺/有限，这是常有用于动物或人的生物样品的情况下额外的益处，并且我们先前描述的潜在减少动物的样品导致的体积每1研究较少的动物的要求。重要的是要记住，肽生物样本，并应当在这样的处理是很重要的;为了保持其完整性重复冻融应当避免。生物制剂是新的治疗的一个快速增长的领域，并提供了对肽的制备自动化高通量方法可以容易地应用于其它生物剂，包括重组蛋白和抗体。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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