Abstract
Al igual que con el descubrimiento de fármacos pequeña molécula, el cribado de agonistas de péptidos requiere la dilución en serie de péptidos para producir curvas de concentración-respuesta. Screening péptidos proporciona una capa adicional de complejidad como los métodos de manipulación de muestra basada en la punta convencionales exponen péptidos a una gran superficie de material de plástico, proporcionando una mayor oportunidad para la pérdida de péptido a través de la adsorción. La prevención de la exposición excesiva a recipientes de plástico reduce la pérdida de péptido a través de la adhesión a los plásticos y por lo tanto minimiza las imprecisiones en la predicción de la potencia, y se han descrito anteriormente los beneficios de la acústica de no contacto de dispensación para cribado de alto rendimiento in vitro de agonistas de péptido 1. Aquí hablamos de una solución de automatización totalmente integrado para la preparación de no contacto acústico de diluciones en serie de péptidos en placas de microtitulación utilizando el ejemplo de la detección de agonistas peptídicos en el péptido similar al glucagón-1 receptor de ratón (GLP-1R). Nuestros métodos permiten altaLos ensayos para la detección de agonistas -throughput basados en células y son fácilmente escalable para soportar el aumento de rendimiento de la muestra, o para permitir el aumento del número de copias placa de ensayo (por ejemplo, para un panel de más líneas de células diana).
Introduction
El GLP-1R es una diana de fármaco establecido en el tratamiento de la diabetes tipo 2 2. El agonista de péptido nativo para este receptor, GLP-1, tiene una in vivo la vida media de 2 a 3 min 3. La unión de GLP-1 a sus acoplados a proteínas G resultados receptor diana en la producción corriente abajo de la segunda mensajero AMPc a través de acoplamiento nativo proteína G a la activación de la adenilato ciclasa. La medición de la cAMP acumulado proporciona un sólido ensayo para controlar la activación del receptor y para la detección de activos análogos de GLP-1 con propiedades físico-químicas preferidas. un ensayo de este tipo requiere la dilución en serie de muestras de ensayo para construir las curvas de concentración-respuesta, y esto es particularmente complicada cuando se entrega muestras de péptidos. Los errores potenciales de preparación de la dilución en serie basada en la punta se han descrito anteriormente 1,4,5. Los péptidos se adsorben a recipientes de plástico, lo que resulta en estimaciones de potencia poco fiables. pérdida de péptido puede ser minimizado a través de tque la inclusión de la albúmina de suero bovino (BSA) en tampones y el uso de recipientes de plástico siliconado, sin embargo, la proteína de unión sigue siendo impredecible. En particular, la variación en la unión de GLP-1 a recipientes experimentales se ha descrito 6. Existe una complicación adicional en la que los agentes de estabilización utilizados en recipientes de plástico de laboratorio pueden filtrarse desde las puntas y las placas de microtitulación en tampones de ensayo acuosas e interferir con la función de la proteína 7, 8. Por lo tanto, los métodos para reducir la exposición a los recipientes de plástico son necesarios para aumentar la precisión de las mediciones.
Dispensadores de líquido acústicos centran una señal acústica de alta frecuencia sobre la superficie de una muestra de fluido, dando como resultado la expulsión de gotitas de nanolitros precisas en una placa de ensayo adyacente 9. El uso de eyección acústica es estándar en la industria farmacéutica para la preparación y selección de grandes bibliotecas de compuestos sintéticos, y la tecnología ha sido bien validado para pequeñas moleculES 10. Hasta donde sabemos, somos el primer grupo de distribución para describir acústica para la preparación de péptidos recombinantes y sintéticos y hemos informado anteriormente de la exactitud mejorada en comparación con los métodos convencionales basados en la punta 1.
En este artículo se describe la integración de la preparación de diluciones en serie de péptidos y directos por transferencia acústica sin contacto sobre una placa de manipulación robótica sistema totalmente automatizado. Una serie de métodos que comprenden la transferencia acústica de las muestras se han descrito anteriormente 11. Utilizamos un método de dos etapas para preparar las concentraciones de valores intermedios y para diluir en serie análogos de péptidos para la generación de la curva dosis-respuesta completa. Los péptidos preparados se incuban con las células que expresan el ratón diana GLP-1R, y que utilizan un ensayo disponible comercialmente homogénea de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF) para medir la acumulación de cAMP dentro de estas células como una lectura de activ agonistas peptídicosdad. El ensayo es robusto y es susceptible de un alto rendimiento formato de 384 pocillos y se aplica de forma rutinaria tanto para el desarrollo y ensayo de detección de drogas proyecta 12.
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Protocol
1. Péptido dilución en serie
- Preparar tampón de ensayo: solución salina tamponada Hanks (HBSS) suplementado con HEPES 25 mM, 0,1% de BSA y 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4.
- Utilice un dispensador de reactivos a granel para añadir sistemáticamente 5 l de tampón de ensayo a cada pocillo de cinco placas de 384 pocillos de bajo volumen de ensayo.
- Utilice el software interno para crear un programa de dispensación para 5 l volumen de adición a cada pocillo de una placa de 384 pocillos según las instrucciones del fabricante.
- Sumergir los tubos de distribución de cassette en tampón de ensayo y líquido primordial.
- Coloque 384 pocillos placa de ensayo de bajo volumen en la placa portadora.
- Presiona inicio.
- Diluir todas las muestras de péptidos, independientemente de vehículo de almacenamiento, en tampón de ensayo para producir un péptido de stock 100x.
NOTA: Los péptidos que requieren la detección pueden proporcionarse en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o sulfóxido de dimetilo (DMSO) como se considere apropiado (por ejemplo, DMSO wlos malos tienen un efecto perjudicial sobre los péptidos con modificaciones secundarias como PEGilación). - Prescindir de 25 l poblaciones de péptidos en columnas 1-5 100x de una microplaca acústicamente cualificado polipropileno de 384 pocillos. Esta placa se designa "fuente placa A '. Asegurar que las placas de origen, pero no placas de destino, son de fondo plano y cumplen con las tolerancias acústicas específicas definidas por el fabricante de los instrumentos acústicos.
- Prescindir de control de referencia 100x 25 l en pocillos A23 y A24 de la placa de fuente de A.
- Dispensar tampón de ensayo 10 l en columnas 11-15 y tampón de ensayo de 30 l en columnas 21-22 de la placa de fuente de A.
- Dispensar tampón de ensayo 10 l en columnas 6-10 y 16-20 columnas de una segunda acústicamente cualificada de 384 pocillos de microplacas de polipropileno. Esta placa se designa 'placa de la fuente B'.
- Centrífuga de placas de fuente A y B a 300 xg durante 1 min. Incluir una placa equilibrio adecuado.
- Utilice FLUI acústicad dispensadores integrados en un sistema robótico automatizado para preparar tres secuenciales 1: 100 diluciones intermedias (en tampón de ensayo) de las poblaciones de péptidos 100x de la columna 1 en la fuente de A.
NOTA: La programación requiere el software de respuesta a la dosis (facilitada por el fabricante del dispensador de fluido acústico) cambio de formato de placa y permitir tres transferencias acústicas entre los orígenes A y B (véase la Figura 1 para los diseños de placa). Paso 1.9 detalles específicamente el uso de dispensadores de líquidos que se emplean en este laboratorio bajo control robótico automatizado (véase la Tabla de Materiales):- placas de origen de carga y placas de ensayo en placa de sección del hotel de la robótica.
- Abra el software automatizado robótica y la carga cambio de formato de placa y protocolos de expansión programa de respuesta a la dosis. Haga clic en "Ejecutar".
NOTA: Automatización instruye a un dispensador de fluido acústico para transferir 250 nl de las columnas 1-5 de la placa de la fuente A en columnas 6-10 de la placa de la fuente B, y un segundo acoustic dispensador de fluido capaz de manejar grandes volúmenes de fluido para rellenar con tampón de ensayo 15 l para mezclar. Automatización luego transfiere la placa de la fuente B de centrífuga y centrifugadoras a 300 xg durante 1 min integrado (una placa equilibrio apropiado en favor de todas las etapas de centrifugación). placa de la fuente B es devuelto a la distribución de productos fluidos acústico para la transferencia de 250 nl de columnas 6-10 de fuente de la placa B en columnas 11-15 de la placa de la fuente A y el relleno con tampón de ensayo de 15 l para mezclar. Automation fuente transferencias placa de la A a la centrifugadora y centrifugadoras en 300 xg durante 1 min integrado. Una placa de fuente se devuelve a la distribución de productos fluidos acústico para la transferencia de 250 nl de columnas 11-15 de la placa de la fuente A en columnas 16-20 de fuente de la placa B y el relleno con tampón de ensayo de 15 l para mezclar. Automatización luego transfiere la placa de la fuente B de centrífuga y centrifugadoras integrado a 300 xg durante 1 min.
NOTA: Por último, el protocolo de respuesta a la dosis de dispensación dirige acústico para transferirel volumen requerido de cada uno de los 4 pocillos de la placa fuente diluidas en serie (tanto en la placa de la fuente A y la placa de la fuente B) para construir una curva de 11 puntos completa por duplicado en placas de ensayo (pre-llenado con tampón de ensayo de 5 l en el paso 1.2 anterior ). las transferencias de automatización placa de ensayo a centrífuga integrada y centrífugas a 300 xg durante 1 min.
2. Preparación de la célula
- Descongelar las células criopreservadas de ovario de hámster chino (CHO) que expresan el receptor de ratón objetivo GLP-1 rápidamente en un baño de 37 ºC agua y resuspender en tampón de ensayo de 20 ml.
- suspensión de células Centrifugar durante 5 min a 200 xg a temperatura ambiente (RT). Incluir un equilibrio adecuado.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en tampón de ensayo de 10 ml.
- Diluir celular stock 1: 1 en Trypan azul y determinar la densidad de células viables utilizando un contador de células automatizado. Resuspender las células en tampón de ensayo a 1,6 x 10 6 células por ml (equivalentes a 8.000 células por well de placas de ensayo).
- Utilice un dispensador de reactivos a granel a añadir 5 l de suspensión celular a cada pocillo de las placas de ensayo (que contienen péptidos diluidos en serie en tampón de ensayo 5 l) y se incuba a TA durante 30 min.
3. Ensayo HTRF detección de cAMP
- Llevar kit de ensayo de cAMP HTRF a TA durante 30 min antes de su uso.
- Preparar cada reactivo HTRF (criptato y d2) por separado a una dilución 1:20 en tampón de lisis (formulación patentada, proporcionado por el fabricante del ensayo de detección de cAMP).
NOTA: PRECAUCIÓN: Tampón de lisis contiene fluoruro de potasio (KF) que es tóxico y un teratógeno 13. Para su eliminación, las placas de ensayo que contienen KF deben ser selladas e incinerados, y los residuos líquidos que deben diluirse a <1 mmol / l con agua antes de su eliminación por el desagüe. - Utilice un dispensador de reactivos a granel para agregar reactivo criptato de 5 l a todos los pocillos de las placas de ensayo.
- Utilice un dispensador de reactivos a granel para agregar reactivo d2 5 l de Columns 1-22 de las placas de ensayo.
- Inmediatamente pipetear manualmente tampón de lisis 5 l en pocillos A23-D24 de las placas de ensayo para dar la unión no específica pocillos de control (NSB), y 5 l de reactivo en los pocillos d2 E23-P24.
- Centrifugar las placas de ensayo durante 1 min a 200 xg a temperatura ambiente para mezclar los pozos.
- Cubrir las placas de ensayo para minimizar la evaporación y foto-blanqueo y se incuba a RT durante 1 hr.
- Medir la señal de fluorescencia de transferencia de energía de resonancia (FRET) usando excitación a 320 nm y emisión a 620 nm y 665 nm usando un lector de placas.
Análisis 4. Datos
- Utilice significar NSB para restar el fondo de todos los pocillos.
- Calcular el% de Delta F de la relación nm 665 nm / 620 como sigue:
Ratio = (A 665 nm / 620 nm A) x 10 4
Delta F = ((Relación de la muestra - Relación de NSB) / Relación de NSB)) x 100
donde Relación de NSB = pocillos sin reactivo d2. - Calcular el% de activatde iones entre las células no estimuladas y células estimuladas con la máxima GLP-1 ligando como sigue:
la activación% = (% Delta Fsample - células DeltaFunstimulated%) / (% de células DeltaFGLP-1 estimulada -% de células no estimuladas DeltaF) x 100 - Analizar las curvas de concentración-respuesta mediante análisis logístico de 4 parámetros, y en el gráfico como la activación% como se define por control de referencia 1.
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Representative Results
Como rutina usamos un método de dos pasos para diluir los péptidos a través de transferencia acústica. Para el primer paso, un distribuidor acústico alineado con la automatización se utiliza para crear cuatro diluciones intermedias de stock de péptidos a través de dos placas de origen (Figura 1a, b). Para la segunda etapa, se utiliza un distribuidor acústico para diluir aún más diluciones del stock de placas de fuente A y B para crear un intervalo de concentración de 11 puntos para cada péptido de ensayo (Figura 1c). Cada intervalo de concentraciones de péptido es despedido por duplicado, de izquierda a derecha a través de la placa de ensayo, permitiendo 16 péptidos diferentes para ser examinados por cada 384 pocillos placa de ensayo (Figura 1c). Relleno tampón de ensayo se lleva a cabo para garantizar un volumen constante por pozo a través de la placa de ensayo (Figura 1d). controles positivos péptido de referencia también se transfieren a placas de destino a una concentración máxima efectiva.
ent. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Las placas se leen utilizando un lector de placas fluorescente, y un mapa de calor para una placa de ejemplo que contiene 16 péptidos por duplicado se muestra (Figura 2a) El ensayo de acumulación de cAMP usado es un ensayo invertida competencia, valores así bajas (que se muestra como púrpura) representan una alta concentración de cAMP. Reproducibilidad de puntos duplicados es evidente cuando los datos se expresaron como curvas de concentración-respuesta (Figura 2b). muestra 1 (fila a, figura 2a) representa un control positivo para el ensayo. las muestras 2, 3 y 4 (líneas B, C y D, respectivamente, la figura 2a) estaban inactivos y equivalen a las líneas planas en la Figura 2b. muestras 5-16 (filas e a P) representan activos péptidos de ensayo. el método permite la generación de curvas de concentración-respuesta completa a través de una gama amplia potencia. Un diagrama de flujo que detalla todo el flujo de trabajo se muestra en la 
Figura 1:. Trazados de plancha Descripción de la acústica de dispensación método de dilución en serie. (A, b) Disposición de un 384 pocillos placas de fuente A y B que contiene 25 l de 100x concentración de reserva de cada péptido (por ejemplo, con 80 péptidos posibles por placa fuente), 100x control positivo, tampón de ensayo sólo para pozos de relleno, y tres 1: 100 diluciones en serie de cada péptido preparado por transferencia acústica automatizado y relleno entre ambas placas de origen. (C) Un diseño de una sola placa de ensayo que muestra el rango de concentración de 11 puntos por 16 péptidos en doble ejemplar en toda la placa. (D) el protocolo de dispensación típico para un intervalo de concentraciones de 11 puntos en un volumen final de ensayo l 10. Todos los pozos de destino tienen un relleno tampón de ensayo para proporcionar una transferencia vo final constante lume de 100 nl así. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2: Mapa de Calor y curvas de dosis-respuesta de mapa de calor que muestra fluorescencia a A665 nm.. (A) intervalo de concentración de 11 puntos por 16 péptidos en doble ejemplar en toda la placa. Púrpura indica una alta concentración de cAMP (max), el rojo indica una baja concentración de cAMP (min). (B) Curvas de péptido Representante de concentración-respuesta a partir de un único ensayo de placa que muestra una serie de actividades de péptido agonista del receptor de GLP-1 de ratón contra el GLP-1R células (16 compuestos) que expresa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3:.. Diagrama de flujo del proceso de la proyección Detalle de todo el flujo de trabajo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe la aplicación exitosa de dispensación acústico automatizado para diluir en serie muestras de péptidos en un rango de concentración de 3 x 10 6 que requiere menos de 1 l de muestra. La principal ventaja de este método es aumentar la calidad de los datos a través de minimizar la adsorción de péptido a recipientes de plástico a través de una menor exposición de las muestras a los contenedores experimentales y recipientes de plástico (por ejemplo, puntas de pipeta) que normalmente se requieren para la transferencia de reactivo y mezcla. Mientras dispensación acústica no descarta por completo el uso de recipientes de plástico, lo que reduce de forma significativa. Además, la eliminación de pipeteado a base de punta también elimina el arrastre de la muestra, y los errores no se propagan a lo largo de toda la dilución en serie, lo que permite tanto la preparación fiable y reproducible de las curvas de concentración-respuesta 14,15.
Otros grupos han informado de la transferencia acústica directa de los compuestos de ensayo se solubilizaron en DMSO paracélulas para los ensayos a largo plazo (> 48 h) sin etapas de mezclado requeridos aparte de inversión de la placa de ensayo e incubación con el tiempo 16,17. DMSO es altamente polar y es mucho más susceptible a la mezcla con soluciones acuosas que las muestras biológicas que deben ser preparados y almacenados en PBS. Por lo tanto, al adoptar un método automatizado para la transferencia acústica de muestras de péptidos, hemos empleado etapas adicionales de relleno y centrifugación para asegurar una mezcla a fondo, lo que permite la dilución en serie de la muestra precisa. Nuestra experiencia demuestra que la centrifugación por sí sola no es suficiente para asegurar la mezcla completa de muestras acuosas, y por lo tanto, un método de "transferencia en húmedo 'fue desarrollado que consiste de transferencia acústica en un volumen de 10 l existente de tampón acuoso, seguido por un relleno 15 l de la mismo tampón acuoso. No es posible disparar péptidos en una placa de fuente seco y después se llena de nuevo como una fuerza para moléculas pequeñas, como la solución acuosa de péptidos hará rápidamente evacor- y el péptido irreversiblemente adsorber a la placa de plástico seca. Aunque no ayudar a la mezcla de muestras acuosas, todavía se requiere centrifugación para asegurar un menisco muestra de nivel para la transferencia acústica. La inclusión de múltiples pasos de transferencia intermedia, de relleno y de centrifugación es un poco de tiempo, aunque menos que la preparación manual de un gran número de muestras, y el uso de la automatización permite rendimiento sin supervisión. Otros han informado de la necesidad para el compuesto manual de la mezcla en placas de 96 pocillos 17. Aquí hemos totalmente automatizado el proceso y eliminado la necesidad de intervención manual cuando el uso de DMSO no es posible. El costo de la instrumentación y consumibles limitará el uso de este proceso en algunos entornos. Si este es el caso, se recomienda diluciones en serie basada en la punta siempre se realizan en DMSO si la naturaleza de la muestra de ensayo es susceptible de esto (por ejemplo, péptidos sintéticos). Si las muestras no pueden ser tratados con DMSO (por ejemplo,Péptidos pegilado) Se debe tener precaución en la interpretación de los datos de potencia, ya que hemos demostrado anteriormente, incluso la inclusión de concentraciones crecientes de BSA no evitará por completo de adsorción 1.
Acústica, la transferencia de punta-menos tiene beneficios adicionales en relación con la miniaturización de ensayo que es esencial si las muestras son escasos / finita como es a menudo el caso de muestras biológicas de origen humano o animal, y hemos descrito previamente la posibilidad de reducir el volumen de muestras de animales con el que un requisito para un menor número de animales por el estudio 1. Es importante recordar que los péptidos son muestras biológicas y deben manejarse como tal; con el fin de mantener sus ciclos de congelación y descongelación repetidas integridad debe ser evitado. Los biológicos es un área de rápido crecimiento de nuevas terapias, y nuestro método de alto rendimiento automatizado para la preparación de péptidos se puede aplicar fácilmente a otros agentes biológicos, incluyendo proteínas y anticuerpos recombinantes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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