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Biochemistry

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54542
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Cardiovascular & Metabolic Disease, MedImmune, 2Lab Automation and Support, MedImmune

Abstract

छोटे अणु दवाओं की खोज के साथ के रूप में, पेप्टाइड एगोनिस्ट के लिए स्क्रीनिंग पेप्टाइड्स एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता उत्पादन के धारावाहिक कमजोर पड़ने की आवश्यकता है। पेप्टाइड्स स्क्रीनिंग जटिलता के एक अतिरिक्त परत पारंपरिक टिप-आधारित नमूना तरीके से निपटने plasticware के एक बड़े सतह क्षेत्र के लिए पेप्टाइड्स पर्दाफाश के रूप में, सोखना के माध्यम से पेप्टाइड नुकसान के लिए एक वृद्धि का अवसर प्रदान करने देता है। Plasticware को अत्यधिक जोखिम की रोकथाम प्लास्टिक के पालन के माध्यम से पेप्टाइड नुकसान को कम कर देता है और इस तरह शक्ति भविष्यवाणी में अशुद्धियों को कम करता है, और हम पहले से गैर संपर्क ध्वनिक पेप्टाइड एगोनिस्ट 1 की इन विट्रो उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए वितरण के लाभों का वर्णन किया है। यहाँ हम माउस ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड -1 रिसेप्टर (जीएलपी -1 R) पर पेप्टाइड एगोनिस्ट के लिए स्क्रीनिंग के उदाहरण का उपयोग microtiter प्लेटों में पेप्टाइड धारावाहिक dilutions की गैर संपर्क ध्वनिक तैयारी के लिए एक पूरी तरह से एकीकृत स्वचालन समाधान पर चर्चा की। हमारे तरीके उच्च के लिए अनुमति-throughput सेल आधारित एगोनिस्ट के लिए स्क्रीन करने के लिए assays और आसानी से वृद्धि हुई throughput नमूना समर्थन करने के लिए, या (अधिक लक्ष्य सेल लाइनों के एक पैनल के लिए, उदाहरण के लिए) परख थाली प्रतियों की बढ़ी संख्या के लिए अनुमति देने के लिए स्केलेबल हैं।

Introduction

जीएलपी -1 R टाइप 2 मधुमेह के उपचार 2 में एक स्थापित दवा लक्ष्य है। इस रिसेप्टर के लिए देशी पेप्टाइड एगोनिस्ट, जीएलपी -1, 2-3 मिनट 3 के एक विवो आधा जीवन है। adenylyl साइक्लेज की सक्रियता के लिए देशी जी प्रोटीन युग्मन के माध्यम से दूसरा दूत शिविर के बहाव के उत्पादन में अपनी जी प्रोटीन युग्मित लक्ष्य रिसेप्टर परिणाम के लिए जीएलपी -1 के बंधन। संचित शिविर का मापन एक मजबूत परख रिसेप्टर सक्रियण पर नजर रखने के लिए और सक्रिय जीएलपी -1 वरीय भौतिक गुणों के साथ analogues के लिए स्क्रीन के लिए प्रदान करता है। इस तरह की एक परख नमूने परीक्षण के धारावाहिक कमजोर पड़ने एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता का निर्माण करने की आवश्यकता है, और यह विशेष रूप से जटिल है जब पेप्टाइड नमूने सौंपने। टिप-आधारित धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयारी से संभावित त्रुटियों पहले 1,4,5 वर्णित किया गया है। पेप्टाइड्स plasticware को सोखना, अविश्वसनीय शक्ति अनुमानों में जिसके परिणामस्वरूप। पेप्टाइड नुकसान टी के माध्यम से कम किया जा सकतावह बफ़र्स में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और siliconized plasticware का उपयोग करते हैं, अभी तक प्रोटीन बाध्यकारी का समावेश अप्रत्याशित बनी हुई है। विशेष रूप से, प्रयोगात्मक कंटेनरों को जीएलपी -1 के बंधन में भिन्नता 6 वर्णित किया गया है। कि स्थिरीकरण एजेंटों प्रयोगशाला plasticware में इस्तेमाल सुझाव और जलीय परख बफ़र्स में microtiter प्लेटों से नमकीन पानी और प्रोटीन समारोह 7, 8 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं में एक और जटिलता नहीं है। इसलिए, तरीकों जोखिम plasticware को कम करने के लिए माप की शुद्धता बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं।

ध्वनिक तरल dispensers एक तरल पदार्थ के नमूने की सतह पर एक उच्च आवृत्ति ध्वनिक संकेत ध्यान देते हैं, एक बगल परख थाली 9 में सटीक nanoliter बूंदों के इंजेक्शन में जिसके परिणामस्वरूप। ध्वनिक इंजेक्शन के उपयोग की तैयारी और बड़ी कृत्रिम यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए दवा उद्योग में मानक है, और प्रौद्योगिकी अच्छी तरह से छोटे Molecul के लिए मान्य किया गया हैतों 10। हमारे ज्ञान करने के लिए, हम पुनः संयोजक और सिंथेटिक पेप्टाइड्स की तैयारी के लिए ध्वनिक वितरण का वर्णन करने के पहले समूह हैं और हम पहले से पारंपरिक टिप-आधारित विधियों 1 की तुलना में बेहतर सटीकता की सूचना है।

यह लेख पूरी तरह से स्वचालित प्लेट से निपटने रोबोटिक्स सिस्टम पर गैर संपर्क ध्वनिक हस्तांतरण द्वारा पेप्टाइड धारावाहिक और प्रत्यक्ष dilutions की तैयारी के एकीकरण का वर्णन है। नमूने के ध्वनिक हस्तांतरण को शामिल तरीकों की एक संख्या में पहले 11 में वर्णित किया गया है। हम एक दो कदम विधि मध्यवर्ती शेयर सांद्रता तैयार करने के लिए और क्रमानुसार पूरी खुराक प्रतिक्रिया वक्र की पीढ़ी के लिए पेप्टाइड analogues कमजोर करने के लिए उपयोग। तैयार पेप्टाइड्स कोशिकाओं को लक्षित माउस जीएलपी -1 R व्यक्त के साथ incubated रहे हैं, और हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समरूप समय हल प्रतिदीप्ति (HTRF) परख का उपयोग पेप्टाइड एगोनिस्ट activ की एक readout के रूप में इन कोशिकाओं के भीतर शिविर संचय को मापने के लिएअल्पसंख्यक। परख मजबूत और एक उच्च throughput 384 अच्छी तरह प्रारूप करने के लिए उत्तरदायी है और नियमित रूप से दोनों परख विकास के लिए आवेदन किया है और दवा स्क्रीनिंग परियोजनाओं 12 है।

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Protocol

1. पेप्टाइड धारावाहिक कमजोर पड़ने

  1. परख बफर तैयार: हैंक्स नमक समाधान (HBSS) 25 मिमी HEPES, 0.1% BSA और 0.5 मिमी 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 7.4 पीएच के साथ पूरक बफर।
  2. एक थोक अभिकर्मक निकालने की मशीन का प्रयोग व्यवस्थित पाँच 384 अच्छी तरह से कम मात्रा परख प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से परख बफर के 5 μl जोड़ने के लिए।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक 384 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से करने के लिए 5 μl मात्रा अलावा के लिए एक वितरण कार्यक्रम बनाने के लिए आंतरिक सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
    2. परख बफर और प्रधानमंत्री तरल पदार्थ में कैसेट ट्यूबिंग वितरण विसर्जित कर दिया।
    3. 384 अच्छी तरह से परख कम मात्रा प्लेट वाहक पर थाली रखें।
    4. स्टार्ट दबाएँ।
  3. सभी पेप्टाइड नमूने पतला, भंडारण वाहन की परवाह किए बिना, परख बफर में एक 100x पेप्टाइड शेयर उत्पादन करने के लिए।
    नोट: स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है पेप्टाइड्स फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के रूप में उपयुक्त समझा जाता है (जैसे, DMSO में प्रदान की जा सकती हैबीमार) ऐसे PEGylation के रूप में माध्यमिक संशोधनों के साथ पेप्टाइड्स पर एक हानिकारक प्रभाव है।
  4. कॉलम एक ध्वनिक योग्य 384 अच्छी तरह polypropylene microplate 1-5 में 25 μl 100x पेप्टाइड शेयरों में बांटना। यह प्लेट 'स्रोत प्लेट ए' नामित किया गया है। सुनिश्चित करें कि स्रोत प्लेटें, लेकिन नहीं गंतव्य प्लेटें, फ्लैट तली कर रहे हैं और जैसा कि ध्वनिक उपकरणों के निर्माता द्वारा परिभाषित विशिष्ट ध्वनिक tolerances के अनुरूप।
  5. कुओं A23 में बांटना 25 μl 100x संदर्भ नियंत्रण और स्रोत प्लेट ए के A24
  6. स्रोत प्लेट ए के कॉलम 21-22 में कॉलम 11-15 और 30 μl परख बफर में 10 μl परख बफर बांटना
  7. कॉलम 6-10 और 16-20 कॉलम एक दूसरे ध्वनिक योग्य 384 अच्छी तरह polypropylene microplate के रूप में 10 μl परख बफर बांटना। यह प्लेट नामित किया गया है 'स्रोत प्लेट बी'।
  8. अपकेंद्रित्र स्रोत प्लेटें एक और 1 मिनट के लिए 300 XG पर बी। एक उचित संतुलन थाली में शामिल हैं।
  9. ध्वनिक flui का प्रयोग करेंडी dispensers एक स्वचालित रोबोट प्रणाली में एकीकृत तीन अनुक्रमिक 1 तैयार करने के लिए: स्रोत ए में स्तंभ 1 से 100x पेप्टाइड शेयरों की 100 मध्यवर्ती dilutions (परख बफर में)
    नोट: प्रोग्रामिंग स्रोत एक और स्रोत बी (प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें) के बीच तीन ध्वनिक हस्तांतरण की अनुमति के लिए थाली reformatting और खुराक प्रतिक्रिया सॉफ्टवेयर (के रूप में ध्वनिक तरल पदार्थ निकालने की मशीन के निर्माता द्वारा प्रदान की) की आवश्यकता है। 1.9 विवरण विशेष रूप से तरल पदार्थ स्वचालित रोबोट नियंत्रण के तहत इस प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया dispensers के उपयोग कदम (देखें सामग्री तालिका):
    1. लोड स्रोत प्लेटें और रोबोटिक्स के प्लेट होटल खंड में परख प्लेटें।
    2. ओपन स्वचालित रोबोट सॉफ्टवेयर और लोड प्लेट reformatting और खुराक प्रतिक्रिया कार्यक्रम विस्तार प्रोटोकॉल। 'भागो' पर क्लिक करें।
      नोट: स्वचालन स्रोत प्लेट बी के कॉलम 6-10 में स्रोत प्लेट ए के कॉलम 1-5 से 250 nl हस्तांतरण करने के लिए एक ध्वनिक तरल पदार्थ निकालने की मशीन का निर्देश है, और एक दूसरे ACOUSTIसी तरल पदार्थ निकालने की मशीन बड़े तरल पदार्थ की मात्रा को संभालने के 15 μl परख बफर मिश्रण करने के साथ backfill करने में सक्षम है। स्वचालन तो एकीकृत सेंट्रीफ्यूज और 1 मिनट के लिए 300 XG पर सेंट्रीफ्यूज (एक उचित संतुलन की थाली सभी centrifugation कदम के लिए शामिल है) के लिए स्रोत प्लेट बी हस्तांतरण। स्रोत प्लेट बी स्रोत प्लेट बी के कॉलम 6-10 से 250 nl के हस्तांतरण के स्रोत प्लेट ए के कॉलम 11-15 में लिए ध्वनिक तरल पदार्थ निकालने की मशीन में लौटे और मिश्रण करने के लिए 15 μl परख बफर के साथ backfill है। स्वचालन स्थानान्तरण स्रोत प्लेट एकीकृत सेंट्रीफ्यूज और 1 मिनट के लिए 300 XG पर सेंट्रीफ्यूज के लिए एक। स्रोत प्लेट A तब स्रोत प्लेट ए के कॉलम 11-15 से 250 nl के हस्तांतरण के स्रोत प्लेट बी के कॉलम 16-20 में लिए ध्वनिक तरल पदार्थ निकालने की मशीन में लौटे और मिश्रण करने के लिए 15 μl परख बफर के साथ backfill है। स्वचालन तो 1 मिनट के लिए 300 XG पर एकीकृत सेंट्रीफ्यूज और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्रोत प्लेट बी हस्तांतरण।
      नोट: अंत में खुराक प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल हस्तांतरण करने के लिए ध्वनिक वितरण का निर्देशन(ऊपर 1.2 चरण में 5 μl परख बफर के साथ पहले से भरे 4 क्रमानुसार पतला स्रोत प्लेट कुओं में से प्रत्येक से आवश्यक मात्रा (दोनों स्रोत प्लेट एक और स्रोत प्लेट बी में) परख प्लेटों में दो प्रतियों में एक पूर्ण 11 सूत्री वक्र के निर्माण के लिए )। एकीकृत सेंट्रीफ्यूज के लिए ऑटोमेशन स्थानान्तरण परख प्लेट और सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए 300 XG पर।

2. सेल तैयार

  1. पिघलना cryopreserved चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो) कोशिकाओं एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और 20 मिलीलीटर परख बफर में resuspend में तेजी से लक्ष्य माउस जीएलपी -1 रिसेप्टर व्यक्त।
  2. (आरटी) कमरे के तापमान पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन। एक उचित संतुलन को शामिल करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर परख बफर में सेल गोली resuspend।
  4. पतला सेल के शेयर 1: 1 Trypan नीले रंग में और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्य सेल घनत्व का निर्धारण। मिलीलीटर प्रति 1.6 x 10 6 कोशिकाओं पर परख बफर में Resuspend कोशिकाओं (wel प्रति 8,000 कोशिकाओं के बराबरपरख प्लेटों के एल)।
  5. 30 मिनट के लिए परख प्लेट (5 μl परख बफर में क्रमानुसार पतला पेप्टाइड्स युक्त) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 5 μl जोड़ें और आरटी पर सेते एक थोक अभिकर्मक निकालने की मशीन का प्रयोग करें।

3. HTRF शिविर जांच परख

  1. 30 मिनट पहले का उपयोग करने के लिए आरटी HTRF शिविर परख किट ले आओ।
  2. (शिविर परख का पता लगाने के निर्माता द्वारा प्रदान की मालिकाना सूत्रीकरण,) lysis बफर में 1:20 कमजोर पड़ने पर प्रत्येक HTRF अभिकर्मक (cryptate और डी 2) अलग से तैयार करें।
    नोट: चेतावनी: lysis बफर पोटेशियम फ्लोराइड (KF) जो विषैला होता है और एक teratogen 13 में शामिल है। निपटान के लिए, परख KF युक्त प्लेटें सील किया जाना चाहिए और incinerated, और किसी भी तरल अपशिष्ट सिंक नीचे निपटान करने से पहले पानी के साथ <1 mmol / एल को पतला होना चाहिए।
  3. परख प्लेटों के सभी कुओं के लिए 5 μl cryptate अभिकर्मक जोड़ने के लिए एक थोक अभिकर्मक निकालने की मशीन का प्रयोग करें।
  4. colum करने के लिए 5 μl डी 2 अभिकर्मक जोड़ने के लिए एक थोक अभिकर्मक निकालने की मशीन का प्रयोग करेंएनएस परख प्लेटों के 1-22।
  5. इसके तत्काल बाद मैन्युअल परख प्लेटों के कुओं A23-D24 में 5 μl lysis बफर पिपेट गैर विशिष्ट बंधन (NSB) नियंत्रण कुओं, और कुओं E23-P24 में डी 2 अभिकर्मक के 5 μl देने के लिए।
  6. आरटी पर 200 XG पर 1 मिनट के लिए परख प्लेटें अपकेंद्रित्र कुओं मिश्रण करने के लिए।
  7. वाष्पीकरण और तस्वीर विरंजन को कम करने और 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते परख प्लेटों को कवर किया।
  8. उपाय प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) संकेत 620 एनएम और 665 एनएम एक प्लेट रीडर का उपयोग पर 320 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन का उपयोग कर।

4. डेटा विश्लेषण

  1. NSB मतलब सभी कुओं से पृष्ठभूमि घटाना प्रयोग करें।
  2. इस प्रकार के रूप में 665 एनएम / 620 एनएम अनुपात से% डेल्टा एफ की गणना:
    अनुपात = (ए 665nm / 620nm ए) 10 x 4
    डेल्टा एफ = ((नमूना अनुपात - अनुपात NSB) / अनुपात NSB)) x 100
    जहां अनुपात NSB कोई डी 2 अभिकर्मक के साथ कुओं =।
  3. % Activat की गणनाइस प्रकार के रूप unstimulated कोशिकाओं और कोशिकाओं के बीच आयन अधिकतम जीएलपी -1 ligand के साथ प्रेरित:
    % सक्रियण = (% डेल्टा Fsample -% DeltaFunstimulated कोशिकाओं) / (% DeltaFGLP -1 प्रेरित कोशिकाओं -% DeltaF unstimulated कोशिकाओं) x 100
  4. % सक्रियण के रूप में 4 पैरामीटर साजो विश्लेषण, और ग्राफ के माध्यम से एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता विश्लेषण के रूप में संदर्भ नियंत्रण 1 से परिभाषित किया।

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Representative Results

हम नियमित रूप से ध्वनिक हस्तांतरण के माध्यम से पेप्टाइड्स कमजोर करने के लिए एक दो कदम विधि का उपयोग करें। पहले कदम के लिए, एक ध्वनिक स्वचालन के साथ गठबंधन की मशीन चार शेयर पेप्टाइड दो स्रोत प्लेटें भर मध्यवर्ती dilutions बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 1 ए, बी)। दूसरे चरण के लिए, हम एक ध्वनिक निकालने की मशीन का उपयोग आगे प्रत्येक परीक्षा पेप्टाइड (चित्रा -1 सी) के लिए एक 11 सूत्री एकाग्रता रेंज बनाने के लिए स्रोत प्लेटों ए और बी से शेयर dilutions कमजोर करने के लिए। प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता रेंज दो प्रतियों में निकाल दिया है, परख थाली भर में सही करने के लिए छोड़ दिया है, की अनुमति 16 विभिन्न पेप्टाइड्स प्रति 384 अच्छी तरह से परख प्लेट (चित्रा -1 सी) से जांच की जाए। परख बफर बैकफ़िल परख थाली (चित्रा -1) भर में अच्छी तरह से प्रति एक निरंतर मात्रा सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है। संदर्भ पेप्टाइड सकारात्मक नियंत्रण भी अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता में गंतव्य प्लेटों में स्थानांतरित कर रहे हैं।

ईएनटी। "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> प्लेट्स एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, और दो प्रतियों में 16 पेप्टाइड्स युक्त एक उदाहरण थाली के लिए एक गर्मी नक्शा (चित्रा 2A) का उपयोग करते दिखाया गया है पढ़ रहे शिविर संचय परख इस्तेमाल एक औंधा प्रतियोगिता परख, इस प्रकार कम मूल्यों (बैंगनी के रूप में दिखाया गया है) के शिविर। एक उच्च एकाग्रता का प्रतिनिधित्व डुप्लीकेट अंक के reproducibility स्पष्ट जब डेटा एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के रूप में व्यक्त किया जाता है (चित्रा 2 बी)। नमूना 1 (पंक्ति, चित्रा 2A) परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। नमूने 2, 3 और 4 (पंक्तियों बी, सी और डी क्रमशः, चित्रा 2A) निष्क्रिय थे और चित्रा 2 बी में फ्लैट लाइनों के लिए समानता। नमूने 5-16 (पी पंक्तियों ई) सक्रिय प्रतिनिधित्व परीक्षण पेप्टाइड्स। विधि एक व्यापक शक्ति रेंज भर में पूर्ण एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है।

एक प्रवाह चार्ट पूरे काम के प्रवाह का ब्यौरा में दिखाया गया है

आकृति 1
चित्रा 1:। प्लेट लेआउट ध्वनिक धारावाहिक कमजोर पड़ने विधि वितरण का विवरण। (क, ख) एक 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेटें एक के लेआउट और प्रत्येक पेप्टाइड का 100x शेयर एकाग्रता के 25 μl युक्त, 100x सकारात्मक नियंत्रण, परख बफर केवल कुओं बैकफ़िल के लिए (उदाहरण के लिए 80 पेप्टाइड्स संभव स्रोत प्रति प्लेट के साथ) बी, और तीन 1: दोनों स्रोत प्लेटों के बीच स्वचालित ध्वनिक हस्तांतरण और बैकफ़िल द्वारा तैयार प्रत्येक पेप्टाइड के 100 धारावाहिक dilutions। (ग) एक एकल परख थाली लेआउट थाली भर में दो प्रतियों में 16 पेप्टाइड्स के लिए 11 सूत्री एकाग्रता रेंज दिखा। (घ) एक 10 μl अंतिम परख मात्रा में एक 11 सूत्री एकाग्रता रेंज के लिए विशिष्ट बांटना प्रोटोकॉल। सभी गंतव्य कुओं एक निरंतर अंतिम हस्तांतरण vo प्रदान करने के लिए एक परख बफर बैकफ़िल है 100 nl प्रति की Lume अच्छी तरह से। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: गर्मी के नक्शे और खुराक प्रतिक्रिया घटता हीट A665 एनएम पर प्रतिदीप्ति दिखा नक्शा।। थाली भर में दो प्रतियों में 16 पेप्टाइड्स के लिए (क) 11 सूत्री एकाग्रता रेंज। बैंगनी शिविर (अधिकतम) के एक उच्च एकाग्रता को इंगित करता है, लाल शिविर (न्यूनतम) की एक कम एकाग्रता इंगित करता है। (ख) कोशिकाओं (16 यौगिकों) को व्यक्त करने के लिए एक जीएलपी -1 रिसेप्टर agonist पेप्टाइड गतिविधियों के माउस जीएलपी -1 R खिलाफ रेंज दिखा एक ही थाली परख से प्रतिनिधि पेप्टाइड एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3:।। के पूरे कार्यप्रवाह की जांच प्रक्रिया के विस्तार फ्लो चार्ट यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल स्वचालित ध्वनिक वितरण के सफल आवेदन क्रमानुसार 3 एक्स 10 6 की एकाग्रता रेंज के नमूने की कम से कम 1 μl की आवश्यकता से अधिक पेप्टाइड नमूने को कमजोर करने का वर्णन है। इस विधि का प्रमुख लाभ प्रयोगात्मक कंटेनर और plasticware (जैसे पिपेट सुझावों के रूप में) है कि सामान्य रूप से अभिकर्मक हस्तांतरण और मिश्रण के लिए आवश्यक हैं के लिए नमूने के कम जोखिम के माध्यम से plasticware को पेप्टाइड सोखना को कम करने के माध्यम से डेटा की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए है। जबकि ध्वनिक वितरण पूरी तरह से plasticware के उपयोग से इंकार नहीं करता, यह काफी इसे कम करता है। इसके अलावा, टिप-आधारित pipetting को हटाने की भी नमूना भार समाप्त, और पूरे धारावाहिक कमजोर पड़ने के दौरान त्रुटियों को प्रचारित नहीं कर रहे हैं, एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता 14,15 के दोनों विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की तैयारी के लिए अनुमति देता है।

अन्य समूहों के लिए DMSO में solubilized परीक्षण यौगिकों के प्रत्यक्ष हस्तांतरण ध्वनिक सूचना दी हैसमय 16,17 से अधिक परख प्लेट और ऊष्मायन के उलटा के अलावा अन्य कोई आवश्यक कदम मिश्रण के साथ लंबी अवधि assays (> 48 घंटा) के लिए कोशिकाओं। DMSO अत्यधिक ध्रुवीय है और भी बहुत कुछ जैविक नमूने है कि तैयार किया है और पीबीएस में संग्रहीत किया जाना चाहिए की तुलना में जलीय समाधान के साथ मिश्रण करने के लिए उत्तरदायी है। इसलिए, जब पेप्टाइड नमूने का ध्वनिक हस्तांतरण के लिए एक स्वचालित पद्धति अपनाने, हम अतिरिक्त बैकफ़िल और centrifugation कदम पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, सटीक नमूना धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए अनुमति कार्यरत है। हमारा अनुभव बताता है कि अकेले centrifugation जलीय नमूनों की पूरी मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त नहीं है, और इस प्रकार, एक 'गीला हस्तांतरण' विधि जलीय बफर के एक मौजूदा 10 μl मात्रा में ध्वनिक हस्तांतरण से मिलकर विकसित किया गया था, की एक 15 μl बैकफ़िल द्वारा पीछा किया एक ही जलीय बफर। यह तेजी से होगा ईवा एक सूखी स्रोत थाली में पेप्टाइड्स आग करने और फिर वापस छोटे अणुओं के लिए एक हो सकता है के रूप में भरने के लिए, जलीय पेप्टाइड समाधान के रूप में संभव नहीं हैporate और पेप्टाइड अचल सूखी प्लास्टिक की प्लेट को सोखना होगा। हालांकि यह जलीय नमूने के मिश्रण की सहायता नहीं करता, centrifugation अभी भी ध्वनिक हस्तांतरण के लिए एक स्तर नमूना meniscus सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। कई मध्यवर्ती हस्तांतरण, बैकफ़िल और centrifugation कदम का समावेश है, कुछ समय लगता है, हालांकि कम नमूनों की बड़ी संख्या के मैनुअल तैयार करने, और स्वचालन के उपयोग से इतना पूछना throughput की अनुमति देता है। दूसरों का मार्गदर्शन यौगिक 96 अच्छी तरह प्लेटें 17 में मिश्रण के लिए जरूरत की सूचना है। यहाँ हम पूरी तरह से प्रक्रिया स्वचालित और मैनुअल हस्तक्षेप की आवश्यकता को हटा दिया जब DMSO के उपयोग संभव नहीं है। इंस्ट्रूमेंटेशन और उपभोक्ता वस्तुओं की लागत कुछ सेटिंग्स में इस प्रक्रिया का उपयोग सीमित कर देगा। यदि यह मामला है, हम अनुशंसा करते टिप-आधारित धारावाहिक dilutions हमेशा DMSO में प्रदर्शन कर रहे हैं परीक्षण के नमूने की प्रकृति इस (जैसे, सिंथेटिक पेप्टाइड्स) के लिए उत्तरदायी है। नमूने (DMSO के साथ इलाज नहीं किया जा सकता है जैसे,PEGylated पेप्टाइड्स) के बाद से हम पहले से बढ़ रही बीएसए की सांद्रता पूरी तरह से सोखना 1 रोकने नहीं होगा की भी शामिल किए जाने से पता चला है सावधानी, जब शक्ति डेटा की व्याख्या के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

ध्वनिक, टिप-कम हस्तांतरण परख miniaturization जो आवश्यक है अगर नमूने दुर्लभ हैं / परिमित के रूप में अक्सर पशु या मानव जैविक नमूने के लिए मामला है के संबंध में अतिरिक्त लाभ है, और हम पहले से जानवर के लिए अग्रणी नमूनों की मात्रा को कम करने के लिए क्षमता का वर्णन किया है अध्ययन 1 प्रति कम जानवरों के लिए एक आवश्यकता है। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि पेप्टाइड्स जैविक नमूने हैं और इस तरह के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण है; आदेश में उनकी ईमानदारी दोहराने फ्रीज पिघलना चक्र को बनाए रखने में बचा जाना चाहिए। बायोलॉजिक्स उपन्यास चिकित्सा की एक तेजी से बढ़ते क्षेत्र है, और पेप्टाइड्स की तैयारी के लिए हमारी स्वचालित उच्च throughput विधि आसानी से पुनः संयोजक प्रोटीन और एंटीबॉडी सहित अन्य जैविक एजेंटों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H8264
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide Bachem H-6795 Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides Produced in-house at MedImmune Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock Produced in-house at MedImmune Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250-061
Cedex XS Cell Analyzer Innovatis
Corning 384 well plates, low volume Sigma-Aldrich 4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate Labcyte Inc. P-05525
Echo Qualified Reservoir Labcyte Inc. ER-0055
Echo 550 Liquid Handler Labcyte Inc. Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler Labcyte Inc. Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation  HighRes Biosolutions MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermFisher Scientific 5840300 Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
  2. Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
  3. Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
  4. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  5. Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
  6. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  7. McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
  8. Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
  9. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
  10. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
  11. Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
  12. Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
  13. Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
  14. Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
  15. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  16. Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
  17. Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).

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जैव रसायन अंक 117 ध्वनिक वितरण पेप्टाइड्स धारावाहिक कमजोर पड़ने स्वचालन GPCR शिविर
स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण
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Naylor, J., Rossi, A., Brankin, C.,… More

Naylor, J., Rossi, A., Brankin, C., Hornigold, D. C. Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays. J. Vis. Exp. (117), e54542, doi:10.3791/54542 (2016).

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