Abstract
小分子薬物の発見と同様に、ペプチドアゴニストのスクリーニングは、濃度 - 応答曲線を生成するために、ペプチドの連続希釈を必要とします。ペプチドをスクリーニングすることは、従来のチップベースのサンプル処理方法は、吸着を介してペプチド損失の増加の機会を提供し、プラスチック容器の大きな表面積にペプチドを露出させるように複雑さの付加的な層が得られます。プラスチック容器への過度の露出を防止するには、プラスチックへの付着を介してペプチドの損失を低減し、したがって効力予測において不正確さを最小限にし、我々は、以前にペプチドアゴニスト1のin vitroでのハイスループットスクリーニングのために分配する非接触音響の利点を記載しています。ここでは、マウスのグルカゴン様ペプチド1受容体（GLP-1R）にペプチドアゴニストのスクリーニングの例を利用してマイクロタイタープレート中のペプチドの連続希釈の非接触音響の調製のための完全に統合された自動化ソリューションを議論します。私たちの方法は、高を可能にアゴニストをスクリーニングするための細胞ベースのアッセイ-throughputおよび増加サンプルスループットをサポートするために、または（複数の標的細胞株のパネルのために、例えば 、）をアッセイプレートのコピー数の増加を可能にするために容易に拡張可能です。
Introduction
GLP-1Rは、2型糖尿病2の治療において確立された薬物標的です。この受容体に対する天然ペプチドアゴニストは、GLP-1は、2〜3分のインビボ半減期を有します。アデニリルシクラーゼの活性化に対する天然のGタンパク質結合を介して二次メッセンジャーcAMPの下流の製造におけるそのGタンパク質共役標的受容体の結果をGLP-1の結合。蓄積されたcAMPの測定は、受容体活性化を監視するため、好ましい物理化学的特性を有する活性GLP-1類似体をスクリーニングするための堅牢なアッセイを提供します。このようなアッセイは、濃度応答曲線を構築するために、試験試料の連続希釈を必要とし、ペプチドのサンプルを渡すときに、これは特に複雑です。チップベースのシリアル希釈調製物からの潜在的なエラーは、以前1,4,5に記載されています。ペプチドは、信頼性の低い効力の推定の結果、プラスチック容器に吸着します。ペプチドの損失は、Tを介して最小化することができます彼の緩衝液中のウシ血清アルブミン（BSA）を含めると、シリコン処理プラスチック製品の使用、まだタンパク質結合が予測できないまま。具体的には、実験的なコンテナにGLP-1の結合の変化が6に記載されています。実験室用プラスチック製品で使用されている安定剤のさらなる合併症が水性アッセイ緩衝液中に先端およびマイクロタイタープレートから浸出し、タンパク質機能7,8を妨害する可能性がある。したがって、プラスチック容器への曝露を低減するための方法は、測定の精度を高めるために必要です。
音響液体ディスペンサは、隣接するアッセイプレート9に正確なナノリットル液滴の吐出が得られ、流体試料の表面に高周波音響信号をフォーカス。音響放出の使用は、大規模な合成化合物ライブラリーの調製およびスクリーニングのための製薬業界の標準であり、技術は十分に小さいmoleculのために検証されていますエス10。我々の知る限り、我々は、組換えおよび合成ペプチドの製造のための音響分与を記述するための最初のグループであり、私たちは以前に、従来のチップベースの方法1に比べて改善された精度を報告しています。
この記事では、完全に自動化されたプレートハンドリングロボットシステムに非接触音響伝達によるペプチドシリアルおよび直接希釈液の準備の統合について説明します。サンプルの音響伝達を包含する多数の方法は、以前11に記載されています。我々は、中間ストック濃度を調製し、連続完全な用量反応曲線を生成するためのペプチド類似体を希釈するために、二段階法を利用します。準備されたペプチドは、ターゲットのマウスGLP-1Rを発現する細胞とインキュベートし、そして我々は、ペプチドアゴニストACTIVの読み出しとして、これらの細胞内cAMP蓄積を測定するための市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用しています性。アッセイは、ハイスループット384ウェル形式に堅牢で適していると12を投影日常的アッセイ開発及び薬物スクリーニングの両方に適用されます。
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Protocol
1.ペプチドシリアル希釈
- アッセイ緩衝液を調製する：ハンクスを、25mM HEPES、0.1％BSAおよび0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、pH7.4で補充塩溶液（HBSS）を緩衝。
- 系統的5 384ウェル低容量アッセイプレートの各ウェルにアッセイ緩衝液5μlを追加するために、バルク試薬ディスペンサーを使用してください。
- 製造元の指示に従って、384ウェルプレートの各ウェルに5μlのボリューム追加のためのディスペンシング・プログラムを作成するために、内部ソフトウェアを使用してください。
- アッセイ緩衝液およびプライム流体中の分注カセットチューブを浸し。
- プレートキャリア上の384ウェル低容量アッセイプレートを置きます。
- 押してスタート。
- 100Xペプチドストックを生成するためにアッセイバッファーに関係なく、ストレージ車両の、全てのペプチド試料を希釈します。
注：スクリーニングを必要とするペプチドは、例えば、DMSO W（適切とみなされるようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはジメチルスルホキシド（DMSO）に設けられていてもよいです病気）などのPEG化などの二次修飾を有するペプチドに有害な影響を持っています。 - 音響的に修飾された384ウェルポリプロピレンマイクロプレートの列1-5に25μlの100倍のペプチドストックを分注します。このプレートは、「ソースプレートのA 'に指定されています。そのソースプレートではなく、先のプレートを確認し、平底やアコースティック楽器のメーカーによって定義された特定の音響公差に適合しています。
- 井戸A23に25μlの100倍の基準制御を分配し、ソースプレートAのA24
- ソースプレートAの列21-22に列11-15と30μlのアッセイ緩衝液10μlのアッセイ緩衝液を分注します
- 列6-10と列に第二の音響的修飾384ウェルポリプロピレンマイクロプレートの16-20を10μlのアッセイ緩衝液を分注します。このプレートは、「ソース板B 'と指定されています。
- 1分間300×gで遠心ソース板AとB。適切なバランスプレートが含まれます。
- 音響fluiを使用してくださいソースAの列1から100倍のペプチド株式の100中間希釈液（アッセイ緩衝液中）：3つの連続した1を準備する自動ロボットシステムに統合Dディスペンサー
注：プログラミングは、ソースAとソースB（プレートレイアウトについては、 図1を参照）との間に3音響転送を可能にするために、プレートの再フォーマットおよび（音響流体ディスペンサーの製造業者によって提供されるような）用量反応ソフトウェアが必要です。具体的には1.9の詳細自動ロボット制御の下で、この研究室で使用される流体ディスペンサの使用をステップ（ 材料表参照）。- ロボットの板ホテルセクションにロード・ソース・プレートとアッセイプレート。
- オープン自動ロボットソフトウェアとロードプレート再フォーマットおよび用量反応プログラムの拡張プロトコル。 「ファイル名を指定して実行]をクリックします。
注：自動化は、ソースプレートBの列6-10にソースプレートAの列1-5から250 NLを転送するために音響流体ディスペンサを指示し、第二acousti混合する15μlのアッセイ緩衝液でバックフィルするために、より大きな流体体積を扱うことができるC流体ディスペンサ。自動化は、その後、（適切なバランスプレートは、すべての遠心操作のために含まれている）1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離機にソースプレートBを転送します。ソース板Bは、ソースプレートAの11-15列にソースプレートBの列6-10から250ナノリットルの転送のために音響流体ディスペンサに戻り、混合するために15μlのアッセイ緩衝液でバックフィルされます。 1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離器にオートメーション転送元板A。ソースプレートAは、ソースプレートBの列16-20にソースプレートAの列11-15から250 NLの転送のための音響流体ディスペンサに戻り、混合するために15μlのアッセイ緩衝液でバックフィルされます。オートメーションは、その後、1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離機にソースプレートBを転送します。
注：最後に、用量応答プロトコルは、転送する音響分配を指示します（ソース板Aとソース板Bの両方で）4段階希釈したソースプレートのウェルのそれぞれから必要量をアッセイプレート中で二重に完全な11点曲線を構築するために（上記ステップ1.2で5μlのアッセイ緩衝液で予め充填されました）。オートメーション転送1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離器にアッセイプレート。
2.細胞調製
- 20mLのアッセイ緩衝液中で37ºC水浴再懸濁急速にターゲットマウスGLP-1受容体を発現融解凍結保存チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞です。
- 室温（RT）で200×gで5分間遠心細胞懸濁液。適切なバランスを含めます。
- 上清を捨て、10ミリリットルのアッセイ緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。
- トリパンブルーで1および自動細胞カウンターを用いて生存細胞密度を決定：細胞ストックを1に希釈します。 WELあたり8000細胞に（等価1mlあたり1.6×10 6細胞でアッセイ緩衝液中で細胞を再懸濁しアッセイプレートのL）。
- （5μlのアッセイ緩衝液中で連続希釈したペプチドを含む）をアッセイプレートの各ウェルに細胞懸濁液を5μlを添加し、室温で30分間インキュベートし、バルク試薬ディスペンサーを使用します。
3. HTRFのcAMP検出アッセイ
- 使用前に30分間室温にHTRF cAMPアッセイキットをもたらします。
- （cAMPの検出アッセイのメーカーが提供する独自の製剤）の溶解緩衝液で1：20希釈で個別に各HTRF試薬（クリプテートとd2）を準備します。
注：注意：溶解緩衝液は、毒性や催奇形物質13であるフッ化カリウム（KF）が含まれています。処分については、KFを含むアッセイプレートを密封し、焼却、および任意の液体廃棄物は、シンクの下、廃棄前に水で<1ミリモル/ Lに希釈しなければならないしなければなりません。 - アッセイプレートのすべてのウェルに5μlのクリプテート試薬を追加するには、バルク試薬ディスペンサーを使用してください。
- コラムに5μlのd2の試薬を追加するには、バルク試薬ディスペンサーを使用しますnsのアッセイプレートの1月22日。
- すぐに手動で非特異的結合（NSB）対照ウェル、ウェルE23-P24にd2の試薬の5μLを与えるためにアッセイプレートのウェルA23-D24に5μlの溶解バッファーをピペット。
- 井戸を混合し、室温で200×gで1分間のアッセイプレートを遠心します。
- 蒸発および光退色を最小にし、1時間室温でインキュベートし、アッセイプレートを覆います。
- 620nmでプレートリーダーを用いて665 nmで320 nmで励起し、発光を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）シグナルを測定します。
4.データ解析
- すべてのウェルからバックグラウンドを減算するNSBを意味使用してください。
- 次のように665 nmの/ 620 nmの比から％デルタFを計算します。
レシオ=（665nm / 620nmの ）10 4を xは
デルタF =（（サンプル比-レシオNSB）/比NSB）が ）×100
どこ比NSBはありませんd2の試薬と井戸を=。 - activat％を計算します次のように最大GLP-1リガンドで刺激非刺激細胞と細胞との間のイオン：
％活性化=（％デルタFsampleは - ％はDeltaFunstimulated細胞）/（％のDeltaFGLP-1刺激細胞 - ％DeltaF非刺激細胞）×100 - 参照対照1によって定義される4パラメーターロジスティック分析により、濃度-反応曲線を分析し、％活性としてグラフ。
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Representative Results
私たちは日常的に音響伝達を介してペプチドを希釈するために2段階の方法を使用します。最初のステップは、自動化と整合音響ディスペンサは、二つのソースプレート（図1A、B）にわたって4ストックペプチド中間希釈物を作成するために使用されます。第二段階のために、我々は、さらに、各試験ペプチド（ 図1c）のための11ポイントの濃度範囲を作成するには、ソースプレートAとBからの株式の希釈液を希釈するために音響ディスペンサーを使用しています。各ペプチド濃度範囲は、16の異なるペプチドは、384ウェルアッセイプレート（ 図1c）ごとにスクリーニングすることができるように、アッセイプレートを横切って左から右に、重複して焼成します。アッセイ緩衝液のバックフィルをアッセイプレート（ 図1D）の両端のウェル当たり一定量を確保するために行われます。参照ペプチド陽性対照はまた、最大有効濃度で先プレートに移します。
ENT "FO：キープtogether.withinページ=" 1 ">プレートを示している（ 図2a）を蛍光プレートリーダー、重複する16のペプチドを含む、例えばプレートのヒートマップを使用して読み取られるcAMP蓄積アッセイを用い反転競合アッセイであり、このように（紫色で示す）低い値はcAMPの高濃度を表す。データは、濃度-応答曲線（ 図2b）として表現される場合、重複点の再現性が明らかである。サンプル1（行A、 図2a）アッセイの陽性対照を表す。（それぞれ列B、C及びD、 図2a）試料2,3及び4は、不活性であり、 図2bに平坦線に一致する。サンプル5-16（行E Pに）アクティブ表します試験ペプチドは、この方法は、広範な効力範囲にわたって完全な濃度 - 応答曲線の生成を可能にします。全体の作業の流れを詳述するフローチャートは、に示されています 
図1：段階希釈法を分配音響のプレートレイアウト説明。 （a、b）が384ウェルソースプレートAのレイアウトや埋め戻しのために、100倍陽性対照、アッセイ緩衝液のみのウェル（ソースプレート当たり可能な80のペプチドでの例）各ペプチドの100倍のストック濃度の25μLを含むB、および3 1：両方のソースプレート間の自動化された音響伝達し、埋め戻しにより調製した各ペプチドの100連続希釈液。 （c）は 、プレートを横切る重複において16ペプチドの11点の濃度範囲を示す単一のアッセイプレートレイアウト。 （D）10μlの最終アッセイ容量で、11点濃度範囲のための典型的な分配プロトコル。すべての宛先ウェルは、一定の最終転写VOを提供するために、アッセイ緩衝液の埋め戻しを持っています 100 NLあたりのLUMEよく。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2：ヒートマップと A665のnmで蛍光を示す用量反応曲線ヒートマップ。プレート全体の重複で16ペプチドのための（a）は、11ポイントの濃度範囲。パープルのcAMP（最大）の高濃度を示し、赤は、cAMP（分）の低濃度を示します。 （b）の細胞（16化合物）を発現するマウスGLP-1Rに対するGLP-1受容体アゴニストペプチド活動の範囲を示す単一のプレートアッセイからの代表的なペプチド濃度-応答曲線。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図3： スクリーニングプロセスのフロー・チャートワークフロー全体の詳細この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、シリアルサンプルの1未満μLを必要とする3×10 6の濃度範囲にわたってペプチド試料を希釈するための自動化された音響ディスペンシングの成功のアプリケーションについて説明します。この方法の主な利点は、通常は、試薬移送および混合のために必要とされている（例えば、ピペットチップなど）、実験容器プラスチック容器への試料の還元暴露を介してプラスチック容器へのペプチドの吸着を最小化を介してデータの品質を向上させることです。音響、分配が完全にプラスチック製品の使用を排除していませんが、それはかなりそれを減らすん。また、チップベースのピペット操作の除去はまた、サンプルのキャリーオーバーを排除し、エラーが濃度-応答曲線14,15の信頼性と再現性の両方の準備を可能にし、全体の連続希釈全体に伝播されていません。
他のグループはDMSOに可溶化した試験化合物の直接音響伝達を報告しています時間16,17にわたってアッセイプレートとのインキュベーションの反転以外の不要混合工程との長期的なアッセイのための細胞（> 48時間）。 DMSOは高極性であり、はるかに順応PBS中で調製し、保存されている必要があり、生物学的サンプルよりも、水溶液と混合することです。ペプチド試料の音響伝達のための自動化された方法を採用する場合したがって、我々は正確なサンプル連続希釈を可能にする、完全な混合を確実にするために追加の埋め戻しや遠心分離ステップを採用しています。私たちの経験だけでは、遠心分離は、水性サンプルの完全な混合を確実にするのに十分ではないことを示しており、したがって、「ウエット転送 'メソッドは、15μlの埋め戻しに続いて、水性緩衝液の既存の10μlのボリュームに音響伝達から成る開発されました同じ水性緩衝液。ドライソースプレートにペプチドを発射した後、バックペプチド水溶液ます急速にエヴァのように、小分子のための1つかもしれないとして記入することはできませんporateおよびペプチドが不可逆的に乾燥したプラスチック板に吸着します。それは、水性サンプルの混合を助けていませんが、遠心分離は、依然として音響伝達のためのレベルのサンプルメニスカスを確実にするために必要とされます。マニュアル、多数のサンプルの準備、およびオートメーションの使用よりもとても少ないが、教師なしのスループットを可能にしているが、複数の中間埋め戻し転送、および遠心分離工程を含めることは、多少時間がかかります。その他は、96ウェルプレート17中で混合手動化合物の必要性を報告しています。ここでは、完全にプロセスを自動化し、DMSOの使用ができない場合、手動介入の必要性を削除しました。計測機器や消耗品のコストは、いくつかの設定でこのプロセスの使用を制限します。この場合、我々は、試験試料の性質は、この（ 例えば、合成ペプチド）に従順であればチップベースのシリアル希釈液は常にDMSO中で行われているお勧めします。サンプルは、例えば （DMSOで処理することができない場合、PEG化ペプチド）の効力データを解釈するとき、我々は以前に完全に吸着1を防ぐことはできませんBSAの濃度を増加させても含めることを示しているため、注意が、使用すべきです。
音響は、チップレス転送は、多くの場合、動物またはヒトの生物学的サンプルの場合のように、サンプルは/有限不足している場合に必須であるアッセイ小型化に関連する追加の利点を持っており、我々は以前につながる動物サンプルの量を減らすための可能性を記載しています研究1あたりの少ない動物のための要件。ペプチドは、生物学的サンプルであり、そのように扱われるべきであることを覚えておくことが重要です。その完全性を維持するために、凍結融解サイクルを避けるべきである繰り返します。生物製剤は、新規治療薬の急速に成長している分野であり、そしてペプチドの調製のための私達の自動化ハイスループット法は、容易に、組換えタンパク質および抗体を含む他の生物剤に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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