Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55004
Automatic Translation
1, 2, 1
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

Abstract

الجينات مع أدوارا مهمة في تطوير كثير من الأحيان يكون أنماط التعبير مقيدة مكانيا و / أو الزمان. في كثير من الأحيان لا يتم الكشف عن هذه النصوص الجين أو لا يتم تحديدها كما أعرب تفاضلي (DE) في التحليلات transcriptomic الأجهزة مصنع كامل. الليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل (LM RNA تسلسل) هو أداة قوية لتحديد الجينات التي هي دي في المجالات التنموية المحددة. ومع ذلك، واختيار المجالات الخلوية لmicrodissect ومقارنة، ودقة microdissections حاسمة لنجاح هذه التجارب. هنا، مثالين لتوضيح اعتبارات التصميم للتجارب transcriptomics. وLM تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها إلى تحديد الجينات التي DE على طول المحور الداني القاصي ورقة الذرة، والتجربة الثانية لتحديد الجينات التي هي دي في liguleless1-R (LG1-R) المسوخ مقارنة نوع البرية. تم تفصيل العناصر الرئيسية التي ساهمت في نجاح هذه التجارب النسيجي وبحالة الاشتراكيةتو التهجين يحلل المنطقة لتحليلها، واختيار من براعم نبات في مراحل نمو تعادل، واستخدام المعالم المورفولوجية لتحديد المناطق لتسليخ مجهري، وتسليخ مجهري من المجالات قياسها بدقة. وتقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة لتحليل المجالات التنموية التي LM RNA تسلسل. البيانات المقدمة هنا توضح كيف أن المنطقة المحددة لتسليخ مجهري سوف يؤثر على النتائج التي تم الحصول عليها.

Introduction

أوراق الذرة هي نموذج مثالي لدراسة تشكيل المجالات التنموية خلال التشكل، كما أن لديها حدود واضح بين النصل والغمد التي هي قابلة للتشريح الجيني (الشكل 1A). خلال المراحل الأولى من تطوير ورقة، عصابة خطية من الخلايا الصغيرة، والفرقة preligule (PLB)، الإضافي يقسم منشم ورقة إلى ما قبل النصل والغمد قبل المجالات. واللسيناء مثل هامشية والأذين الثلاثي تطوير من PLB (الشكل 1A، C، D). وقد حددت شاشات الوراثية الطفرات التي تعطل الحدود شفرة غمد. على سبيل المثال، liguleless1 المتنحية (LG1) الطفرات بحذف اللسيناء والأذين 1، 2، 3، 4 (الشكل 1B). في الموقع كشفت التهجين التي نص LG1 يتراكم في PLB واللسيناء الناشئة، مما يجعلها علامة ممتازة للتنمية اللسيناء 5، 6 (الشكل 1E).

شكل 1
الشكل 1: من النوع البري وأوراق الذرة liguleless1-R. (أ) المنطقة بليد غمد حدود ناضجة ورقة من النوع البري تظهر الهياكل اللسيناء والأذن. (ب) المنطقة بليد غمد حدود ناضجة liguleless1-R ورقة تبين عدم وجود هياكل اللسيناء والأذن. قطعت الأوراق في A و B في نصف طول الضلع الأوسط. (C) الطولي القسم من خلال البرية من نوع ورقة منشم. وقد تم تجهيز عينة وملطخة للتحليل النسيجي. واللسيناء بدء واضح كما عثرة جاحظ من الطائرة من ورقة (رأس السهم). (D) طائفة طوليةايون من خلال البرية من نوع ورقة منشم. وقد تم تجهيز عينة لLM كما هو موضح في النص. يشير السهم الشروع اللسيناء. (E) LG1 في الموقع التهجين من تبادل لاطلاق النار مهيمنة المقطع الطولي الجانبي. وتشير العلامات النجمية تراكم نسخة LG1 في PLB من منشم ورقة P6. وتشير السهام قاعدة P6 منشم. يشير شريط القياس من قاعدة منشم إلى PLB. الحانات النطاق في A و B = 20 مم. الحانات النطاق في م = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من الإشارة 6 (الجمعية الأمريكية حقوق الطبع والنشر علماء الأحياء النباتية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه الدراسة، كان يعمل LM RNA تسلسل لتحديد مجموعة من الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف (DE) في شفرة غمد حدود نسبة إلى أجزاء أخرى من منشم ورقة وبيئة تطوير متكاملة الجينات ntify التي هي دي في المسوخ LG1-R قريبة من النوع البري الأشقاء. LM RNA تسلسل هو وسيلة لقياس تراكم نص في خلايا معينة أو المجالات الخلوية 7. نظم LM الجمع بين الليزر والمجهر مع الكاميرا الرقمية. هي التي شنت الأنسجة مقطوع على الشرائح وعرضها من خلال المجهر. البرنامج LM عادة ما تضم ​​أدوات الرسم التي تسمح للمستخدم لمخطط أي منطقة تم اختيارها لتسليخ مجهري. تخفيضات ليزر على طول الخط، والأنسجة المختارة قفزت خارج الشريحة وفي أنبوب معلق فوق الشريحة. LM يسمح للمستخدم لmicrodissect مجالات محددة، بما في ذلك طبقات معينة من الخلايا وحتى الخلايا وحيدة 8 و 9. RNA ومن ثم يمكن استخراجها من أنسجة microdissected. وفي وقت لاحق، المكون RNA يليها يستخدم الجيل القادم التسلسل تسلسل مكتبات كدنا] المتولدة من الحمض النووي الريبي المستخرج 10،= "XREF"> 11.

المزايا الرئيسية لLM RNA وما يليها هي القدرة على قياس تراكم نسخة في مجالات محددة بدقة والقدرة على محة عن Transcriptome على كامل في وقت واحد (7). هذه التقنية هي مناسبة بشكل خاص لسبر الأحداث التنموية في وقت مبكر حيث المنطقة من اهتمام في كثير من الأحيان المجهرية. وقد استخدمت الدراسات السابقة LM جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا متطورة لدراسة العمليات التنموية في محطات 9 و 12 و 13. RNA تسلسل لديه ميزة قياس النصوص عبر مجموعة ديناميكية واسعة، بما في ذلك الجينات منخفضة أعرب، وليس مطلوبا من المعلومات تسلسل مسبق 10 و 11. وعلاوة على ذلك، LM RNA تسلسل لديه القدرة على تسليط الضوء على جينات هامة تنمويا قد غاب في شاشات الطفرات بسبب التكرار الجيني أو إلى الفتك من خسارة من-وظيفة متحولة.

جينات هامة تنمويا، مثل sheath1 ضيقة (NS1) وعلى شكل كوب cotyledon2 (cuc2)، وغالبا ما يكون أنماط التعبير محددة من واحد أو عدد قليل من الخلايا 17، 18، 19، 20. وأعرب كثيرون فقط خلال مراحل النمو المبكرة وليس في الجهاز ناضجة. عندما يتم تحليل أجهزة كاملة أو المجالات كبيرة، وتضعف هذه النصوص خلية محددة، ولا يجوز الكشف في التحليلات التقليدية أكثر. من خلال السماح تحليلات مجالات محددة بدقة، وتمكن LM RNA تسلسل هذه الجينات الأنسجة محددة يتم تحديدها وكميا.

ومن العوامل الحاسمة في نجاح هذه التجارب هو موضح هنا تحليل النسيجي الدقيق التي وجهت اختيار المرحلة التنموية المناسبة والمجال لتحليل، وmeasureme دقيقةالإقليم الشمالي من المجالات خلية الأنسجة لLM. لضمان المجالات تعادل وأخذت عينات لجميع مكررات، تم جمع الأنسجة من براعم نبات في هذه المرحلة التنموية نفسها، وكان قياس المجالات microdissected النسبية إلى المعالم المورفولوجية مثل اللسيناء الناشئة (الشكل 2). ومن المعروف أن يتم التعبير عن بعض الجينات في التدرج من طرف إلى قاعدة ورقة. عن طريق قياس المجالات دقيقة، والتباين بسبب أخذ العينات من مواقع مختلفة على طول المحور الداني القاصي ورقة كان في حده الأدنى (الشكل 3A). بواسطة microdissecting المجالات من نفس الحجم، التخفيف من النصوص خلية محددة تم تخفيض أيضا (الشكل 3B) الاختلاف يرجع إلى التفاضلية. واستخدمت المقاطع الطولية الجانبية للقمة تبادل لاطلاق النار لجميع microdissections. هذه هي المقاطع التي هي عمودي على محور الضلع الأوسط الهامش (الشكل 4). باستخدام أقسام الوحيدة التي تشمل SAM يضمن أن المناطق الجانبية ما يعادلويتم تحليل براعم نبات.

في عينات المصنعة ومقطوع عن LM، أول علامة الصرفي من ثمرة اللسيناء هو نتوء على الجانب متجه نحو المحور بسبب انقسامات الخلية periclinal في البشرة متجه نحو المحور (1D الشكل، الشكل 2). تقرر أن اللسيناء الناشئة يمكن تحديدها بشكل موثوق به في فترة تتابع النمو 7 براعم نبات المرحلة. كنا مهتمين الجينات وأعرب في المنطقة اللسيناء بأكملها، بما في ذلك اللسيناء الناشئة والخلايا البعيدة على الفور من شأنها أن تشكل الأذن. من أجل ضمان أن التحديدات الأنسجة تعادل بذلت، تم استخدام عثرة اللسيناء كمعلم الصرفي واختير مستطيل 100 ميكرون تركزت على نتوء اللسيناء لLM (الشكل 2A، 2B). وقد تم اختيار مستطيلات يعادل الحجم من قبل شفرة وقبل غمد من نفس براعم نبات.

قدمت تحليلات للنباتات معدلة وراثيا liguleless وشال مختلفةنجى. LG1-R المسوخ لا تشكل اللسيناء، لذلك لا يمكن استخدام هذه الميزة المورفولوجية لتحديد المنطقة لLM. بدلا من ذلك، تم تحديد مجال تراكم نسخة LG1 في البرية من نوع نبات براعم، وأنها حددت المنطقة التي من شأنها أن تشمل هذا المجال. تم إجراء هذه التحاليل الأولية على الشتلات من نفس زراعة مثل استخدمت في التحليل النهائي، لأن العمل السابقة قد أظهرت أن موقع PLB يختلف باختلاف ظروف النمو. في الموقع أشار التهجين أن النصوص LG1 تتراكم في PLB من P6 رقة براعم (الشكل 1E). اخترنا مجال 400-900 ميكرون من قاعدة براعم نبات أن يشمل مجال التعبير LG1 (المستطيلات الأرجواني، الشكل 2A) واستولت على هذه المناطق ما يعادلها من النوع البري والنباتات LG1-R. لتقليل التباين في ظروف الخلفية والنمو الوراثية عند مقارنة transcripواستخدمت تراكم تي في LG1-R والنباتات البرية من نوع، فصل العائلات من المسوخ والبرية من نوع الأشقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: إصلاح الأنسجة للتحليل النسيجي في نفس الوقت أن الأنسجة ثابتة لLM. دراسة المقاطع الملون لميزات المورفولوجية التي ستوجه في وقت لاحق LM. عند مقارنة متحولة إلى البرية من نوع، نفذ في الموقع التهجين أو immunolocalization لتحديد المجال حيث يتم التعبير عن الجينات في المصالح (في هذه الحالة LG1).

1. تثبيت الأنسجة وتجهيز

  1. تنمو الشقق شتلات الذرة لمدة أسبوعين القديمة في ظل ظروف قياسية 6.
  2. تشريح قمم تبادل لاطلاق النار لقطاعات جانبية (الشكل 4).
    1. الشتلات المكوس أسفل خط التربة.
    2. باستخدام شفرة حلاقة، إزالة شرائح رقيقة من قاعدة الساق (تخفيضات 1، الشكل 4A) حتى بيضاوي من دقاق الفحم محاطة احد أو اثنين من الأوراق الناضجة مرئيا (الشكل 4B).
    3. جعل خفض آخر ما يقرب من 10 مم فوق قاعدة (قطع 2، الشكل 4A).وسيتضمن هذا القطاع 10 مم وسام وبراعم أوراق الشباب.
    4. تحويل شريحة 10 مم حتى القاعدة ومواجهة. جعل اثنين من التخفيضات موازية للمحور الأفقي بحيث يتم الحصول على شريحة من النسيج 2-3 مم (تخفيضات 3، و 4، الشكل 4B). تجاهل الخارجية جزأين والإبقاء على شريحة المركزية لتثبيت والتضمين.
      ملاحظة: قد يتم قطع الأوراق الخارجي والتخلص منها.
  3. إصلاح الأنسجة وعملية لدمج.
    1. التأكد من أن جميع المواد المستخدمة في الخطوات اللاحقة هي ريبونوكلياز مجانا. علاج حلول مع pyrocarbonate اثيل (DEPC) (1 مل DEPC في لتر من المحلول. احتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز في بعض الأحيان، والأوتوكلاف). الأواني الزجاجية يخبز في الفرن على حرارة 200 درجة مئوية أو أعلى لمدة 6 على الأقل ساعة وعلاج وير البلاستيكية التي تحتوي على ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    2. يوم 1: تزج شرائح الأنسجة في ~ 10 مل من الإصلاح المزارعين (3: 1 الايثانول: حامض الخليك) في قارورة زجاجية على الجليد. بعد أن تم تشريح جميع العينات، وتطبيق vacuuم لإزالة فقاعات الهواء والاختراق المعونة من تثبيتي. عقد في ظل فراغ لمدة 10 دقيقة ثم الافراج عن فراغ ببطء. استبدال تثبيتي، واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل مع اهتزاز لطيف.
    3. يوم 2: احتضان في السلسلة التالية من الحلول، ~ 10 مل لكل منهما، 1 ساعة لكل منهما، مع كل طيف تهتز. 85٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، و 95٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، و 100٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، و 100٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، و 100٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، 1: 1 الايثانول: الزايلينات في درجة حرارة الغرفة، 100 الزايلينات٪ في درجة حرارة الغرفة، و 100 الزايلينات٪ في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الزايلينات سامة عن طريق الاتصال والاستنشاق. العمل في غطاء الدخان واستخدام القفازات المناسبة.
    4. إضافة الأنسجة البارافين تضمين الكريات المتوسطة لحجم نصف تقريبا من الزيلين واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
    5. يوم 3: نقل القارورة إلى 60 درجة مئوية الفرن حتى تذوب حبيبات. تخلصي من حل واستبدال الأنسجة الطازجة تفوح تضمين المتوسطة. تغيير متوسطة مرتين أخريينخلال اليوم.
    6. يوم 4: تغيير الأنسجة تضمين المتوسط ​​مرة واحدة في الصباح. العودة إلى 60 درجة مئوية الفرن حتى بعد ظهر اليوم.
  4. كتل الزهر
    1. وضع قوالب تضمين على طبق ساخن من محطة التضمين الأنسجة. استخدام ملقط لنقل عينات الأنسجة إلى قوالب تضمين مع سطح قطع أسفل. ملأ القالب مع البارافين ذاب ووضع عصابة التضمين على رأس القالب. نقل إلى لوحة الباردة حتى عزز البارافين. تخزين كتل البارافين في 4 درجات مئوية في وعاء محكم مع هلام السيليكا.

2. باجتزاء وحرك إعداد

  1. قطع 10 ميكرون المقاطع على مشراح 25.
  2. فحص أشرطة واختيار المقاطع الوسطية. أقسام متوسط ​​هي تلك التي تشمل SAM، الذي يظهر على شكل قبة من الخلايا محاطة براعم نبات.
  3. أقسام جبل على الشرائح.
    1. مكان الشرائح التي هي مناسبة لLM (إما ريبونوكلياز مجانا أوخبز) على 42 درجة مئوية الشريحة الأكثر دفئا وتطبيق عدة قطرات من 50٪ من محلول الإيثانول لتغطية الشريحة.
    2. تطفو أقسام على حل الإيثانول حتى توسعت الأقسام.
      ملاحظة: العائمة أقسام على حل الإيثانول بدلا من الماء يحافظ الحمض النووي الريبي في دولة عجلت الحد من تدهور RNA.
    3. إمالة الشريحة وإزالة الزائد الحل الايثانول بواسطة الشفط مع ماصة نقل القابل للتصرف. استخدام مناديل خالية من الوبر إلى ذبالة بعيدا أي حل الإيثانول إضافية.
    4. الشرائح الجافة في 42 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل. متجر الشرائح في 4 درجات مئوية في وعاء محكم مع هلام السيليكا.
  4. Deparaffinize الشرائح في يوم من الاستخدام.
    1. إعداد ثلاث عبوات زجاجية تحتوي على Coplin. 100٪ الزيلين (الزايلينات الأول)، و 100٪ الزيلين (الزايلينات الثاني)، والإيثانول بنسبة 100٪ (~ 50 مل من كل حل).
    2. باستخدام ملقط نظيفة لنقل الشرائح، وتزج الشرائح في الزيلين أنا لمدة 2 دقيقة، الزايلينات الثاني لمدة 2 دقيقة، و 100 الإيثانول٪ لمدة 1 دقيقة.
    3. استنزاف انزلقوفاق على مناديل خالية من الوبر والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة.

3. تسليخ مجهري بليد، اللسيناء وغمد عينات من فترة تتابع النمو 7 ورقة براعم

  1. تأمين الشرائح على خشبة المسرح المجهر LM. استخدام خمسة أو ستة الشرائح لكل تكرار، وذلك باستخدام خمسة أقسام لكل شريحة.
    ويتضح الأنسجة تجميع لتكرار واحد في الشكل (5): ملاحظة.
  2. فحص الشرائح وتحديد الأجزاء الخمسة الأكثر الوسيط في كل شريحة باستخدام SAM قمة كنقطة مرجعية مركزية.
    ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك في تضخم منخفضة، وعادة ما يكون الهدف 5X كافية.
  3. باستخدام 10X أو 20X الهدف، وتحديد موقف اللسيناء على ورقة منشم فترة تتابع النمو 7 من كل قسم. سوف اللسيناء تكون واضحة كما نتوء بارز من سطح متجه نحو المحور من منشم ورقة. بمناسبة هذا الموقف باستخدام أداة الرسم من البرنامج LM. حدد رمز القلم الرصاص، حرك المؤشر إلى positi المناسبعلى وانقر واسحب الماوس لرسم.
    ملاحظة: الهدف 20X 10X أو غير مناسبة لهذا والخطوات اللاحقة. عند استخدام قطاعات جانبية، فإن الجانبين من كل منشم ورقة تكون موجودة في كل قسم (الشكل 2A).
  4. باستخدام أداة الحاكم وأداة رسم مستطيل، قياس 100 ميكرون مستطيلات عالية تتمحور حول اللسيناء من كل قسم (المستطيلات الحمراء، الشكل 2A، 2B). سوف تكون هذه هي "اللسيناء" عينة.
    1. استخدام أداة الحاكم. حدد رمز المسطرة، تحريك المؤشر إلى نهاية واحدة من الكائن إلى أن تقاس، انقر واسحب لقياس الكائن. وسيتم عرض وطول المسطرة على الشاشة.
    2. لرسم مستطيل. حدد رمز مستطيل، حرك المؤشر إلى النقطة التي ستكون إحدى زوايا المستطيل، انقر واسحب لرسم مستطيل من الحجم المناسب. بدلا من ذلك، حدد أداة رسم خط مستقيم ورسم أربعة خطوط مستقيمة.
    3. قياس 100 ميكرون المستطيلات المتمركزة 50 ميكرون فوق وتحت المستطيل "اللسيناء".
      ملاحظة: وسوف تكون هذه "بليد" والعينات "غمد"، على التوالي (الأخضر والأزرق المستطيلات، الشكل 2A، 2B). استنادا إلى بيانات النسيجية لدينا، ويشمل مستطيل ميكرون 100 منطقة اللسيناء بأكملها. وقد تم اختيار أجزاء يعادل الحجم من النصل والغمد لضمان كميات مماثلة من الأنسجة جمعت لكل منها. تم استخدام الفواصل من 50 ميكرون لضمان عدم وجود نسيج المنطقة اللسيناء يتم تضمين عن غير قصد في النصل أو غمد microdissections.
  5. Microdissect قياس المستطيلات (الشكل 2D - 2F) 7، 8، 9، وجمع عينات اللسيناء، بليد وغمد في أنابيب منفصلة. استخدام وظيفة قطع الليزر لقطع طريق قسم الأنسجة على طول الخطوط العريضة للالمجال المحدد. استخدام نحو الأرضوظيفة pult لدفع المستطيل الأنسجة خارج الشريحة وإلى غطاء أنبوب (الشكل 2D - 2F).

4. تسليخ مجهري بليد، اللسيناء وغمد متجه نحو المحور البشرة عينات من فترة تتابع النمو 7 ورقة براعم

  1. تحديد الأقسام واستخدام أداة المسطرة لقياس 100 ميكرون شرائح عالية تتمحور حول اللسيناء فترة تتابع النمو 7، كما هو موضح في القسم 3 (أعلاه).
    1. حدد فقط خلايا البشرة متجه نحو المحور من كل 100 ميكرومتر عالية "بليد" و "غمد" الجزء (الأخضر والأزرق التحديدات، الشكل 2C) التي تحدد مع أداة رسم. البشرة هي طبقة الخلايا الخارجي؛ الجانب متجه نحو المحور هو الأقرب إلى SAM.
    2. للحصول على نموذج "اللسيناء"، حدد فقط خلايا عثرة اللسيناء الناشئة كما هو موضح في القسم 3.3 (اختيار الحمراء، الشكل 2C).
  2. المناطق Microdissect المحدد، جمع بليد، اللسيناء وشياعشر البشرة العينات في أنابيب منفصلة، ​​كما هو موضح في القسم 3.5.

5. تسليخ مجهري لفترة تتابع النمو 6 ورقة براعم من LG1-R والبرية من نوع الأشقاء

  1. تنمو فصل عائلات متحولة (LG1-R) والنباتات البرية من نوع.
  2. إصلاح وتبادل لاطلاق النار العملية قمم للLM، كما هو موضح في أقسام 1،2-1،4. إصلاح من النوع البري وقمم تبادل لاطلاق النار متحولة في قارورة منفصلة من أجل الاحتفاظ بها منفصلة. عينات من نفس زرع ينبغي أن تكون ثابتة ومعالجتها لفي الموقع التهجين.
  3. تحديد حيث يتم نسخها LG1 في البرية من نوع الأشقاء، عن طريق أداء LG1 في الموقع التهجين 6 و 26 و 27. قياس موقف تراكم نسخة LG1 من قاعدة منشم ورقة في عينات متعددة (الشكل 1E).
  4. استنادا إلى بيانات التهجين، واختيار جزء من بريمو ورقةrdium تشمل المنطقة حيث كتب LG1. في هذه الحالة، 400-900 ميكرون من قاعدة فترة تتابع النمو 6 أوراق براعم (المستطيلات الأرجواني، الشكل 2A).
  5. Microdissect اختيار جزء من براعم نبات، كما هو موضح في القسم 3.5، وجمع LG1-R والبرية من نوع العينات في أنابيب منفصلة.

6. تطبيق استخراج الحمض النووي الريبي العازلة

  1. تطبيق 50 ميكرولتر عازلة استخراج الحمض النووي الريبي إلى الأنسجة microdissected والمضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي. تواصل مع استخراج الحمض النووي الريبي، والتضخيم، RNA، بناء مكتبة، والتسلسل والتحليل المعلوماتية الحيوية كما هو موضح في اشارة 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام نظام LM المبين في الشكل 2، ما يقرب من 1،000،000-1،500،000 ميكرون 2 من الأنسجة تم جمعها عن كل تكرار في كل خلية طبقات LM (الشكل 5)، و 200،000 ميكرون 2 في تكرار للبشرة LM متجه نحو المحور. تقريبا تم جمعها 2،500،000 ميكرون 2 من الأنسجة لكل تكرار في LM من LG1-R والبرية من نوع براعم نبات. جولتين من التضخيم RNA الخطي أسفرت ميكروجرام كميات من الحمض النووي الريبي لكل تكرار. فإن المبلغ من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من أي تسليخ مجهري نظرا يعتمد على حجم الخلية والنشاط النسخي فضلا عن كمية من الأنسجة التي تم التقاطها. وعلى سلامة الحمض النووي الريبي يؤثر على كفاءة التضخيم الحمض النووي الريبي.

تم تحليل تراكم نسخة في جميع طبقات الخلايا للشفرة والمناطق اللسيناء وغمد وما مجموعه 2359 DE جنرالتم العثور على وفاق، مع معدل كاذبة اكتشاف (روزفلت) من <0.05 (الشكل 6A). على وجه التحديد، كانت 1،714 الجينات DE بين اللسيناء وشفرة، وكانت 1044 الجينات DE بين اللسيناء وغمد، وكانت 657 الجينات DE بين النصل والغمد (بعض الجينات دي في المقارنة أكثر من واحد). تم تصنيف الجينات كما upregulated في المنطقة اللسيناء إذا كانوا upregulated بشكل ملحوظ في كل من اللسيناء مقارنة شفرة واللسيناء مقارنة مع غمد. في LM جميع طبقات الخلايا، وupregulated 373 الجينات بشكل كبير في المنطقة اللسيناء.

تم تحليل تراكم نسخة في البشرة البيضاء، اللسيناء وغمد المناطق متجه نحو المحور وتم العثور على ما مجموعه 3128 الجينات DE. كانت 1،971 الجينات DE بين اللسيناء وشفرة، وكانت 2032 الجينات DE بين اللسيناء وغمد، وكانت 871 الجينات DE بين النصل والغمد (الشكل 6B). تم upregulated 287 الجينات بشكل كبير في اللسيناء مقارنة شفرة والجيش الشعبي غمد idermis.

وتعرض البيانات للجينات منتقاة التي upregulated في المنطقة اللسيناء في الجدول (1) والشكل (7). وأشار أولية في تحليل الموقع التهجين أن النصوص LG1 تتراكم على وجه التحديد في PLB واللسيناء الناشئة من النوع البري ورقة براعم، والتي LG1 وكتب أكثر شدة في البشرة من طبقات الخلايا في الداخلية (الشكل 6C). وLM بيانات الحمض النووي الريبي وما يليها التي تم الحصول عليها متسقة مع هذه النتيجة. تراكم نسخة LG1 هو أعلى بكثير في اللسيناء مما كانت عليه في أي شفرة أو غمد في كل من LM البشرة و LM من جميع طبقات الخلايا (الجدول 1، الشكل 7A). LG1 ديه الاجتماع التحضيري للمؤتمر العالي في تحليل البشرة مما كانت عليه في تحليل جميع طبقات الخلايا، على غرار السيناريو هو موضح في الشكل 8C.

gether.within الصفحات = "1"> تم upregulated NS1 بشكل كبير في المنطقة اللسيناء في كل من كافة طبقات الخلايا LM والبشرة LM متجه نحو المحور (الجدول 1، الشكل 7B). وقد تأكدت هذه النتيجة عن طريق التهجين في الموقع، مما يدل على ان نص NS1 يتراكم على وجه التحديد في غيض من اللسيناء الناشئة (الشكل 6D). NS1 لديه عدد أكبر بكثير قراءة في البشرة فقط تحليل LM من في LM من جميع طبقات الخلايا (19.6 CPM و 2.7 الاجتماع التحضيري للمؤتمر، على التوالي) بسبب التخفيف من النص في LM جميع الطبقات. ويتضح هذا الأثر في تخفيف الشكل 8A. وبالمثل، GRMZM2G101682، جين وظيفة غير معروفة، وكان وسيلة قراءة أعلى عدد في LM البشرة اللسيناء مما كانت عليه في جميع طبقات LM (الجدول 1، الشكل 7C). في الموقع كشفت التهجين أن هذه النسخة الجينات يتراكم أيضا بشدة في خلايا البشرة (الشكل 6E). كانت زينب هانم PIN1a ليس كثيرا DE في تحليل جميع طبقات الخلايا، ولكن تم upregulated بشكل ملحوظ في اللسيناء في تحليل البشرة فقط (الجدول 1، الشكل 7D). وهذا هو الأرجح بسبب ZM PIN1a يتم التعبير غاية في أنسجة الأوعية الدموية وهذا التعبير الأوعية الدموية المستمدة L2 يفند الاختلافات في تراكم ZM PIN1a في البشرة عندما يتم جمع كل طبقات الخلايا (الشكل 6F). ويصور سيناريو مماثل في الشكل 8B.

لتحديد الجينات التي هي دي في المسوخ LG1-R، وتمت مقارنة تراكم نص في منطقة محددة من النوع البري وLG1-R P6 براعم نبات. وكانت وتسعين ستة جينات DE في LG1-R (روزفلت <0.05)؛ تم downregulated 59 في المسوخ LG1-R، وكانت upregulated 37. بيانات عن جينات منتقاة التي هي دي في <م> يتم عرض المسوخ LG1-R في الجدول 2. bel14 هي واحدة من 34 الجينات التي على حد سواء upregulated في المنطقة اللسيناء في البرية من نوع نبات براعم وdownregulated في المسوخ LG1-R. في الوضع الطبيعي وأكد التهجين أن النصوص bel14 تتراكم في المنطقة preligule في النباتات البرية من نوع ولكن ليس في المنطقة المقابلة لLG1-R رقة براعم 6.

الشكل 2
الشكل 2: مخطط لتسليخ مجهري ليزر من المجالات البدائية ورقة. (A) المقطع الطولي الجانبي للقمة الذرة تبادل لاطلاق النار المجهزة للLM. وتشير صناديق مناطق مختارة لتسليخ مجهري. وقد microdissected اللسيناء الأنسجة المنطقة (المربع الأحمر) من 100 ميكرون مستطيلات عالية، تركزت على PLB. وقد اتخذ قبل شفرة (الخضراء) والأنسجة قبل غمد (الأزرق) من 100 ميكرونمستطيلات 50 ميكرون فوق وتحت اختيار preligule على التوالي. للمقارنة من النوع البري وترنسكربيتوم LG1-R، الأنسجة بين 400-900 ميكرون من قاعدة P6 رقة براعم كان microdissected من المقاطع الجانبية (الأرجواني خط متقطع). (ب) عن قرب من P7 منشم ومناطق مختارة لتسليخ مجهري من جميع طبقات الخلايا. (C) عن قرب من P7 منشم ومناطق مختارة لتسليخ مجهري من البشرة متجه نحو المحور. (D) Preligule منطقة P7 منشم قبل تسليخ مجهري. رأس السهم يشير إلى موقف من بدء اللسيناء. ويشير (E) خط أحمر المنطقة المحددة لتسليخ مجهري. سوف الليزر قطع على طول هذا الخط. وتشير الدوائر النقاط التي نبضات الليزر سوف المنجنيق الأنسجة. (F) منشم بعد تسليخ مجهري. وتشير الدوائر نقاط حيث قفزت نبضات الليزر الأنسجة. SAM = تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي. P يشير عدد فترة تتابع النمو. الحانات النطاق = 100 &# 181؛ م. تم تعديل هذا الرقم من الإشارة 6 (الجمعية الأمريكية حقوق الطبع والنشر علماء الأحياء النباتية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
يؤثر المنطقة المحددة لLM التهم قراءة عن الجينات التي DE طول منشم ورقة: الرقم 3. (أ) تحديد المواقع بدقة من المنطقة المحددة لLM نسبة إلى المعالم المورفولوجية يقلل الاختلاف عن الجينات التي أعرب عنها في التدرج على طول محور ورقة. في مكررات 1-3 على اليسار، وتتركز الاختيارات على اللسيناء الناشئة مما أدى إلى تباين منخفضة. في مكررات 1-3 على الحق، وتحديد المواقع من المنطقة المحددة لLM غير متناسقة مما أدى إلى زيادة التباين. (ب) Microdissecting على الصورة بحجم باستمرارالانتخابات يقلل الاختلاف (يعيد 1-3 على يسار) بالمقارنة مع microdissecting تحديدات مختلفة الحجم (يعيد 1-3 على اليمين) لجينات مع أنماط التعبير عن اللسيناء محددة. وأكثر تضعف النصوص في اختيار أكبر، مما أدى إلى عدد أقل قراءة، وأكثر تركيزا في اختيار أصغر، مما أدى إلى عدد أعلى قراءة. وتمثل الرسوم المقاطع الطولية من خلال براعم نبات في المنطقة اللسيناء. يشير السهم الشروع اللسيناء. الاجتماع التحضيري للمؤتمر = التهم لكل مليون. SD = الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تشريح الشتلات الذرة لقطاعات جانبية. (A) الشتلات الذرة القديمة الأسبوع اثنين ورفعه في مفترق الجذور تبادل لاطلاق النار. إزالة شرائح رقيقة الابأوم قاعدة تبادل لاطلاق النار (1) حتى بيضاوية صغيرة من دقاق الفحم مرئيا في قاعدة تبادل لاطلاق النار. جعل عرضية قطع ما يقرب من 10 مم فوق قاعدة (2) والإبقاء على هذه الاسطوانة. (ب) اسطوانة من الأنسجة الموجهة ذلك قاعدة يكون مواجها لها. ملاحظة البيضاوي دقاق الفحم محاطة رقة. جعل اثنين من التخفيضات طولية موازية للمحور الأفقي (3 و 4). الاحتفاظ بها وإصلاح شريحة الوسطى من الأنسجة، وسيتضمن هذا الجزء من SAM وبراعم أوراق الشباب. (C) كارتون توضح الطائرة من الباب الجانبي (أخضر متقطع خط) خلال قمة تبادل لاطلاق النار. وتشير دائرة حمراء الضلع الأوسط، رأس السهم الأحمر يشير إلى هامش منشم ورقة رمادية. أزرق متقطع السطر: محور الضلع الأوسط الهامش. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل (5): الكرتون توضح تجميع ليزر الأنسجة microdissected للتكرار واحد من المنطقة اللسيناء. وتجميع الأنسجة microdissected 5-6 الشرائح لكل تكرار. وتستخدم خمسة أقسام متوسط ​​من كل شريحة وصنع هدفين التحديدات (المستطيلات الحمراء) من كل قسم. كل مستطيل هو ما يقرب من 20000 ميكرون 2. يتم جمع الأنسجة لكل تكرار في أنبوب منفصل (البيضاوي الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: عدد الجينات دي في مقارنة، بحث بين المناطق ورقة و التهجين من الجينات DE مختارة في. (أ) عدد من الجينات دي في مقارنة، بحث بينشفرة، اللسيناء وغمد المناطق، LM من جميع طبقات الخلايا. (ب) عدد من الجينات دي في مقارنة، بحث بين شفرة، اللسيناء وغمد المناطق، LM البشرة متجه نحو المحور فقط. (C) LG1 في الموقع التهجين. (D) NS1 في الموقع التهجين. (E) GRMZM2G101682 في الموقع التهجين. (F) ZmPIN1a في الموقع التهجين. DE: أعرب تفاضلي. حتى في L: حتى في اللسيناء، حتى في B: حتى في النصل. حتى في S: حتى في غمد. النصال في CF تشير اللسيناء الظهور. السهم في F يشير إلى تراكم نسخة في أنسجة الأوعية الدموية. الحانات النطاق = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من الإشارة 6 (الجمعية الأمريكية حقوق الطبع والنشر علماء الأحياء النباتية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ر = "الشكل 7" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
الرقم 7: التمثيل البياني للبيانات لجينات DE المحدد. ويوضح الشكل البيانات الواردة في الجدول رقم 1 ونتائج التهجين. وتمثل الرسوم المقاطع الطولية من خلال براعم نبات. ويشير الأزرق الداكن تراكم نسخة لجين معين. وتشير صناديق خضراء، حمراء وزرقاء المنطقة المحددة لتسليخ مجهري لعينة شفرة، اللسيناء وغمد. رسوم متحركة على اليسار توضح LM من جميع طبقات الخلايا. الرسوم على اليمين توضح LM البشرة متجه نحو المحور فقط. إعلان: متجه نحو المحور البشرة، أب: البشرة مجافي المحور، CPM: التهم لكل مليون نسمة، وتشير النجمة فرق كبير بين اثنين من المجالات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
الرقم 8: كارتون توضح كيفية قراءة التهم عن الجينات DE افتراضية تختلف باختلاف مناطق محددة تم اختيارها لتسليخ مجهري. (A) جين مع التعبير عن اللسيناء محددة. (ب) الجينات التي أعرب عنها في اللسيناء وفي أنسجة الأوعية الدموية. (C) جين أعرب تحديدا في منطقة اللسيناء في جميع طبقات الخلية ولكن مع ارتفاع التعبير في البشرة. (D) جين أعرب في المنطقة اللسيناء، المستمدة L2 طبقات الخلية فقط. وتمثل الرسوم المقاطع الطولية من خلال براعم نبات. ويشير الأزرق الداكن تراكم نسخة لجين معين. وتشير صناديق خضراء، حمراء وزرقاء المنطقة المحددة لتسليخ مجهري لعينة شفرة، اللسيناء وغمد. رسوم متحركة على اليسار توضح LM من جميع طبقات الخلايا. الرسوم على اليمين توضح LM البشرة متجه نحو المحور فقط. إعلان: البشرة متجه نحو المحور، أب: البشرة مجافي المحور، CPM: فصول التوجيه الجامعي اليلة لكل مليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: تحديد الجينات upregulated في اللسيناء البدائي. التهم لكل مليون: التهم لكل مليون مجموع النصوص، يعني من ثلاث مكررات، logFC = سجل قاعدة 2 تغيير أضعاف، FDR.BH: معدل اكتشاف كاذبة وفقا لBenjamini وهوشبرج الأسلوب. جميع طبقات: LM من جميع طبقات الخلايا. البشرة: LM من البشرة متجه نحو المحور فقط. تم تعديل هذا الرقم من الإشارة 6 (الجمعية الأمريكية حقوق الطبع والنشر علماء الأحياء النباتية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

ه 2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
الجدول 2: تحديد الجينات دي في المسوخ LG1-R. التهم لكل مليون: التهم لكل مليون مجموع النصوص، يعني من ثلاث مكررات، logFC = سجل قاعدة 2 تغيير أضعاف، FDR.BH: معدل اكتشاف كاذبة وفقا لBenjamini وهوشبرج الأسلوب. تم تعديل هذا الرقم من الإشارة 6 (الجمعية الأمريكية حقوق الطبع والنشر علماء الأحياء النباتية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصميم التجريبي هو عامل حاسم في تجارب الحمض النووي الريبي وما يليها. الاعتبارات الأساسية هي المجال الدقيق (ق) ومرحلة النمو (ق) ليتم تحليلها، وستبذل ما المقارنات. ومن الأهمية بمكان أن نفكر في المقارنات، لأن الإخراج هو عادة قائمة من الجينات التي DE بين اثنين أو أكثر من الشروط. كما هو الحال مع كل التجارب، فمن المهم أن تغير متغير واحد فقط في المرة الواحدة. على سبيل المثال، عند مقارنة المجالات أوراق مختلفة، ويترك من ينبغي مقارنة من نفس العمر ومرحلة التطوير، ونمت في ظل نفس الظروف.

وكان الهدف من هذه التجارب لتحديد الجينات التي هي على وجه التحديد حتى- أو ينظم إلى أسفل في المنطقة اللسيناء البرية من نوع نبات براعم، وتحديد الجينات التي هي دي في المسوخ LG1-R بالمقارنة مع النوع البري. علينا أولا دراسة مورفولوجية تطوير براعم الأوراق ونمط التراكم نسخة LG1. هذه المعالم المورفولوجية والجزيئية ثتستخدم يحرث لتحديد مجالات محددة لLM 14 و 15 و 16. في التجربة الأولى، وتمت مقارنة تراكم نص في المنطقة اللسيناء إلى مناطق أخرى من نفس براعم نبات، وبالتالي القضاء على الخلافات بسبب ظروف النمو والخلفية الوراثية، مرحلة التطوير، والاختلاف محطة إلى محطة. لمقارنة متحولة إلى البرية من نوع، فمن الضروري تحديد أين ومتى يتم التعبير عن الجينات في المصالح. نوصي تحليل نمط التعبير إما عن طريق التهجين الموضعي أو immunolocalization في وتحديد منطقة لLM يشمل مجال التعبير الجيني. من المهم أن المجالات تعادل تتم مقارنة وأن الخلفية الوراثية هو نفسه بالنسبة لكلا متحولة والنوع البري.

يمكن التحقق من دقة microdissections عن طريق فحص التهم قراءة عن الجينات التي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في مجال الاهتمام، إذا سوومن المعروف أن الجينات CH. ويمكن أيضا أن يتم ذلك عن طريق إجراء RT-PCR على الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنسجة LM قبل اتخاذ المكتبات في التسلسل. في وصف التجارب هنا، وخدم LG1 كعنصر تحكم لLM المنطقة اللسيناء، منذ ذلك الحين في الموقع التهجين التحليلات أظهرت أن التعبير LG1 تقتصر على PLB واللسيناء 5، 6 الناشئة.

خلافا لأساليب مثل RT-QPCR، حيث الجين مرشح (ق) يجب أن يكون معروفا، RNA وما يليها يقيس تراكم كل النصوص في عينة نسيج معين. وهكذا، LM RNA وما يليها هو طريقة مفيدة لتحديد الجينات مرشح. مثال من هذه الدراسة هو GRMZM2G101682، جين وظيفة غير معروفة لديه المضربين-اللسيناء محدد نمط التعبير (الشكل 6E). كما حددت هذه الدراسة الجينات التي هي دي في LG1-R، مثل bel14، التي لم يسبق تورطت كما يتصرف المصب من LG1. في ثيالصورة سبيل المثال، كانت المقارنة بين مجموعات البيانات متعددة (upregulated في المنطقة اللسيناء من النوع البري وDE في LG1-R) بالمعلومات بشكل خاص. من المهم أن نلاحظ أن نمط التعبير عن الجينات لا تثبت وظيفتها: يطلب من التحليلات الجينية و / أو الكيمياء الحيوية اللاحقة لإنشاء وظيفة الجين.

التحليلات Transcriptomic التي تركز على، المجالات التنموية منفصلة صغيرة، والتي تختلف بشكل مختلف ويرسم بسهولة، هي الأكثر نجاحا. LM RNA وما يليها هو الطريقة المناسبة لمثل هذه التحليلات ولديه القدرة على تطبيقها على العديد من الظواهر التنموية. هي مناسبة بشكل خاص لتحديد التعبير الجيني الفرق في المسوخ من الجينات التي قيدت مكانيا أنماط التعبير، أو المسوخ التي تؤثر على تطوير هياكل محددة. ويمكن أيضا أن تطبق على العمليات التي تحدث في خلايا أو أنسجة معينة ومحددة، مثل البشرة أو الأوعية الدموية، واستخدمت فيتحليل transcriptomic من الذرة تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي (SAM) تطور الجنين 16. فمن أقل ملاءمة لدراسة وظيفة الجينات التي يتم التعبير عنها بتواجد مطلق أو العمليات التي تحدث في جميع الخلايا. وقد تم تطبيق الأساليب المقدمة هنا بنجاح لمجموعة متنوعة من الأنواع النباتية (الذرة، الذرة الرفيعة، باستخدام الزيوت، النعناع وأنف) وهياكل (براعم نبات، الخلايا الإنشائية، جذور وtrichomes).

ليس مطلوبا LM عندما ينطوي على تحليل مجالات كبيرة نسبيا. في الواقع، وقد استخدم RNA تسلسل على تشريح اليد أو كلها أجهزة بنجاح لتحديد الجينات دي في النباتات 14 و 15. هذا النهج لديه ميزة كونها عمالة أقل وليس هناك حاجة تجربة مع التقنيات النسيجية. ومع ذلك، هناك قيود على دقة تشريح اليد، وهذا يعني أن تشريح اليد أقل ملاءمة لدراسة د المبكرعمليات evelopmental.

ليحلل ناجحة LM RNA تسلسل الظواهر التنموية، والسياق التنموي يجب أن تتسم أيضا. نحن نعتقد بأن إجراء الفحص النسيجي شامل للعملية أو مجال اهتمام قبل التخطيط تجربة. الأنسجة من عينات المجهزة للLM ضعيفة بشكل عام، حيث أن الأنسجة هي غير ملوثين ولا شنت مع زلات غطاء التي توفر العمق من الميدان. ولذلك، فإنه من المفيد لإصلاح عينات منفصلة لتلطيخ والمراقبة في نفس الوقت كما هي ثابتة عينات LM (الشكل 1C، وD).

RNA تم الحصول عليها من المواد LM مجزأ عموما والمحصول الكلي منخفضا 8. مطلوب خطوة التضخيم لتوليد RNA كاف للتحضير مكتبة 28. ينبغي تقييم RNA طول القطعة بعد التضخيم وقبل جيل مكتبة. متوسط ​​طول جزء من ذاتهveral مئات من أزواج قاعدة يعتبر عموما جيدة، 500 أزواج قاعدة ممتازة. قد يؤدي العائد RNA الفقراء إذا الأنسجة ليست ثابتة بشكل جيد، وإذا حدث تدهور بسبب ريبونوكلياز التلوث، أو إذا تم تخزين كتل البارافين بشكل غير صحيح. ومن المفيد لاختبار نوعية الأنسجة الثابتة من خلال إجراء LM محاكمة مساحة كبيرة نسبيا قبل تكريس الكثير من الوقت لmicrodissecting المجالات صغيرة جدا. لأن الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خلايا LM مجزأ والتضخيم باستخدام بنسبة ضئيلة DT التمهيدي يدخل قوي 3 "التحيز، وهذه الطريقة ليست مناسبة للكشف عن النصوص البديلة مثل المتغيرات لصق. ولا هو LM مناسبة للكشف عن الرنا الصغيرة.

طريقة بديلة لقياس تراكم نسخة في أنسجة معينة أو المجالات الخلوية RNA وما يليها من خلايا مفصولة الإسفار خلية المنشط للفرز (FACS) 21. يتطلب هذا الأسلوب عموما تحديد الجين علامة مناسبة للمنطقة من الفائدة،جيل من النباتات المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين فلوري الموسومة وprotoplasting. وقد استخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية جنبا إلى جنب مع ميكروأري لتوليد خريطة تعبير عن جذر نبات الأرابيدوبسيس عن طريق فصل الخلايا معربا عن نوع محدد خلية المروجين في جذر 22، 23. FACS الأنسجة تبادل لاطلاق النار هو أكثر صعوبة من أنسجة الجذر بسبب الكلوروفيل تألق ذاتي 24. وجود قيود على LM هو أن مجال الاهتمام يجب أن يكون التعرف عليه في أقسام النسيجية. قد يكون نظام مراقبة الأصول الميدانية وسيلة أكثر ملاءمة في الحالات التي يكون فيها الجين علامة مناسبة متاحة. واختيار أي خلايا أو أنسجة لعزل ومقارنة اعتبار مهم في التحليلات transcriptomic التي تستخدم إما نظام مراقبة الأصول الميدانية أو LM.

البيانات المقدمة هنا توضح أنه سيتم الحصول على نتائج مختلفة تبعا لمجالات محددة تم اختيارها لLM (الشكل 3، الشكل 8). نسخ من الجينات التي يتم التعبير عنها في واحد أو عدد قليل من الخلايا، مثل ns1 و سوف تضعف عندما يتم تحليل المجالات الأنسجة كبيرة. ومن المرجح أنه إذا تم أخذ عينات من براعم ورقة كاملة، لن يتم الكشف عن نسخة NS1. وupregulated ZmPIN1a بشكل ملحوظ في اللسيناء مقارنة النصل والغمد البشرة ولكن مرتبك هذا الفرق التعبير الأوعية الدموية عندما يتم أخذ عينات جميع طبقات الخلايا. على العكس من ذلك، لن يتم الكشف عن الجينات التي يتم التعبير عنها فقط في طبقات الخلايا المشتقة L2 عندما يتم أخذ عينات فقط على البشرة (الشكل 8D). وتوضح هذه الدراسة أنه في حين LM RNA تسلسل هو أداة قوية للكشف عن الاختلافات في التعبير الجيني أثناء التشكل، والمجالات المختارة للتحليل هي حاسمة لنجاح التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

الكتاب أشكر S. نازلي لالجارية التعاون وتحفيز المناقشات حول تنمية اللسيناء. ويؤيد هذا العمل من قبل الوطنية للعلوم منح مؤسسة MCB 1052051 وIOS-1848478.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl pyrocarbonate Sigma-Aldrich 159220 Used for RNase treatment of solutions
Razor blades  Electron Microscopy Sciences 72000
RNase Zap Sigma-Aldrich R2020-250ML RNase decontamination solution
Ethanol absolute 200 proof Fisher Scientific BP28184
Acetic acid, glacial Sigma-Aldrich A6283
Glass vials - 22 ml VWR 470206-384
Xylenes, histological grade Sigma-Aldrich 534056-4L
Paraplast plus Sigma-Aldrich P3683-1KG
Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm VWR 15154-072
Embedding rings VWR 15154-303
Silica gel packets Electron Microscopy Sciences 71206-01 Desiccant for storage of paraffin blocks
Oven Fisher Scientific 15-103-0503 Oven must maintain temperature of 60 °C
Paraffin embedding station Leica  EG1160
Microtome Leica  RM2235
Slide warmer Electron Microscopy Sciences 71317-10
Coplin jars Electron Microscopy Sciences 70316-02
Laser microdissector Zeiss
KIMWIPES™ Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34120 Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides
Membrane Slide 1.0 PEN Zeiss 415190-9041-000 Slides for laser microdissection
Adhesive Cap 200 opaque Zeiss 415190-9181-000 Tubes for laser microdissection
PicoPure RNA Isolation Kit ThermoFisher Scientific KIT0204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
  2. Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
  3. Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
  4. Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
  5. Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
  6. Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  7. Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
  10. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
  11. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  12. Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
  13. Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
  14. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  15. Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
  16. Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
  17. Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
  18. Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
  19. Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
  20. Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
  21. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  22. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  23. Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
  24. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  25. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
  26. Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
  27. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
  28. Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 121، ليزر تسليخ مجهري، RNA وما يليها، Transcriptomics، التصميم التجريبي، والتنمية النبات، ورقة، التشكل، الذرة
تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, R. M., Sylvester, A. W.,… More

Johnston, R. M., Sylvester, A. W., Scanlon, M. J. Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development. J. Vis. Exp. (121), e55004, doi:10.3791/55004 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter