Abstract
Genen met een belangrijke rol in de ontwikkeling hebben vaak ruimtelijk en / of tijdelijk beperkte expressie patronen. Vaak zijn deze gen-transcripten worden niet gedetecteerd of niet geïdentificeerd als differentieel tot expressie (DE) in transcriptoom analyses van de hele plant organen. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is een krachtig hulpmiddel om genen die DE zijn in specifieke ontwikkelingsstoornissen domeinen te identificeren. De keuze van cellulaire domeinen microdissect en vergelijken, en de nauwkeurigheid van de microdissections zijn cruciaal voor het succes van de experimenten. Hier zijn twee voorbeelden illustreren ontwerp overwegingen voor transcriptomics experimenten; LM een RNA-seq analyse van genen die gede langs de maïs blad proximale-distale as bepalen en een tweede experiment om genen die in DE liguleless1-R (LG1-R) identificeren mutanten vergeleken met wild type. Sleutelelementen die hebben bijgedragen aan het succes van deze experimenten werden histologische en si gedetailleerdetu hybridisatie analyses van het gebied te analyseren, winkelwagentje bladprimordia bij equivalente ontwikkelingsstadia, het gebruik van morfologische bezienswaardigheden gebieden selecteren voor microdissectie en microdissectie van nauwkeurig afgemeten domeinen. Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol voor de analyse van ontwikkelings-domeinen door LM RNA-Seq. De hier gepresenteerde gegevens illustreren hoe de geselecteerde regio voor microdissectie de resultaten beïnvloedt.
Introduction
Maïs blad een ideaal model voor de vorming van ontwikkelings- gebieden te bestuderen bij morfogenese, aangezien het een duidelijke grens tussen het mes en schede die vatbaar is voor genetische dissectie (Figuur 1A). Tijdens de vroege stadia van bladontwikkeling, een lineaire band kleinere cellen, de preligule band (PLB), verdeelt het blad primordium in vooraf blad en pre-mantel domeinen. Een pony-achtig tongetje en driehoekige oorschelpen ontwikkelen van de PLB (Figuur 1 A, C, D). Genetische screens hebben geïdentificeerd mutaties die het mes-schede grens verstoren. Bijvoorbeeld recessieve liguleless1 (LG1) mutaties te verwijderen en de ligule oorschelpen 1, 2, 3, 4 (figuur 1B). In situ hybridisatie toonde dat LG1 transcript ophoopt op de PLB en opkomende tongetje, waardoor het een uitstekende marker voor tongetje ontwikkeling 5, 6 (figuur 1E).
Figuur 1: Wild-type en liguleless1-R maïs bladeren. (A) Blade-omhulsel grensgebied van volwassen wild-type blad met tongetje en oorschelp structuren. (B) Blade-omhulsel grensgebied van volwassen liguleless1-R blad met afwezigheid van tongetje en oorschelp structuren. Bladeren in A en B zijn gesneden in de helft langs de hoofdnerf. (C) langsdoorsnede door wild-type blad primordium. Monster is verwerkt en gekleurd voor histologische analyse. Het initiërende tongetje blijkt als een bult uitsteekt uit het vlak van het blad (pijlpunt). (D) Longitudinal sekteion door middel van wild-type blad primordium. Monster is verwerkt LM zoals beschreven in de tekst. Arrowhead geeft initiëren tongetje. (E) LG1 in situ hybridisatie van shoot apex laterale langsdoorsnede. Sterretjes geven LG1 transcript ophoping aan de PLB van de P6 blad primordium. Pijlen geven voet van P6 primordium. Bar geeft meting van de basis van de primordium de PLB. Schaalbalk in A en B = 20 mm. Schaal bars in CE = 100 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In deze studie werd LM RNA-Seq gebruikt om een reeks van genen die differentieel tot expressie (DE) geeft bij het mes omhulsel grens ten opzichte van andere delen van het blad primordium en ide ntify genen die in DE LG1-R mutanten ten opzichte van wild-type broers en zusters. LM RNA-Seq is een werkwijze voor het kwantificeren transcript accumulatie in specifieke cellen of cellulaire domeinen 7. LM systemen combineren een laser en een microscoop met een digitale camera. Doorsnede weefsel wordt aangebracht op objectglaasjes en bekeken door de microscoop. De LM-software bevat meestal tekentools waarmee de gebruiker kan worden geselecteerd gebied te schetsen voor microdissectie. De laser snijdt langs de lijn, en het gekozen weefsel wordt gekatapulteerd van de glijbaan en in een buis boven de dia opgeschort. LM kan de gebruiker nauwkeurige domeinen, inclusief specifieke cellagen en zelfs individuele cellen 8, 9 microdissect. RNA kan dan worden geëxtraheerd uit het weefsel gemicrodissecteerde. Vervolgens worden de RNA-component gebruikt Seq volgende generatie sequencing van cDNA-bibliotheken gegenereerd uit het geëxtraheerde RNA sequentie 10,= "xref"> 11.
Belangrijkste voordelen van LM RNA-seq zijn de mogelijkheid om transcript ophoping kwantificeren welbepaalde domeinen en het vermogen om de hele transcriptoom gelijktijdig 7 profileren. De techniek is bijzonder geschikt voor probing vroege ontwikkelingsgebeurtenissen wanneer het interessegebied vaak microscopisch. Eerdere studies hebben gebruikt LM gecombineerd met microarray technologie ontwikkelingsprocessen te bestuderen in planten 9, 12, 13. RNA-Seq heeft het voordeel kwantificeren transcripten over een breed dynamisch bereik, waaronder lage-genen tot expressie, en voorafgaande sequentie-informatie is niet vereist 10, 11. Bovendien LM RNA-Seq heeft het potentieel om ontwikkelings belangrijk genen die kunnen ontbreken in mutagenese schermen door genetische redundantie of letaliteit van het verlies-van- markerenfunctie mutant.
Ontwikkelings belangrijk genen, zoals smalle sheath1 (NS1) en bekervormige cotyledon2 (cuc2), vaak specifieke expressiepatronen van slechts één of enkele cellen 17, 18, 19, 20. Velen zijn uitgedrukt alleen tijdens de vroege ontwikkelingsstadia en niet in het rijpe orgaan. Wanneer gehele organen of grote domeinen worden geanalyseerd, worden deze celspecifieke transcripten verdund en kunnen niet meer conventionele analyses worden gedetecteerd. Door toe te staan analyses van precies gedefinieerde domeinen, LM RNA-Seq maakt deze weefsel-specifieke genen te identificeren en te kwantificeren.
Cruciaal voor het succes van de hier beschreven experimenten een grondige histologische analyse dat de selectie van de geschikte ontwikkelingsstadium en domein voor analyse geleid en nauwkeurige MeasureMent van celweefsel domeinen LM. Opdat equivalente domeinen bemonsterd over alle replicaten werd weefsel vanuit bladprimordia in hetzelfde ontwikkelingsstadium en gemicrodissecteerde domeinen opzichte van morfologische oriëntatiepunten gemeten zoals de opkomende ligule (figuur 2). Het is bekend dat sommige genen tot expressie gebracht in een gradiënt van de top tot de basis van het blad. Door het meten van nauwkeurige domeinen variëren door bemonstering vanaf verschillende plaatsen langs het blad proximaal-distale as werd minimaal gehouden (figuur 3A). Door microdissecting domeinen van dezelfde grootte, variatie door het differentiële verdunning van celspecifieke transcripten werd verlaagd (Figuur 3B). Zijdelingse langsliggers die de shoot apex gebruikt voor microdissections. Deze doorsneden loodrecht op de hoofdnerf marge as (Figuur 4). Met alleen secties die de SAM bevatten zorgt ervoor dat gelijkwaardige laterale regio's vanbladprimordia worden geanalyseerd.
In monsters verwerkt en deelbaar LM, de eerste morfologische tekenen van uitgroei tongetje een bult op de adaxiale kant door periclinale celdelingen in de adaxiale epidermis (figuur 1D, figuur 2). Er werd vastgesteld dat de opkomende ligule betrouwbaar kan worden geïdentificeerd plastochron 7 stadium bladprimordia. We waren geïnteresseerd in genen die tot expressie in het gehele tongetje regio, inclusief de nieuwe tongetje en de cellen onmiddellijk distaal dat de oorschelp vormen. Om te waarborgen dat gelijkwaardige weefsel selecties gemaakt, werd het tongetje bult als morfologisch landmark en 100 urn rechthoek gecentreerd op de ligule bult werd geselecteerd LM (figuur 2A, 2B). Equivalent sized rechthoeken van pre-blad en pre-mantel geselecteerd uit dezelfde bladprimordia.
Analyses van liguleless mutant planten presenteerde een andere challeNSE; LG1-R mutanten geen tongetje dus deze morfologische eigenschap kan niet worden gebruikt om het gebied te selecteren LM vormen. In plaats daarvan, het domein van LG1 transcript accumulatie in wildtype bladprimordia werd bepaald, en een gebied dat domein zou omvatten gedefinieerd. Deze voorlopige analyses werden uitgevoerd op zaailingen van dezelfde planten als werden gebruikt voor de uiteindelijke analyse, omdat eerder werk heeft aangetoond dat de ligging van de PLB afhankelijk van groeiomstandigheden. In situ hybridisatie aangegeven dat LG1 transcripten accumuleren in de PLB van P6 bladprimordia (figuur 1E). We selecteerden een domein 400-900 urn van de basis van de bladprimordia dat het domein van LG1 expressie (paarse bouwstenen, figuur 2A) omvat en gevangen deze equivalente gebieden van wildtype en LG1-R planten. De variatie in genetische achtergrond en groeiomstandigheden minimaliseren bij vergelijking transcript accumulatie in LG1-R en wild-type planten, scheiden families van mutanten en wild-type broers en zussen werden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Fix weefsel voor histologische analyse tegelijk dat weefsel wordt vastgesteld LM. Onderzoek gekleurde coupes voor morfologische kenmerken die later LM zal begeleiden. Bij het vergelijken mutant met wild-type, uitgevoerd in situ hybridisatie of immuunlokalisatie het domein waar het gen van interesse tot expressie wordt gebracht (hier LG1) definiëren.
1. Tissue Fixatie en verwerking
- Grow flats maïs zaailingen tot twee weken oud zijn onder normale omstandigheden 6.
- Ontleden uiteinden van scheuten van zijprofielen (figuur 4).
- Accijnzen zaailing net onder de bodem lijn.
- Met behulp van een scheermesje, verwijder dunne plakjes van de basis van de stengel (delen 1, Figuur 4A) tot een ovaal van culm omringd door één of twee rijpe bladeren zichtbaar (figuur 4B).
- Maak nog een bezuiniging van ongeveer 10 mm boven de basis (cut 2, Figuur 4A).Deze 10 mm segment zal de SAM en jonge bladprimordia bevatten.
- Draai het segment 10 mm, zodat de onderkant naar boven wijst. Maak twee sneden parallel aan de laterale as, zodat een stukje weefsel 2-3 mm dik wordt verkregen (delen 3 en 4, figuur 4B). Gooi de buitenste twee delen en behouden van de centrale slice voor fixatie en inbedding.
LET OP: buitenste bladeren kunnen worden bijgesneden en weggegooid.
- Fix weefsel en het proces voor het inbedden.
- Zorgen dat alle materialen voor gebruik in daaropvolgende stappen RNase vrij. Behandel oplossingen met diethylpyrocarbonaat (DEPC) (1 ml DEPC per liter oplossing. Incubeer overnacht met af en toe schudden en autoclaaf). Bak glaswerk in een oven bij 200 ° C of hoger gedurende ten minste 6 uur en behandelen kunststofmateriaal met RNase decontaminatie oplossing.
- Dag 1: Dompel weefsel plakjes in ~ 10 ml van Farmer's fix (3: 1 ethanol: azijnzuur) in glazen flacon op ijs. Nadat alle monsters zijn ontleed, gelden stofzm om luchtbellen en hulp penetratie van fixatief te verwijderen. Houd onder vacuüm gedurende 10 min vervolgens het vacuüm langzaam los. Vervang fixatief en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd onder zacht schudden.
- Dag 2: Incubeer in de volgende reeks van oplossingen, ~ 10 ml elk, 1 uur elk, allemaal met voorzichtig schudden; 85% ethanol bij 4 ° C, 95% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 1: 1 ethanol: xyleen bij kamertemperatuur, 100% xylenen bij kamertemperatuur 100% xylenen bij kamertemperatuur.
LET OP: Xylenes zijn giftig bij contact met en inademing. Werk in een zuurkast en het gebruik van de juiste handschoenen. - Voeg paraffine weefselverwerkingsproces medium pellets tot ongeveer het halve volume van xylenen en incubeer overnacht bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Dag 3: Breng de ampul naar 60 ° C oven tot de korrels smelten. Giet oplossing en te vervangen door vers gesmolten weefsel inbedding medium. Verander het medium nog tweemaaltijdens de Dag.
- Dag 4: Change weefselverwerkingsproces medium een keer in de ochtend. Keer terug naar 60 ° C oven tot de middag.
- cast blokken
- Plaats inbedding mallen op hete plaat van weefsel inbedding station. Gebruik een tang om de weefselmonsters te dragen aan de inbedding vormen met het snijvlak naar beneden. Vul de mal met gesmolten paraffine en plaats de verankering ring bovenop de matrijs. Transfer naar een koud bord totdat paraffine is gestold. Bewaar de paraffineblokken bij 4 ° C in een luchtdichte doos met silicagel.
2. Snijden en Slide Voorbereiding
- Snij 10 micrometer secties op een microtoom 25.
- Onderzoek linten en kies mediaan secties. Mediaan secties zijn die welke de SAM, welke als een koepel van cellen omgeven door bladprimordia omvatten.
- Mount secties op dia's.
- Plaats dia's die geschikt zijn voor LM zijn (ofwel RNase vrij ofgebakken) op 42 ° C warmer schuiven en enkele druppels van 50% ethanol-oplossing van toepassing op de dia te dekken.
- Float secties op ethanol-oplossing totdat de secties hebben uitgebreid.
LET OP: Drijvende secties op ethanol oplossing in plaats van water houdt RNA in een neergeslagen staat het verminderen van RNA degradatie. - Kantel glijbaan en verwijder overtollig ethanol-oplossing door aspiratie met een wegwerp overdracht pipet. Gebruik niet-pluizende doekjes om weg lont extra ethanol-oplossing.
- Droge slides bij 42 ° C gedurende enkele uren of een nacht. WINKEL glijdt bij 4 ° C in een luchtdichte doos met silicagel.
- Deparaffinize glijdt op de dag van gebruik.
- Bereid drie glazen Coplin potten bevatten; 100% xyleen (xylenen I), 100% xyleen (xylenen II) en 100% ethanol (~ 50 ml van elke oplossing).
- Met zuivere tang om dia overdragen onderdompelen dia in xylenen I 2 min, xylenen II gedurende 2 minuten en 100% ethanol gedurende 1 minuut.
- drain gleedes on-pluizende doekjes en drogen aan de lucht bij kamertemperatuur.
3. Microdissection van Blade, tongetje en schede Monsters van Plastochron 7 Leaf Primordia
- Zet de dia's op het podium van LM microscoop. Gebruik vijf of zes dia's voor elke repliceren, met gebruikmaking van vijf secties per slide.
OPMERKING: Weefsel gemeenschappelijk gebruik voor een enkele herhaling is weergegeven in figuur 5. - Onderzoek dia's en identificeren van de vijf meest mediaan hoofdstukken over elke dia, met behulp van de SAM apex als centraal referentiepunt.
Opmerking: Dit kan bij lage vergroting, meestal 5X doel voldoende. - Gebruik 10X en 20X objectief, geven de plaats van het tongetje de plastochron 7 blad primordium van elke sectie. Het tongetje is zichtbaar als een bult uitsteekt uit het adaxiale oppervlak van het blad primordium zijn. Markeer deze positie met behulp van de tekening instrument van de LM software; selecteert u het pictogram potlood, de cursor naar de juiste positiaan en klik en sleep de muis om te tekenen.
LET OP: Een 10X of 20X objectief is geschikt voor deze en de volgende stappen. Bij gebruik zijgedeeltes zullen de twee zijden van elk blad primordium aanwezig in elke sectie (Figuur 2A) zijn. - Met de liniaal gereedschap en het rechthoekige tekeninstrument meten 100 urn hoog rechthoeken gecentreerd op de ligule van elke sectie (rode rechthoeken, Figuur 2A, 2B). Deze zullen de "tongetje" monster.
- Om de liniaal tool te gebruiken; selecteert u het pictogram heerser, de cursor naar het ene uiteinde van het te meten object, klikken en slepen om het object te meten. De lengte van de heerser zal worden getoond op het scherm.
- Om een rechthoek te tekenen; selecteert u het pictogram rechthoek, de cursor op een punt dat een hoek van de rechthoek zal zijn, klik en sleep om een rechthoek van de juiste grootte te trekken. Of selecteer de rechte lijn tekenprogramma en teken vier rechte lijnen.
- maatregel 100 pm rechthoeken gepositioneerd 50 pm boven en onder het "ligule" rechthoek.
LET OP: Deze zal de "Blade" en "schede" monsters, respectievelijk (groene en blauwe rechthoeken, figuur 2A, 2B). Op basis van onze histologische gegevens, een 100 pm rechthoek omvat het gehele ligule regio. Equivalente porties van blad en mantel werden zodanig gekozen dat soortgelijke hoeveelheden weefsel werden verzameld voor elk. Afstandhouders van 50 urn werden gebruikt om te voorkomen dat regio tongetje weefsel per ongeluk in het blad of vel microdissections.
- Microdissect gemeten rechthoeken (figuur 2D - 2F) 7, 8, 9, het verzamelen tongetje, Blade en schede monsters in afzonderlijke buizen. Gebruik de lasergesneden functie via weefselsectie langs de omtrek van het geselecteerde domein te snijden. Gebruik de catapult functie om de rechthoek van weefsel voortbewegen van de glijbaan en in het deksel van de buis (figuur 2D - 2F).
4. Microdissection van Blade, tongetje en schede adaxial epidermale Monsters van Plastochron 7 Leaf Primordia
- Selecteer secties en gebruik maken van de heerser hulpmiddel tot 100 micrometer hoog segmenten gericht op de plastochron 7 tongetje te meten, zoals beschreven in hoofdstuk 3 (boven).
- Selecteer alleen de adaxial epidermale cellen van elk 100 micrometer hoog "Blade" en "schede" segment (groen en blauw selecties, figuur 2C) met een overzicht met de tekening tool. De epidermis is de buitenste cellaag; de adaxiale zijde het dichtst bij de SAM.
- Voor de "tongetje" sample, selecteert u alleen de cellen van de opkomende ligule hobbel zoals beschreven in paragraaf 3.3 (rood selectie, figuur 2C).
- Microdissect geselecteerde regio's, het verzamelen van Blade, tongetje en Sheath epidermismonsters in afzonderlijke buizen, zoals beschreven in paragraaf 3.5.
5. Microdissection van Plastochron 6 Leaf Primordia van LG1-R en Wild-type Broers en zussen
- Grow scheiden families van mutant (LG1-R) en wild-type planten.
- Fix en proces shoot toppen voor LM, zoals beschreven in de secties 1,2-1,4. Fix wild-type en mutant uiteinden van scheuten in afzonderlijke flesjes om hen gescheiden te houden. Monsters van dezelfde planten worden gefixeerd en verwerkt voor in situ hybridisatie.
- Bepalen waar LG1 wordt getranscribeerd in wildtype siblings, door het uitvoeren van in situ hybridisatie LG1 6, 26, 27. Meet de positie van LG1 transcript ophoping van de basis van het blad primordium in meerdere monsters (figuur 1E).
- Op basis van in situ hybridisatie data, kiest deel van blad primordium dat omvat de regio waar LG1 wordt getranscribeerd. In dit geval, 400-900 urn van de basis van plastochron 6 bladprimordia (paars rechthoeken, Figuur 2A).
- Microdissect geselecteerd gedeelte van bladprimordia, zoals beschreven in paragraaf 3.5, verzamelen LG1-R en wildtype monsters in afzonderlijke buisjes.
6. Breng RNA Extraction Buffer
- Solliciteer 50 ui RNA-extractie buffer om gemicrodissecteerde weefsel en ga verder met RNA-extractie. Ga verder met RNA-extractie, RNA-amplificatie, bibliotheek bouw, sequencing en bioinformatica analyse zoals beschreven in referentie 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de LM schema geschetst in figuur 2, ongeveer 2 um 1,000,000-1,500,000 weefsel werd verzameld voor elk repliceren in de hele cel-lagen LM (figuur 5), en 200.000 pm2 per nabootsen adaxial de epidermis LM. Ongeveer 2.500.000 urn 2 van weefsel werd verzameld voor elk repliceren in de LM-R van LG1 en wildtype bladprimordia. Twee ronden van lineaire amplificatie RNA leverde microgram hoeveelheden RNA per repliceren. De hoeveelheid RNA die bij een bepaalde microdissectie zal afhangen van celgrootte en transcriptionele activiteit en de hoeveelheid weefsel gevangen. De integriteit van het RNA zal de efficiëntie van de RNA-amplificatie beïnvloeden.
Transcript ophoping werd geanalyseerd in alle GSM lagen van het blad, tongetje en schede regio's en een totaal van 2359 DE genes werden gevonden, met een valse ontdekking tarief (FDR) van <0,05 (figuur 6A). Specifiek, 1714 genen waren DE tussen tongetje en blade, 1044 genen waren DE tussen tongetje en schede en 657 genen waren DE tussen mes en schede (sommige genen DE in meerdere vergelijking). Genen werden geclassificeerd als opgereguleerd in de ligule regio indien zij significant waren opgereguleerd in beide tongetje vergelijking met blad en tongetje vergeleken sheath. In het hele cellagen LM, werden 373 genen significant opgereguleerd in het tongetje regio.
Transcript ophoping werd geanalyseerd in de adaxial epidermis mes, tongetje en schede regio's en een totaal van 3128 DE genen werden gevonden; 1971 genen waren DE tussen tongetje en blade, 2032 genen waren DE tussen tongetje en schede en 871 genen waren DE tussen mes en schede (figuur 6B). 287 genen significant opgereguleerd in de ligule opzichte mes en schede epidermis.
Gegevens voor een aantal genen die worden gereguleerd in de ligule regio worden in tabel 1 en figuur 7. Een eerste in situ hybridisatie analyse aan dat LG1 transcripten accumuleren specifiek in de PLB en de opkomende ligule wildtype bladprimordia en dat LG1 is sterker getranscribeerd in de epidermis in het interne cellagen (figuur 6C). LM RNA-seq data die werden verkregen in overeenstemming met dit resultaat; LG1 transcript accumulatie in de ligule significant hoger dan hetzij blad of vel in zowel de epidermale LM en LM van cellagen (tabel 1, figuur 7A). LG1 een hogere CPM in de epidermale analyse dan bij de analyse van cellagen, vergelijkbaar met het scenario in figuur 8C.
NS1 was significant opgereguleerd in de ligule regio zowel alle cellagen LM en adaxial epidermis LM (Tabel 1, Figuur 7B). Deze bevinding werd bevestigd door in situ hybridisatie, wat aantoont dat NS1 transcript specifiek ophoopt in de punt van de opkomende tongetje (figuur 6D). ns1 een veel hogere gelezen telling in de epidermis alleen LM analyse dan LM van cellagen (19,6 CPM CPM en 2,7, respectievelijk) door verdunning van het transcript in alle lagen LM. Dit verdunningseffect is in figuur 8A. Evenzo GRMZM2G101682, een gen met onbekende functie, een hoger gemiddeld aantal gelezen in de ligule epidermale LM dan in alle lagen LM (tabel 1, figuur 7C). In situ hybridisatie toonde dat dit gen transcript Bovendien accumuleert sterkst in epidermale cellen (figuur 6E). Zm PIN1a niet significant DE in de analyse van alle cellagen, maar was significant opgereguleerd in het tongetje in de epidermis alleen analyse (Tabel 1, Figuur 7D). Dit is waarschijnlijk omdat Zm PIN1a wordt sterk tot expressie gebracht in vasculaire weefsels en het L2-afgeleide vasculaire expressie verwart verschillen Zm PIN1a accumulatie in de epidermis bij alle cellagen worden verzameld (Figuur 6F). Een soortgelijk scenario is in Figuur 8B.
Genen die in DE LG1-R mutanten te identificeren, werd transcript ophoping vergeleken in een bepaald gebied van wildtype en LG1-R P6 bladprimordia. Zesennegentig genen waren in DE LG1-R (FDR <0,05); 59 werden downregulated in LG1-R mutanten, en 37 werden opgereguleerd. Gegevens voor een aantal genen die DE in <em> LG1-R mutanten worden in Tabel 2. bel14 is een van 34 genen die beide zijn opgereguleerd in de ligule regio wildtype bladprimordia en downgereguleerd in LG1-R mutanten. In situ hybridisering bevestigde dat bel14 transcripten accumuleren in de preligule regio in wildtype planten, maar niet in het overeenkomstige gebied van LG1-R bladprimordia 6.
Figuur 2: Regeling laser microdissectie van het blad oer-domeinen. (A) Laterale langsdoorsnede van maïs shoot apex verwerkt voor LM. Vakken geven regio's geselecteerd voor microdissectie. Tongetje regio weefsel (rode doos) werd gemicrodissecteerde 100 micrometer hoog rechthoeken, gecentreerd op de PLB. Pre-blad (groen) en pre-omhulsel (blauw) weefsel is gemaakt van 100 urnrechthoeken 50 pm boven en onder het preligule selectie respectievelijk. Voor de vergelijking van de wild-type en LG1-R transcriptomes, weefsel tussen 400-900 urn van de basis van P6 bladprimordia werd gemicrodissecteerde uit zijprofielen (paarse stippellijn). (B) Close-up van P7 primordium en regio's geselecteerd voor microdissectie van alle cel lagen. (C) Close-up van P7 primordium en regio's geselecteerd voor microdissectie van adaxial opperhuid. (D) Preligule regio P7 primordium voor microdissectie. Arrowhead geeft positie van het initiëren tongetje. (E) De rode lijn geeft de regio geselecteerd voor microdissectie. De laser zal langs deze lijn te snijden. Cirkels geven de punten waar laserpulsen weefsel zal katapulteren. (F) Primordium na microdissectie. Cirkels geven de punten waar laserpulsen weefsel hebben gekatapulteerd. SAM = schieten topmeristeem. P geeft plastochron nummer. Schaalbalken = 100 &# 181; m. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De regio geselecteerd voor LM beïnvloedt lees- geldt voor genen die de langs het blad primordium. (A) Nauwkeurige positionering van het gebied geselecteerd LM opzichte van morfologische oriëntatiepunten vermindert variatie van genen tot expressie gebracht in een gradiënt langs de vleugelas. In herhalingen 1-3 aan de linkerkant, zijn selecties gericht op de opkomende ligule resulteert in lage variatie. In herhalingen 1-3 aan de rechterkant, de positionering van de regio gekozen voor LM is niet consequent resulteert in een verhoogde variatie. (B) microdissecting een gelijkvormige sverkiezing vermindert variatie (repliceert 1-3 links) in vergelijking met microdissecting verschillende grootte selecties (repliceert 1-3 rechts) voor genen met tongetje-specifieke expressie patronen. Transcripten worden verder verdund in de grotere selectie, wat resulteert in een lagere lezen belangrijk en meer geconcentreerd in de kleine selectie, wat resulteert in een hoger aantal keren gelezen. Cartoons vertegenwoordigen longitudinale doorsneden door bladprimordia in het tongetje regio. Arrowhead geeft initiëren tongetje. CPM = tellingen per miljoen. SD = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Dissectie maïs zaailingen voor zijprofielen. (A) Twee weken oude mais zaailing weggesneden bij wortel-shoot kruising. Verwijder dunne plakjes frOM de basis van de shoot (1) totdat een klein ovaal van halm zichtbaar is aan de basis van de shoot. Zorg dwarse gesneden ongeveer 10 mm boven de basis (2) en bewaar deze cilinder. (B) Cilinder van het weefsel zo georiënteerd basis naar boven wijst. Opmerking ovaal van halm omringd door blad. Maak twee langwerpige insnijdingen evenwijdig aan de dwarsas (3 en 4). Te behouden en te repareren centrale stukje weefsel, wordt dit gedeelte ook de SAM en jonge bladprimordia. (C) Cartoon illustreert vlak van laterale deel (groene stippellijn) door de shoot apex. Rode cirkel geeft hoofdnerf, rode pijl geeft aan de marges van grijs blad primordium. Blauwe stippellijn: hoofdnerf-marge as. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cartoon illustreert bundeling van laser gemicrodissecteerde weefsel voor een kopie van het tongetje regio. Weefsel gemicrodissecteerde van vijf naar zes objectglaasjes samengevoegd voor elke duplo. Vijf mediane secties van elke dia worden gebruikt en twee selecties (rode rechthoek) worden gemaakt van elke sectie. Elke rechthoek is ongeveer 20.000 um 2. Weefsel voor elke duplo wordt verzameld in een aparte buis (blauw ovaal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: aantal DE-genen in paarsgewijze vergelijkingen tussen blad regio en in situ hybridisatie van geselecteerde DE genen. (A) Aantal DE genen in paarsgewijze vergelijking tussenblade, tongetje en schede regio, LM van alle cel lagen. (B) Aantal DE genen in paarsgewijze vergelijking tussen mes en schede tongetje gebieden, LM slechts adaxial epidermis. (C) LG1 in situ hybridisatie. (D) NS1 in situ hybridisatie. (E) GRMZM2G101682 in situ hybridisatie. (F) ZmPIN1a in situ hybridisatie. DE: verschillend tot expressie. Up in L: in tongetje, in B: tot in het blad. Up in S: in schede. Pijlpunten in CF aangeven opkomende tongetje. Pijl in F wijst transcript ophoping in vasculaire weefsels. Schaal bar = 100 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
t = "Figuur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Figuur 7: Grafische weergave van de gegevens voor geselecteerde DE genen. Figuur illustreert gegevens in tabel 1 en in situ hybridisatie resultaten. Cartoons vertegenwoordigen longitudinale doorsneden door bladprimordia. Donker blauw geeft transcript ophoping van een bepaald gen. Groene, rode en blauwe vakken geven regio geselecteerd voor microdissectie voor blade, tongetje en schede samples. Cartoons aan de linkerkant illustreren LM van alle cel lagen. Cartoons op de juiste illustreren LM van slechts adaxial opperhuid. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxiale epidermis, CPM: tellingen per miljoen, asterisk geeft significant verschil tussen de twee domeinen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Figuur 8: Cartoon illustreert hoe lees telt voor hypothetische DE genen verschillen afhankelijk van de precieze regio's geselecteerd voor microdissectie. (A) Gene met tongetje-specifieke expressie. (B) gen expressie in de ligule en vaatweefsel. (C) gen expressie specifiek in de regio ligule alle cellagen maar met hogere expressie in de epidermis. (D) Gene uitgedrukt in het tongetje regio alleen L2-afgeleide cellagen. Cartoons vertegenwoordigen longitudinale doorsneden door bladprimordia. Donker blauw geeft transcript ophoping van een bepaald gen. Groene, rode en blauwe vakken geven regio geselecteerd voor microdissectie voor blade, tongetje en schede samples. Cartoons aan de linkerkant illustreren LM van alle cel lagen. Cartoons op de juiste illustreren LM van slechts adaxial opperhuid. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxiale epidermis, CPM: cou gen per miljoen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Geselecteerde genen opgereguleerd in de primordiale tongetje. Tellingen per miljoen: tellingen per miljoen in totaal transcripties, gemiddelde van drie herhalingen, logFC = log base 2 voudige verandering, FDR.BH: valse ontdekking tarief volgens Benjamini en Hochberg methode. Alle lagen: LM van alle cel lagen. Epidermis: LM van slechts adaxial opperhuid. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tabel 2: Geselecteerde genen DE in LG1-R mutanten. Tellingen per miljoen: tellingen per miljoen in totaal transcripties, gemiddelde van drie herhalingen, logFC = log base 2 voudige verandering, FDR.BH: valse ontdekking tarief volgens Benjamini en Hochberg methode. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimenteel design is een kritische factor in RNA-seq experimenten. Belangrijkste overwegingen zijn de precieze domein (en) en het ontwikkelingsstadium (en) te analyseren, en welke vergelijkingen worden gemaakt. Het is cruciaal om te denken in termen van vergelijkingen, omdat de output is typisch een lijst van genen die gede tussen twee of meer voorwaarden. Zoals bij alle experimenten, is het belangrijk om slechts één variabele veranderen tegelijk. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van verschillende domeinen blad, bladeren van dezelfde leeftijd en het ontwikkelingsstadium, gekweekt onder dezelfde omstandigheden worden vergeleken.
Het doel van deze experimenten was om genen die specifiek op- of neerwaarts gereguleerd in de ligule regio wildtype bladprimordia identificeren, en genen die in DE LG1-R mutanten vergeleken met wild-type aan. We studeerde eerst de morfologie van het ontwikkelen bladprimordia en het patroon van LG1 transcript accumulatie. Deze morfologische en moleculaire bezienswaardigheden were gebruikt om precies domeinen te selecteren voor LM 14, 15, 16. In het eerste experiment transcript ophoping in de ligule gebied werd vergeleken met andere gebieden van hetzelfde bladprimordia, waardoor verschillen door groeiomstandigheden, genetische achtergrond, ontwikkelingsfase, en planten te planten variatie elimineren. Mutante vergelijking met wildtype, is het noodzakelijk om te bepalen waar en wanneer het gen van belang tot expressie wordt gebracht. We raden u aan het analyseren van de expressie patroon door ofwel in situ hybridisatie of immuunlokalisatie en een gebied voor LM dat het domein van genexpressie omvat selecteren. Het is belangrijk dat gelijkwaardige domeinen worden vergeleken en dat de genetische achtergrond is hetzelfde voor zowel mutant en wildtype.
De nauwkeurigheid van microdissections kan worden geverifieerd door te controleren lees tellingen naar genen die specifiek worden uitgedrukt in het domein van belang, indien such genen zijn bekend. Dit kan ook worden gedaan door het uitvoeren van RT-PCR op RNA geëxtraheerd uit LM weefsel alvorens bibliotheken voor sequentiebepaling. In de hier beschreven experimenten, LG1 diende als controle voor LM het tongetje regio, aangezien in situ hybridisatie analyses hebben aangetoond dat LG1 expressie specifiek is voor de PLB en opkomende tongetje 5, 6.
In tegenstelling tot werkwijzen zoals RT-qPCR, waarbij de kandidaat-gen (en) moet kennen, RNA-seq kwantificeert accumulatie van transcripten in een bepaalde weefselmonster. Aldus LM RNA-seq is een nuttige methode om kandidaatgenen te identificeren. Een voorbeeld uit deze studie is GRMZM2G101682, een gen met onbekende functie die een opvallende tongetje-specifieke expressie patroon (figuur 6E) heeft. Deze studie is ook genen geïdentificeerd in DE LG1-R, zoals bel14, die niet eerder werd geïmpliceerd als waarnemend stroomafwaarts van LG1. in this bijvoorbeeld de vergelijking van meerdere gegevenssets (opgereguleerd in het wildtype tongetje regio in DE LG1-R) was bijzonder informatief. Het is belangrijk op te merken dat het expressiepatroon van een gen dat zijn functie niet aantoont: verdere genetische en / of biochemische analyses moeten genfunctie stellen.
Transcriptomische analyses die zijn gericht op kleine, discrete ontwikkelings-domeinen, die differentieel onderscheiden en gemakkelijk afgebakend zijn, zijn het meest succesvol. LM RNA-seq een geschikte methode voor een dergelijke analyse en heeft het potentieel om te worden toegepast op vele ontwikkelingsstoornissen verschijnselen. Het is vooral geschikt om differentiële genexpressie te identificeren mutanten van genen die ruimtelijk zijn beperkte expressiepatronen of mutanten die ontwikkeling van specifieke structuren beïnvloeden. Het kan ook worden toegepast op processen die plaatsvinden in specifieke en herkenbare cellen of weefsels, zoals de epidermis en vaatstelsel, en is gebruikt ineen transcriptoom analyse van maïs schieten topmeristeem (SAM) ontogenie 16. Het is minder geschikt voor onderzoek naar de functie van genen die alom tot expressie worden gebracht of processen die in alle cellen. De hier gepresenteerde werkwijzen zijn met succes toegepast op een verscheidenheid aan plantensoorten (maïs, sorghum, Ocimum, Mentha en Antirrhinum) en structuren (bladprimordia, meristemen, wortelstokken en trichomen).
LM is niet vereist wanneer een analyse omvat relatief grote domeinen. Inderdaad, RNA-Seq voorhanden ontleed of hele organen is met succes gebruikt om DE genen in planten 14, 15. Deze aanpak heeft het voordeel dat minder arbeidsintensief en geen ervaring met histologische technieken vereist. Er zijn echter beperkingen aan de precisie van dissecties kant, waardoor de hand dissectie is minder geschikt voor het bestuderen van vroege developmental processen.
Voor een succesvolle LM RNA-Seq analyses van ontwikkelings-verschijnselen, moet de ontwikkelings context goed worden gekarakteriseerd. We raden u aan een grondig histologisch onderzoek van het proces of het domein van belang zijn voor het plannen van een experiment. De histologie van de monsters verwerkt voor LM is over het algemeen slecht, omdat de weefsels ongekleurd en niet zijn gemonteerd met dekglaasjes die diepte-van-veld te bieden. Daarom is het nuttig afzonderlijke monsters voor kleuring en observatie vast tegelijk als LM monsters worden gefixeerd (figuur 1C en D).
RNA verkregen uit LM materiaal is over het algemeen versnipperd en de totale opbrengst is laag 8. Een versterking stap is nodig om voldoende RNA voor bibliotheek voorbereiding 28 te genereren. RNA fragment lengte moet worden geëvalueerd na versterking en voorafgaand aan de bibliotheek generatie. Een gemiddelde fragment lengte van SEVeral honderd basenparen wordt over het algemeen beschouwd als goed, 500 basenparen is uitstekend. Slechte RNA opbrengst kan ontstaan als het weefsel is niet goed vast, als degradatie als gevolg van RNase besmetting optreedt of als paraffineblokken verkeerd zijn opgeslagen. Het is nuttig om de kwaliteit van vast weefsel testen door een proefservice LM van een relatief groot gebied voor veel tijd microdissecting zeer kleine domeinen wijden. Omdat de van LM-cellen is gefragmenteerd RNA en amplificatie met behulp van een oligo dT primer introduceert een sterke 3 'bias deze werkwijze niet geschikt voor het detecteren alternatieve transcripten zoals splice varianten. LM noch is geschikt voor het detecteren van kleine RNA.
Een alternatieve methode voor transcript accumulatie in specifieke weefsels of cellulaire domeinen kwantificeren is RNA-seq cellen gescheiden door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 21. Deze werkwijze vereist in het algemeen identificatie van een geschikt markergen voor het van belang zijnde,het genereren van transgene planten die een fluorescent-gelabeld eiwit en protoplasting. FACS gecombineerd met microarray werd gebruikt om een expressie kaart van de Arabidopsis wortel door scheiding cellen die celtype-specifieke promotoren in de wortel 22, 23 genereren. FACS van shoot weefsels is een grotere uitdaging dan wortel weefsels te wijten aan chlorofyl autofluorescentie 24. Een beperking van LM is dat het gebied van belang geïdentificeerd in histologische secties moet zijn. FACS kan een geschikte methode wanneer een geschikt merkergen beschikbaar. De keuze van de cellen of weefsels te isoleren en te vergelijken is een belangrijke overweging bij transcriptoom analyse die ofwel FACS of LM.
De hier gepresenteerde gegevens tonen dat verschillende resultaten verkregen afhankelijk van de precieze domeinen geselecteerd LM (Figuur 3, Figuur 8). Transcripten van genen die tot expressie in één of enkele cellen, zoals NS1, worden verdund wanneer grote domeinen weefsel geanalyseerd. Het is waarschijnlijk dat als geheel bladprimordia gesampled ns1 transcript zou niet worden gedetecteerd. ZmPIN1a aanzienlijk opgereguleerd in de ligule vergelijking met mes en schede epidermis, maar dit verschil is beschaamd door vasculaire expressie wanneer alle cel lagen worden bemonsterd. Omgekeerd genen die alleen tot expressie gebracht in L2-afgeleide cellagen worden niet gedetecteerd wanneer alleen de epidermis wordt bemonsterd (Figuur 8D). Deze studie toont aan dat, terwijl LM RNA-Seq is een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van verschillen in genexpressie gedurende morfogenese, geselecteerd voor analyse domeinen zijn cruciaal voor het succes van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken S. Heek voor de lopende samenwerking en het stimuleren van discussies over tongetje ontwikkeling. Dit werk wordt ondersteund door de National Science Foundation Subsidies MCB 1052051 en IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
