Abstract
Les gènes ayant des rôles importants dans le développement ont souvent des profils d'expression spatialement et / ou temporellement restreint. Souvent, ces transcrits de gènes ne sont pas détectés ou ne sont pas identifiés comme étant différentiellement exprimés (DE) dans l'analyse du transcriptome d'organes de la plante entière. Laser Microdissection ARN-Seq (LM ARN-Seq) est un outil puissant pour identifier les gènes qui sont DE dans des domaines spécifiques de développement. Cependant, le choix des domaines cellulaires pour microdissect et comparer, et la précision des microdissections sont cruciales pour le succès des expériences. Ici, deux exemples illustrent des considérations de conception pour les expériences de transcriptomique; une LM analyse de l' ARN-seq pour identifier les gènes qui sont DE selon l'axe proximal-distal maïs feuille, et une seconde expérience pour identifier les gènes qui sont dans DE liguleless1-R (lg1-R) mutants par rapport au type sauvage. Les éléments clés qui ont contribué au succès de ces expériences ont été détaillées histologiques et situ analyses d' hybridation de la région à analyser, la sélection des primordiums de feuilles à un stade de développement équivalent, l'utilisation de points de repère pour sélectionner des régions morphologiques pour microdissection, et microdissection des domaines précisément mesurés. Ce document fournit un protocole détaillé pour l'analyse des domaines de développement en LM ARN-Seq. Les données présentées ici montrent comment la région sélectionnée pour microdissection aura une incidence sur les résultats obtenus.
Introduction
La feuille de maïs est un modèle idéal pour étudier la formation des champs de développement au cours de la morphogenèse, car il a une frontière distincte entre la lame et la gaine qui se prête à la dissection génétique (Figure 1A). Pendant les premiers stades de développement de la feuille, une bande linéaire de cellules plus petites, la bande de preligule (PLB), subdivise l'ébauche de feuille en pré-lame et pré-gaine domaines. Une ligule frange semblable et oreillettes triangulaires se développent à partir de la PLB (Figure 1A, C, D). écrans génétiques ont identifié des mutations qui perturbent la limite lame-gaine. Par exemple, liguleless1 récessive (LG1) mutations supprimer la ligule et oreillettes 1, 2, 3, 4 (figure 1B). L'hybridation in situ a révélé que la transcription lg1 accumule au PLB et ligule émergents, ce qui en fait un excellent marqueur pour le développement ligule 5, 6 (figure 1E).
Figure 1: type sauvage et liguleless1-R feuilles de maïs. (A) région limite Blade-gaine de maturité des feuilles de type sauvage montrant les structures de ligule et oreillette. (B) de la région de la frontière Blade-gaine mature liguleless1-R feuille montrant l' absence de structures de ligule et oreillette. Feuilles en A et B ont été coupés en deux le long de la nervure médiane. (C) longitudinale coupe de type sauvage feuille primordium. L'échantillon a été traité et colorées pour l'analyse histologique. Initier la ligule ressort comme une bosse en saillie par rapport au plan de la lame (pointe de flèche). (D) sect longitudinaleion par type sauvage feuille primordium. L'échantillon a été traité pour LM, comme décrit dans le texte. Arrowhead indique lancer ligule. (E) LG1 hybridation in situ de la tige latérale en coupe longitudinale de sommet en. Les astérisques indiquent l' accumulation de transcription lg1 au PLB du primordium P6 feuille. Les flèches indiquent la base de P6 primordium. Bar indique la mesure de la base de l'ébauche à la PLB. Les barres d'échelle en A et B = 20 mm. Les barres d'échelle dans CE = 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 6 (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans cette étude, LM ARN-Seq a été utilisée pour identifier un ensemble de gènes qui sont exprimés de manière différentielle (DE) à la limite lame-gaine par rapport à d'autres parties du primordium foliaire et Ide gènes ntifier qui sont dans des mutants DE lg1-R par rapport aux frères et sœurs de type sauvage. LM ARN-Seq est une méthode de quantification de l' accumulation du transcrit dans des cellules spécifiques ou des domaines cellulaires 7. Les systèmes LM combinent un laser et un microscope avec un appareil photo numérique. tissus Sectionné est monté sur des lames et vu à travers le microscope. Le logiciel de LM comprend généralement des outils de dessin qui permettent à l'utilisateur d'esquisser une région sélectionnée pour microdissection. Les coupes laser le long de la ligne, et le tissu sélectionné est catapulté hors de la diapositive et dans un tube suspendu au-dessus de la diapositive. LM permet à l'utilisateur de microdissect domaines précis, y compris les couches de cellules spécifiques et même des cellules individuelles 8, 9. L'ARN peut alors être extrait du tissu microdissection. Par la suite, le composant ARN-Seq utilise le séquençage de la prochaine génération à la séquence des banques d' ADNc générées à partir de l'ARN extrait 10,= "xref"> 11.
Les principaux avantages de LM ARN-seq sont la capacité à quantifier l' accumulation des transcrits dans des domaines bien définis et la capacité de profiler l'ensemble transcriptome simultanément 7. La technique est particulièrement adaptée à sonder les événements précoces du développement, où la région d'intérêt est souvent microscopique. Des études antérieures ont utilisé LM combiné avec la technologie des biopuces pour étudier les processus de développement dans les plantes 9, 12, 13. ARN-Seq a l'avantage de quantifier les transcriptions à travers une large gamme dynamique, y compris les gènes de faible exprimés, et de l' information de séquence préalable est pas nécessaire 10, 11. En outre, LM ARN-Seq a le potentiel de mettre en évidence les gènes importants pour le développement qui peuvent manquer dans les écrans de mutagenèse en raison de la redondance génétique ou à la létalité de la perte-ofmutant de fonction.
Gènes importants pour le développement, tels que sheath1 étroite (NS1) et en forme de cuvette de cotyledon2 (CUC2), ont souvent des profils d'expression spécifiques d'un seul ou de quelques cellules 17, 18, 19, 20. Beaucoup sont exprimés seulement au cours des étapes précoces du développement et non pas dans l'organe mature. Lorsque des organes entiers ou de grands domaines sont analysés, ces transcrits spécifiques des cellules sont diluées et ne peuvent pas être détectées dans les analyses plus classiques. En permettant des analyses des domaines bien définis, LM ARN-Seq permet à ces gènes spécifiques de tissus à être identifiés et quantifiés.
Les facteurs cruciaux dans le succès des expériences décrites ici ont une analyse histologique approfondie qui a guidé la sélection de l'étape de développement approprié et le domaine de l'analyse, et MeasureMe précisent de domaines de cellules tissulaires pour LM. Pour veiller à ce que les domaines équivalents ont été échantillonnés pour toutes les répétitions, les tissus ont été recueillis à partir de primordiums foliaires au même stade de développement et les domaines microdissection ont été mesurés par rapport aux repères morphologiques telles que la ligule émergente (figure 2). Il est connu que certains gènes sont exprimés dans un gradient allant de la pointe à la base de la feuille. En mesurant les domaines précis, la variation due à l' échantillonnage à différents endroits le long de l'axe proximal-distal feuille a été maintenu à un minimum (figure 3A). Par microdissecting domaines de la même taille, la variation due à la différence de dilution des produits de transcription spécifiques de cellules a également été réduite (figure 3B). des sections longitudinales latérales du sommet de pousses ont été utilisées pour toutes microdissections. Ceux - ci sont des profilés qui sont perpendiculaires à l'axe de la nervure médiane marge (figure 4). En utilisant uniquement les sections qui incluent le SAM assure que les régions latérales équivalentes deprimordia foliaires sont analysés.
Dans les échantillons traités et sectionnés pour LM, le premier signe morphologique d'excroissance ligule est une bosse sur le côté adaxial en raison de divisions cellulaires périclines dans l'épiderme adaxiales (figure 1D, Figure 2). Il a été déterminé que la ligule émergente pourrait être identifié de manière fiable à plastochron 7 primordia foliaires de scène. Nous étions intéressés par les gènes exprimés dans toute la région, y compris le ligule ligule émergents et les cellules immédiatement distales qui formeront l'auricule. Afin de s'assurer que les pièces de tissus équivalents ont été faites, la bosse ligule a été utilisé comme point de repère morphologique et un rectangle de 100 um centrée sur la bosse ligule a été sélectionné pour LM (figure 2A, 2B). rectangles de taille équivalentes de pré-lame et pré-gaine ont été choisis parmi les mêmes primordia foliaires.
Les analyses des plantes mutantes ont présenté une liguleless challe différentnge; mutants lg1-R ne forment pas une ligule, donc cette fonctionnalité morphologique ne peut pas être utilisé pour sélectionner la région pour LM. Au lieu de cela, le domaine de l' accumulation de transcription lg1 dans de type sauvage primordiums foliaires a été déterminé, et une région qui engloberait ce domaine a été défini. Ces analyses préliminaires ont été effectuées sur des plants de la même plantation qui ont été utilisés pour l'analyse finale, puisque les travaux antérieurs ont montré que l'emplacement de la PLB varie en fonction des conditions de croissance. L'hybridation in situ a indiqué que les transcriptions LG1 accumulent dans la PLB de P6 primordiums foliaires (figure 1E). Nous avons choisi un domaine 400-900 um à partir de la base de la primordia feuille qui englobait le domaine d'expression lg1 (rectangles violets, figure 2A) et capturé ces régions équivalentes de type sauvage et les plantes lg1-R. Pour réduire au minimum la variation des conditions de fond et de croissance génétique lorsque l'on compare transcriptaset accumulation dans lg1-R et des plantes de type sauvage, ségrégation des familles de mutants et frères et sœurs de type sauvage ont été utilisés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Fixer le tissu pour l'analyse histologique en même temps que le tissu est fixé pour LM. Examiner les coupes colorées pour caractéristiques morphologiques qui guideront plus tard LM. Lorsque l'on compare mutant au type sauvage, effectuer l' hybridation in situ ou immunolocalisation pour définir le domaine où le gène d'intérêt est exprimé (dans ce cas lg1).
1. Fixation des tissus et traitement
- Cultivez appartements de plants de maïs à deux semaines vieux dans des conditions standard 6.
- Disséquer apex de pousse pour les sections latérales (figure 4).
- plantules d'accise juste au-dessous du niveau du sol.
- En utilisant une lame de rasoir, retirer les tranches minces de la base de la tige (coupe 1, la figure 4A) jusqu'à un ovale de chaumes entouré par une ou deux feuilles matures est visible (figure 4B).
- Faire une autre coupe d' environ 10 mm au- dessus de la base (coupé 2, figure 4A).Ce segment de 10 mm contiendra le SAM et les jeunes primordia foliaires.
- Tourner le segment de 10 mm de sorte que la base est orientée vers le haut. Faire deux entailles parallèles à l'axe latéral de sorte qu'une tranche de tissu 2-3 mm d' épaisseur est obtenue (coupes 3 et 4, la figure 4B). Jeter les deux parties extérieures et de retenir la tranche centrale pour la fixation et l'intégration.
NOTE: Les feuilles extérieures peuvent être coupés et jetés.
- Fixer le tissu et le processus d'intégration.
- Veiller à ce que tous les matériaux à utiliser dans les étapes suivantes sont RNase. Traiter la solution avec du pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) (1 ml de DEPC par litre de solution. Laisser incuber pendant une nuit avec agitation occasionnelle par secousses, et l'autoclave). Cuire la verrerie dans un four à 200 ° C ou plus pendant au moins 6 heures et traiter articles en plastique avec une solution de décontamination RNase.
- Jour 1: Immergez tranches de tissu dans ~ 10 ml de solution de Farmer (3: 1 de l'éthanol: acide acétique) en flacon de verre sur la glace. Après tous les échantillons ont été disséqués, appliquer VACUUm pour éliminer les bulles d'air et la pénétration de l'aide de fixateur. Tenir sous vide pendant 10 min puis relâchez le vide lentement. Remplacer fixateur et incuber à 4 ° C pendant la nuit en agitant doucement.
- Jour 2: Incuber dans la série suivante de solutions, ~ 10 ml chacune, 1 h chacune, toutes avec agitation douce; 85% d'éthanol à 4 ° C, 95% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 1: 1 éthanol: xylènes à la température ambiante, 100% de xylènes à la température ambiante, 100% de xylènes à la température ambiante.
NOTE: Les xylènes sont toxiques par contact et inhalation. Travailler dans une hotte et utiliser des gants appropriés. - Ajouter un tissu de paraffine enrobage des pastilles moyennes à environ la moitié du volume de xylènes et laisser incuber pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce.
- Jour 3: Transférer le flacon à 60 ° C du four jusqu'à ce que les granulés fondent. Verser la solution et remplacer avec des produits frais tissu fondu milieu d'enrobage. Changez les deux moyennes plusieurs foisau cours de la journée.
- Jour 4: Changement tissu milieu d'inclusion une fois le matin. Retour à 60 ° C jusqu'à ce que le four après-midi.
- blocs de fonte
- Placez les moules d'enrobage sur la plaque chaude de la station d'enrobage de tissus. Utilisez une pince pour transférer les échantillons de tissus aux moules d'enrobage avec la surface de coupe vers le bas. Compléter le moule avec de la paraffine fondue et placez l'anneau d'encastrement sur le dessus du moule. Transfert à une plaque froide jusqu'à ce que la paraffine a solidifié. Stocker les blocs de paraffine à 4 ° C dans un récipient hermétique avec du gel de silice.
2. Sectionnement et diaporama Préparation
- Couper 10 sections um sur un microtome 25.
- Examiner les rubans et choisissez sections médianes. sections médians sont ceux qui comprennent le SAM, qui apparaît comme un dôme de cellules entourées de primordia foliaires.
- sections de montage sur des lames.
- Placer les lames qui conviennent à LM (soit RNase libre oucuite) sur 42 ° C glisser plus chaud et appliquer plusieurs gouttes de solution d'éthanol à 50% pour couvrir la diapositive.
- Float sections sur une solution d'éthanol jusqu'à ce que les sections ont élargi.
NOTE: Flottant sections sur la solution de l'éthanol plutôt que de l'eau maintient l'ARN dans un état précipité en réduisant la dégradation de l'ARN. - Inclinez diapositive et éliminer la solution de l'éthanol en excès par aspiration avec une pipette de transfert jetable. Utilisez des lingettes non pelucheux pour évacuer toute solution d'éthanol supplémentaire.
- diapositives sec à 42 ° C pendant plusieurs heures ou toute la nuit. Magasin glisse à 4 ° C dans un récipient hermétique avec du gel de silice.
- Déparaffiner glisse le jour de l'utilisation.
- Préparer trois bocaux en verre Coplin contenant; 100% de xylènes (I), les xylenes 100% de xylènes (xylènes II) et 100% d'éthanol (~ 50 ml de chaque solution).
- En utilisant des pinces propres pour le transfert des diapositives, Immerger les lames dans les xylenes I pendant 2 min, les xylènes II pendant 2 min et 100% d'éthanol pendant 1 min.
- vidange glissées sur des lingettes non pelucheux et l'air sec à la température ambiante.
3. Microdissection de Blade, ligule et gaine échantillons de plastochrone 7 Feuille Primordia
- Fixer les diapositives sur scène de LM microscope. Utilisez cinq ou six diapositives pour chaque réplique, en utilisant cinq sections par lame.
REMARQUE: Tissue mise en commun pour un seul répliquée est illustré sur la figure 5. - Examiner les lames et d'identifier les cinq sections les plus médianes sur chaque diapositive, en utilisant la SAM apex comme point de référence central.
NOTE: Cela peut être fait à faible grossissement, généralement un objectif 5X est suffisante. - En utilisant 10X ou 20X objectif, identifier la position de la ligule de la feuille 7 plastochrone primordium de chaque section. La ligule sera visible comme une bosse en saillie de la surface adaxial de l'ébauche de feuille. Marquer cette position à l'aide de l'outil de dessin du logiciel LM; sélectionnez l'icône de crayon, déplacer le curseur sur la positi appropriéesur et cliquez et faites glisser la souris pour dessiner.
NOTE: Un 10X ou un objectif 20X est approprié pour cela et les étapes ultérieures. Lors de l' utilisation des sections latérales, les deux faces de chaque ébauche de feuille sont présents dans chaque section (figure 2A). - Utilisation de l'outil de la règle et de l'outil de dessin rectangulaire, mesurer 100 um élevés rectangles centrés sur la ligule de chaque section (rectangles rouges, Figure 2A, 2B). Ceux-ci seront l'échantillon "Ligule".
- Pour utiliser l'outil de la règle; sélectionnez l'icône de la règle, déplacez le curseur à une extrémité de l'objet à mesurer, cliquez et faites glisser pour mesurer l'objet. La longueur de la règle sera affiché sur l'écran.
- Pour dessiner un rectangle; sélectionnez l'icône du rectangle, déplacez le curseur sur un point qui sera un coin du rectangle, cliquez et faites glisser pour dessiner un rectangle de la taille appropriée. Sinon, sélectionnez l'outil de dessin en ligne droite et tirer quatre lignes droites.
- Mesure 100 pm 50 pm rectangles positionnés au-dessus et au-dessous du rectangle "ligule".
NOTE: Ce seront les "Blade" et des échantillons "gaine", respectivement (vert et bleu rectangles, Figure 2A, 2B). Sur la base de nos données histologiques, un rectangle de 100 um englobe la région de la ligule entier. taille des portions équivalentes de la lame et de la gaine ont été choisies pour faire en sorte que des quantités similaires de tissu ont été prélevés dans chaque cas. Écarteurs de 50 um ont été utilisés pour faire en sorte qu'aucun tissu région ligule est inclus par inadvertance dans la lame ou de la gaine microdissections.
- Microdissect mesurée rectangles (figure 2D - 2F) 7, 8, 9, collecte d' échantillons Ligule, lames et gaine dans des tubes séparés. Utilisez la fonction de découpe au laser pour couper à travers la section de tissu le long du contour du domaine sélectionné. Utilisez le cataFonction de pult pour propulser le rectangle de tissu de la lame et dans le couvercle du tube (figure 2D - 2F).
4. Microdissection de Blade, ligule et gaine adaxial épidermiques échantillons de plastochrone 7 Feuille Primordia
- Sélectionnez sections et utiliser l'outil de règle pour mesurer 100 um élevés segments centrés sur la plastochron 7 ligule, tel que décrit dans la section 3 (ci-dessus).
- Sélectionnez uniquement les cellules épidermiques adaxiales de chaque 100 um haute "Blade" et "gaine" segment (vert et bleu sélections, figure 2C) en décrivant avec l'outil de dessin. L'épiderme est la couche cellulaire externe; le côté adaxial est le plus proche de la SAM.
- Pour l'échantillon "Ligule", sélectionnez uniquement les cellules de la ligule bosse émergents comme décrit dans la section 3.3 (sélection rouge, figure 2C).
- Microdissect régions sélectionnées, la collecte Blade, Ligule et Sheae épiderme échantillons dans des tubes séparés, comme décrit dans la section 3.5.
5. Microdissection de plastochrone 6 Feuille Primordia de lg1-R et frères et sœurs de type sauvage
- Cultivez ségrégation des familles de mutant (lg1-R) et les plantes de type sauvage.
- Fix et processus pousse apex pour LM, comme décrit dans les sections 1.2-1.4. Correction de type sauvage et apex de pousses mutantes dans des flacons séparés afin de les garder séparés. Des échantillons provenant de la même plantation doivent être fixés et traités pour une hybridation in situ.
- Déterminer où lg1 est transcrit dans la fratrie de type sauvage, en effectuant lg1 hybridation in situ 6, 26, 27. Mesurer la position de l' accumulation de transcription lg1 de la base du primordium foliaire dans plusieurs échantillons (figure 1E).
- Sur la base des données d'hybridation in situ, choisir la partie de la feuille primordium qui englobe la région où lg1 est transcrit. Dans ce cas, 400-900 um à partir de la base de plastochron 6 primordiums foliaires (rectangles violets, figure 2A).
- Microdissect partie de primordiums foliaires sélectionnée, comme décrit dans la section 3.5, la collecte lg1-R et des échantillons de type sauvage dans des tubes séparés.
6. Appliquer l'ARN Extraction Buffer
- Appliquer un tampon d'extraction d'ARN 50 ul de tissu microdisséquée et procéder à l'extraction de l'ARN. Continuer avec l' extraction de l' ARN, l'amplification d' ARN, construction de la banque, le séquençage et l' analyse bioinformatique comme décrit dans la référence 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utilisant le schéma de LM décrit à la figure 2, environ 1,000,000-1,500,000 um 2 de tissu ont été recueillies pour chaque répétition dans le tout-cell-couches LM (Figure 5), et 200 000 pm 2 pour répliquer pour l'épiderme adaxial LM. Environ 2.500.000 um 2 de tissu ont été recueillis pour chaque répétition dans la LM de primordia foliaires de type sauvage lg1-R et. Deux séries d'amplification linéaire de l'ARN ont donné microgramme quantités d'ARN pour chaque réplique. La quantité d'ARN obtenu d'une microdissection donnée dépendra de la taille des cellules et l'activité transcriptionnelle, ainsi que la quantité de tissu capturé. L'intégrité de l'ARN aura une incidence sur l'efficacité de l'amplification de l'ARN.
l'accumulation de la transcription a été analysée dans toutes les couches de cellules de la lame, les régions ligule et de la gaine et un total de 2359 DE genes ont été trouvés, avec un taux de fausse découverte (FDR) <0,05 (figure 6A). Plus précisément, 1714 gènes étaient DE entre ligule et lame, 1.044 gènes étaient DE entre ligule et de la gaine, et 657 gènes étaient DE entre la lame et la gaine (certains gènes sont DE dans plus d'une comparaison). Les gènes ont été classés comme upregulated dans la région ligule si elles étaient significativement surexprimés dans les deux ligule par rapport à la lame et ligule par rapport à la gaine. Dans l'ensemble des couches de cellules LM, 373 gènes ont été significativement surexprimés dans la région ligule.
l'accumulation de la transcription a été analysée dans les régions épiderme lame, ligule et gaine adaxiales et un total de 3.128 DE gènes ont été trouvés; 1.971 gènes étaient DE entre ligule et lame, 2.032 gènes étaient DE entre ligule et de la gaine, et 871 gènes étaient DE entre la lame et de la gaine (figure 6B). 287 gènes étaient significativement régulés positivement dans la ligule par rapport à la lame et de la gaine epidermis.
Les données pour les gènes sélectionnés qui sont régulés positivement dans la région ligule sont présentés au tableau 1 et à la figure 7. Une première dans l' analyse d'hybridation in situ a indiqué que les transcriptions LG1 accumulent spécifiquement dans le PLB et la ligule émergente de type sauvage primordiums foliaires, et que lg1 est plus fortement transcrit dans l'épiderme que dans les couches cellulaires internes (Figure 6C). Le LM de données d'ARN-seq qui ont été obtenus sont conformes à ce résultat; l' accumulation du transcrit LG1 est significativement plus élevée dans la ligule que soit la lame ou de la gaine à la fois dans le LM LM épidermique et de toutes les couches de cellules (tableau 1, figure 7a). LG1 a un CPM plus élevé dans l'analyse de l' épiderme par rapport à l'analyse de toutes les couches de cellules, similaire au scénario illustré sur la figure 8C.
NS1 est significativement régulée à la hausse dans la région ligule dans les deux couches de l'ensemble de cellules LM LM et l'épiderme adaxiale (tableau 1, figure 7B). Cette constatation a été confirmée par hybridation in situ, ce qui montre que la transcription ns1 accumule spécifiquement dans la pointe de la ligule émergente (Figure 6D) dans. ns1 a un nombre beaucoup plus élevé de lire dans l'épiderme seule analyse des LM qu'en LM de toutes les couches de cellules (19,6 CPM et 2,7 CPM, respectivement) en raison de la dilution de la transcription dans l'ensemble des couches LM. Cet effet de dilution est illustré sur la figure 8A. De même, GRMZM2G101682, un gène de fonction inconnue, avait un moyen pour lire le nombre plus élevé dans l'épiderme LM ligule que dans l'ensemble des couches LM (tableau 1, figure 7C). L'hybridation in situ a révélé que ce transcrit du gène accumule également plus fortement dans les cellules de l' épiderme (figure 6E). PIN1a zm n'a pas été significativement ED dans l'analyse de toutes les couches de cellules, mais est significativement régulée à la hausse dans la ligule dans l'analyse de l' épiderme seulement (tableau 1, figure 7D). Ceci est très probablement parce que Zm PIN1a est fortement exprimée dans les tissus vasculaires et cette expression vasculaire L2 dérivés déconcerte différences dans l' accumulation Zm PIN1a dans l'épiderme lorsque toutes les couches de cellules sont collectées (Figure 6F). Un scénario similaire est représenté sur la figure 8B.
Pour identifier les gènes qui sont dans des mutants DE lg1-R, l' accumulation de la transcription a été comparée dans une région définie de type sauvage et lg1-R P6 primordia foliaires. Quatre-vingt-six gènes étaient dans DE lg1-R (FDR <0,05); 59 ont été régulés à la baisse chez les mutants LG1-R, et 37 ont été régulée à la hausse. Les données pour les gènes sélectionnés qui sont dans DE <em> mutants LG1-R sont présentés dans le tableau 2. bel14 est l' un des 34 gènes qui sont à la fois régulés positivement dans la région ligule en type sauvage primordiums foliaires et downregulated dans les mutants lg1-R. L'hybridation in situ a confirmé que les transcriptions bel14 accumulent dans la région preligule dans les plantes de type sauvage , mais pas dans la région correspondante de lg1-R primordiums foliaires 6.
Figure 2: Schéma de microdissection laser de feuilles domaines primordiaux. (A) en coupe longitudinale latérale du maïs apex traitées pour LM. Les boîtes indiquent des régions sélectionnées pour microdissection. région tissu Ligule (encadré rouge) a été microdissection de 100 um rectangles élevés, centrés sur la PLB. Pré-lame (vert) et pré-gaine (bleu) le tissu a été prise à partir de 100 umrectangles 50 um au-dessus et au-dessous de la sélection de preligule respectivement. Pour la comparaison des type sauvage et transcriptomes lg1-R, tissu entre 400-900 um à partir de la base du P6 primordiums foliaires a été microdissection de sections latérales (violet ligne pointillée). (B) gros plan P7 primordium et régions sélectionnés pour microdissection de toutes les couches de cellules. (C) Close-up de P7 primordium et régions sélectionnés pour microdissection de l' épiderme adaxiales. (D) Preligule région P7 primordium avant microdissection. Arrowhead indique la position de lancer ligule. (E) La ligne rouge indique la région sélectionnée pour microdissection. Le laser va couper le long de cette ligne. Les cercles indiquent les points où des impulsions laser se catapulter tissu. (F) Primordium après microdissection. Les cercles indiquent les points où des impulsions laser ont catapulté tissus. SAM = tirer méristème apical. P indique le numéro de plastochron. Barres d'échelle = 100 &# 181; m. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 6 (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: La région choisie pour LM affecte les chiffres de lecture des gènes qui sont le long de la DE primordium foliaire. (A) Le positionnement exact de la région sélectionnée pour LM par rapport aux repères morphologiques réduit la variation des gènes exprimés dans un gradient le long de l'axe de la feuille. En réplicats 1-3 sur gauche, les sélections sont centrées sur la ligule émergente résultant en une faible variation. En répétitions 1-3 sur le droit, le positionnement de la région sélectionnée pour LM est pas conforme résultant de la variation accrue. (B) Microdissecting une taille constante sélection réduit la variation (réplique 1-3 sur la gauche) par rapport à microdissecting sélections de tailles différentes (1-3 réplique à droite) pour des gènes avec des profils d'expression spécifiques à ligule. Transcriptions sont plus dilués dans la sélection plus grande, ce qui entraîne un nombre inférieur lire, et plus concentrée dans la petite sélection, ce qui entraîne un nombre plus élevé de lire. Les dessins animés représentent des coupes longitudinales primordiums foliaires dans la région ligule. Arrowhead indique lancer ligule. CPM = chiffres par million. SD = écart-type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Dissection du maïs plantules pour les sections latérales. (A) Deux semaines d'âge des semis de maïs excisée à la racine-shoot jonction. Retirer les tranches minces from la base de la tige (1) jusqu'à ce qu'un petit ovale de chaume est visible à la base du tournage. Faire coupe transversale à environ 10 mm au-dessus de base (2) et de conserver ce cylindre. (B) Cylindre de tissu orienté de manière à base est orientée vers le haut. Remarque ovale de chaume entouré de feuilles. Faire deux coupes longitudinales parallèles à l'axe latéral (3 et 4). Retenir et fixer tranche centrale du tissu, cette partie comprendra le SAM et les jeunes primordia foliaires. (C) Caricature illustrant le plan de coupe latérale (ligne verte en pointillés) à travers apex. Cercle rouge indique midrib, flèche rouge indique les marges de gris feuilles primordium. Bleu ligne pointillée: axe midrib marge. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Cartoon illustrant la mise en commun du laser tissu microdissection pour une répétition de la région ligule. Tissue microdissection de cinq à six diapositives sont mises en commun pour chaque réplique. Cinq sections médianes de chaque lame sont utilisés et deux sélections (rectangles rouges) sont fabriqués à partir de chaque section. Chaque rectangle est d' environ 20 000 um2. Tissue pour chaque réplique est recueillie dans un tube séparé (ovale bleu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Nombre de DE gènes dans les comparaisons par paires entre les régions des feuilles et l' hybridation in situ des gènes sélectionnés dans DE. (A) Nombre de gènes DE en comparaison appariée entrelame, ligule et de la gaine, les régions LM de toutes les couches cellulaires. (B) Nombre de gènes DE en comparaison appariée entre lame, ligule et gaine régions, LM de seulement épiderme adaxiales. (C) LG1 hybridation in situ. (D) NS1 hybridation in situ. (E) GRMZM2G101682 hybridation in situ. (F) ZmPIN1a hybridation in situ. DE: différentiellement exprimés. Up in L: jusqu'à en ligule, Up in B: jusqu'à en lame. Up in S: jusqu'à dans la gaine. Arrowheads dans les FC indiquent ligule émergents. Arrow en F indique l'accumulation de la transcription dans les tissus vasculaires. Les barres d'échelle = 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 6 (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
t = "Figure 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Figure 7: Représentation graphique des données pour les gènes DE sélectionnés. La figure montre les données présentées dans le tableau 1 et les résultats d'hybridation in situ. Les dessins animés représentent des coupes longitudinales primordia foliaires. Le bleu foncé indique l'accumulation de la transcription d'un gène particulier. boîtes vertes, rouges et bleues indiquent la région sélectionnée pour microdissection pour les échantillons lame, ligule et de la gaine. Les dessins animés sur la gauche illustrent LM de toutes les couches de cellules. Les dessins animés sur la droite illustrent LM de seulement épiderme adaxiales. Ad: adaxial épiderme, Ab: épiderme abaxiales, CPM: chiffres par million, l'astérisque indique une différence significative entre les deux domaines. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
"Src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Figure 8: Cartoon illustrant comment lire les chiffres pour les gènes DE hypothétiques diffèrent selon les régions précises sélectionnées pour microdissection. (A) Gene avec l' expression spécifique à ligule. (B) Gene exprimée dans la ligule et dans les tissus vasculaires. (C) gène exprimé spécifiquement dans la région ligule dans toutes les couches de cellules , mais avec une plus forte expression dans l'épiderme. (D) Gene exprimée dans la région ligule, des couches de cellules L2 dérivées seulement. Les dessins animés représentent des coupes longitudinales primordia foliaires. Le bleu foncé indique l'accumulation de la transcription d'un gène particulier. boîtes vertes, rouges et bleues indiquent la région sélectionnée pour microdissection pour les échantillons lame, ligule et de la gaine. Les dessins animés sur la gauche illustrent LM de toutes les couches de cellules. Les dessins animés sur la droite illustrent LM de seulement épiderme adaxiales. Ad: épiderme adaxiales, Ab: épiderme abaxiales, CPM: COU nts par million. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Sélection des gènes surexprimés dans la ligule primordiale. Comtes par million: comptages par million transcriptions totales, moyenne de trois répétitions, logFC = log base 2 Change Fold, FDR.BH: taux de fausses découvertes selon Benjamini et Hochberg méthode. Toutes les couches: LM de toutes les couches de cellules. Épiderme: LM de seulement épiderme adaxiales. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 6 (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tableau 2: Sélection de gènes mutants dans DE lg1-R. Comtes par million: comptages par million transcriptions totales, moyenne de trois répétitions, logFC = log base 2 Change Fold, FDR.BH: taux de fausses découvertes selon Benjamini et Hochberg méthode. Ce chiffre a été modifié depuis la référence 6 (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La conception expérimentale est un facteur critique dans des expériences d'ARN-seq. Les principales considérations sont le domaine précis (s) et le stade de développement (s) à analyser, et quelles comparaisons seront faites. Il est crucial de penser en termes de comparaisons, puisque la sortie est généralement une liste de gènes qui sont DE entre deux ou plusieurs conditions. Comme avec toutes les expériences, il est important de modifier qu'une seule variable à la fois. Par exemple, lorsque l'on compare les différents domaines de la feuille, les feuilles du même âge et du stade de développement, cultivés dans les mêmes conditions doivent être comparés.
Le but de ces expériences était d'identifier des gènes qui sont spécifiquement haut ou bas réglementés dans la région ligule de type sauvage primordiums foliaires, et d'identifier les gènes qui sont dans des mutants DE lg1-R par rapport au type sauvage. Nous avons d' abord étudié la morphologie du développement primordia foliaires et le motif de l' accumulation de transcription lg1. Ces repères morphologiques et moléculaires wavant utilisé pour sélectionner des domaines précis pour LM 14, 15, 16. Dans la première expérience, l'accumulation de la transcription dans la région ligule a été comparée à d'autres régions du même primordia des feuilles, ce qui élimine les différences dues à des conditions de croissance, fond génétique, stade de développement, et de la variation de plante à plante. Pour comparer mutant de type sauvage, il est nécessaire de déterminer où et quand le gène d'intérêt est exprimé. Nous recommandons d' analyser le schéma d'expression par l' une ou l' hybridation in situ immunolocalisation et en sélectionnant une région LM qui englobe le domaine de l' expression génique. Il est important que les domaines équivalents sont comparés et que le fond génétique est le même pour les deux de type sauvage et mutant.
La précision de microdissections peut être vérifiée en vérifiant les chiffres lus pour les gènes qui sont exprimés spécifiquement dans le domaine d'intérêt, si such gènes sont connus. Ceci peut également être réalisé en effectuant une RT-PCR sur l'ARN extrait de tissu LM avant la création de bibliothèques pour le séquençage. Dans les expériences décrites ici, LG1 a servi de témoin pour LM de la région ligule, étant donné que l'hybridation in situ Des analyses ont montré que l' expression LG1 est spécifique à la BLP et ligule 5, 6 émergent.
A la différence des procédés tels que la RT-PCR quantitative, où le gène (s) candidat doit être connue, l'ARN-seq quantifie accumulation de tous transcrits dans un échantillon de tissu donné. Ainsi, l'ARN LM-seq est une méthode utile pour identifier des gènes candidats. Un exemple de cette étude est GRMZM2G101682, un gène de fonction inconnue qui a un motif d'expression spécifique à ligule frappante (figure 6E). Cette étude a également identifié des gènes qui sont dans DE lg1-R, tels que bel14, qui n'a pas été précédemment impliqués comme agissant en aval de lg1. Dans this par exemple, la comparaison des ensembles de données multiples (upregulated dans la région ligule de type sauvage et dans DE lg1-R) a été particulièrement instructif. Il est important de noter que le motif d'expression d'un gène ne montre pas sa fonction: les analyses génétiques et / ou biochimiques suivantes sont nécessaires pour établir la fonction du gène.
analyses transcriptomiques qui sont axées sur les petits domaines de développement distincts, qui sont différentiellement distinctes et facilement délimitées, sont les plus réussis. LM ARN-seq est une méthode appropriée pour ces analyses et a le potentiel pour être appliqué à de nombreux phénomènes de développement. Il est particulièrement adapté pour identifier l'expression génique différentielle dans des mutants de gènes qui ont spatialement restreintes des motifs d'expression ou des mutants qui affectent le développement de structures spécifiques. Elle peut également être appliquée à des processus qui se produisent dans des cellules ou des tissus spécifiques et identifiables tels que l'épiderme ou le système vasculaire, et a été utilisé dansune analyse transcriptomique du maïs pousse méristème apical (SAM) ontogenèse 16. Il est moins approprié pour étudier la fonction des gènes qui sont exprimés de façon ubiquitaire ou à des processus qui se produisent dans toutes les cellules. Les méthodes présentées ici ont été appliquées avec succès à une variété d'espèces végétales (maïs, sorgho, Ocimum, Mentha et Antirrhinum) et des structures (primordiums foliaires, méristèmes, rhizomes et trichomes).
LM est pas nécessaire si une analyse implique relativement grands domaines. En effet, l' ARN-Seq sur des organes entiers disséqués à la main ou a été utilisé avec succès pour identifier les gènes dans les plantes DE 14, 15. Cette approche a l'avantage d'être moins de main-d'œuvre et aucune expérience avec les techniques histologiques est nécessaire. Cependant, il y a des limites à la précision des dissections de la main, ce qui signifie que la dissection de la main est moins adapté à l'étude au début dprocessus evelopmental.
Pour la réussite LM ARN-Seq analyse des phénomènes de développement, le contexte de développement doit être bien caractérisé. Nous vous recommandons de procéder à un examen histologique approfondi du processus ou d'un domaine d'intérêt avant de planifier une expérience. L'histologie d'échantillons traités pour LM est généralement faible, car les tissus sont des souillures et ne sont pas montés avec des lamelles qui assurent la profondeur de champ. Par conséquent, il est utile de corriger des échantillons distincts pour la coloration et l' observation dans le même temps que les échantillons sont fixés LM (figure 1C, et D).
ARN obtenu à partir de matières de LM est généralement fragmentée et le rendement total est faible 8. Une étape d'amplification est nécessaire pour générer un ARN suffisant pour la préparation de la bibliothèque 28. ARN de longueur des fragments doit être évaluée après amplification et avant la génération de bibliothèque. Une longueur moyenne des fragments de soisieurs centaines de paires de bases est généralement considérée comme bonne, 500 paires de bases est excellent. le rendement de l'ARN pauvre peut résulter si le tissu est pas bien fixe, si la dégradation due à la RNase contamination se produit, ou si des blocs de paraffine sont mal stockés. Il est utile de tester la qualité du tissu fixé en entreprenant une LM d'essai d'une zone relativement grande avant de consacrer beaucoup de temps à microdissecting très petits domaines. Étant donné que l'ARN obtenu à partir des cellules LM est fragmenté et amplification en utilisant une amorce oligo dT présente une forte «polarisation 3, cette méthode ne convient pas pour la détection de transcrits alternatifs, tels que des variants d'épissage. Ni est LM apte à détecter les petits ARN.
Une autre méthode pour quantifier l' accumulation de la transcription dans des tissus spécifiques ou des domaines cellulaires est l' ARN-seq de cellules séparées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 21. Cette méthode nécessite généralement l'identification d'un gène marqueur approprié pour la région d'intérêt,la génération de plantes transgéniques exprimant une protéine fluorescente et protoplastes étiquetée. FACS combinée avec puces à ADN a été utilisé pour générer une carte d'expression de la racine de Arabidopsis en séparant les cellules exprimant des promoteurs spécifiques au type de cellule dans la racine 22, 23. FACS des tissus des pousses est plus difficile que les tissus des racines en raison de la chlorophylle autofluorescence 24. Une limitation de LM est que le domaine d'intérêt doit être identifiable dans les coupes histologiques. FACS peut être une méthode plus appropriée dans les cas où un gène marqueur approprié est disponible. Le choix des cellules ou des tissus pour isoler et de comparer est une considération importante dans les analyses transcriptomiques qui utilisent soit FACS ou LM.
Les données présentées ici montrent que des résultats différents seront obtenus en fonction des domaines précis sélectionnés pour LM (Figure 3, Figure 8). La transcription des gènes qui sont exprimés dans une ou quelques cellules, telles que ns1, seront diluées lorsque de grands domaines de tissu sont analysés. Il est probable que si primordia en feuilles entières ont été échantillonnés, la transcription ns1 ne serait pas détecté. ZmPIN1a est significativement régulée à la hausse dans la ligule par rapport à la lame et de la gaine épiderme , mais cette différence est confondu par l' expression vasculaire lorsque toutes les couches de cellules sont échantillonnées. A l' inverse, les gènes qui sont exprimés seulement dans les couches cellulaires dérivées de L2 ne seront pas détectées lorsque seulement l'épiderme est échantillonné (figure 8D). Cette étude démontre que, tandis que LM ARN-Seq est un outil puissant pour détecter des différences dans l'expression des gènes au cours de la morphogenèse, les domaines choisis pour l'analyse sont essentiels à la réussite de l'expérience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Les auteurs remercient S. Merlu pour collaboration continue et de stimuler les discussions sur le développement ligule. Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences MCB 1.052.051 et IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
