Abstract
Los genes con funciones importantes en el desarrollo con frecuencia tienen patrones de expresión espacial y / o temporalmente restringidas. A menudo, estas transcripciones de genes no se detectan o no son identificados como diferencialmente expresado (DE) en los análisis transcriptomic de órganos de plantas enteras. La microdisección láser RNA-Seq (LM RNA-Seq) es una poderosa herramienta para identificar los genes que se encuentran en dominios DE específicas de desarrollo. Sin embargo, la elección de los dominios celulares para microdissect y comparar, y la exactitud de los microdisecciones son cruciales para el éxito de los experimentos. A continuación, dos ejemplos ilustran las consideraciones de diseño para los experimentos de transcriptómica; un LM análisis de RNA-seq para identificar los genes que están De lo largo del eje proximal-distal hoja de maíz, y un segundo experimento para identificar los genes que son DE en liguleless1-R (LG1-R) mutantes en comparación con el de tipo salvaje. Los elementos clave que contribuyeron al éxito de estos experimentos se detallan histológico y en SIanaliza tu hibridación de la región a analizar, la selección de los primordios de la hoja en las etapas de desarrollo equivalentes, el uso de puntos de referencia morfológicas para seleccionar regiones para microdisección y microdisección de los dominios medidos con precisión. Este documento proporciona un protocolo detallado para el análisis de las áreas de desarrollo de LM RNA-Seq. Los datos aquí presentados ilustran cómo la región seleccionada para microdisección afectará a los resultados obtenidos.
Introduction
La hoja de maíz es un modelo ideal para estudiar la formación de campos de desarrollo durante la morfogénesis, ya que tiene un límite distinto entre la cuchilla y la vaina que es susceptible a la disección genética (Figura 1A). Durante las primeras etapas de desarrollo de las hojas, una banda lineal de células más pequeñas, la banda preligule (PLB), subdivide el primordio de la hoja en dominios pre-cuchilla y pre-vaina. Un lígula franja similar y aurículas triangulares desarrollan a partir de la PLB (Figura 1 A, C, D). cribados genéticos han identificado mutaciones que alteran la frontera hoja-vaina. Por ejemplo, liguleless1 recesivo (LG1) mutaciones eliminar la lígula y aurículas 1, 2, 3, 4 (Figura 1B). La hibridación in situ reveló que la transcripción lg1 se acumula en el PLB y lígula emergentes, por lo que es un excelente marcador para el desarrollo lígula 5, 6 (Figura 1E).
Figura 1: De tipo salvaje y hojas de maíz liguleless1-R. (A) zona de borde de la lámina de la vaina de la hoja de tipo salvaje madura que muestran estructuras lígula y la aurícula. (B) zona de borde de la lámina de las vainas maduras de liguleless1-R hoja que muestra ausencia de estructuras lígula y la aurícula. Hojas en A y B se han reducido a la mitad a lo largo del nervio central. (C) longitudinal a través de la sección primordio de hoja de tipo salvaje. Muestra que se ha procesado y se tiñeron para el análisis histológico. La lígula iniciar es evidente como una protuberancia que sobresale desde el plano de la hoja (punta de flecha). (D) secta Longitudinalprimordio de iones a través de la hoja de tipo salvaje. Muestra que se ha procesado para LM como se describe en el texto. Punta de flecha indica el inicio lígula. (E) lg1 hibridación in situ de rodaje sección longitudinal lateral ápice. Los asteriscos indican la acumulación de transcripción lg1 en el PLB del primordio de hoja P6. Las flechas indican la base de P6 primordio. La barra indica la medición de la base del primordio de la PLB. Las barras de escala en A y B = 20 mm. Las barras de escala en CE = 100 m. Esta cifra se ha modificado de la referencia 6 (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este estudio, se empleó LM RNA-Seq para identificar un conjunto de genes que se expresan diferencialmente (DE) en el límite de la hoja de la vaina en relación con otras partes del primordio de la hoja y a IDE ntify genes que están en lg1 DE-R mutantes en relación con los hermanos de tipo salvaje. LM RNA-Seq es un método de cuantificación de la acumulación de transcripción en células específicas o dominios celulares 7. sistemas LM combinan un láser y un microscopio con una cámara digital. tejido seccionado se monta en portaobjetos y se ve a través del microscopio. El software LM típicamente incluye herramientas de dibujo que permiten al usuario para delinear cualquier región seleccionada para la microdisección. Los cortes de láser a lo largo de la línea, y el tejido seleccionado es catapultado fuera de la diapositiva y en un tubo suspendido por encima de la diapositiva. LM permite al usuario microdissect dominios precisas, incluyendo capas de células específicas e incluso células individuales 8, 9. ARN se puede extraer del tejido microdissected. Posteriormente, el componente de RNA-Seq utiliza secuenciación de próxima generación para secuenciar bibliotecas de ADNc generados a partir de ARN extraído 10,= "xref"> 11.
Las principales ventajas de LM ARN-ss son la capacidad de cuantificar la acumulación de transcripción en dominios definidos con precisión y la capacidad para perfilar todo el transcriptoma simultáneamente 7. La técnica es particularmente adecuada para el sondeo acontecimientos de desarrollo tempranos en la región de interés es a menudo microscópico. Estudios anteriores han utilizado LM combina con la tecnología de microarrays para estudiar los procesos de desarrollo en plantas 9, 12, 13. RNA-Seq tiene la ventaja de la cuantificación de los transcritos en un amplio rango dinámico, incluyendo genes de bajo expresado, y la información de secuencia anterior no se requiere 10, 11. Por otra parte, LM RNA-Seq tiene el potencial para resaltar genes de desarrollo importantes que pueden perderse en las pantallas de mutagénesis debido a la redundancia genética o a la letalidad de la pérdida-de-función mutante.
Genes importantes para el desarrollo, tales como sheath1 estrecha (NS1) y en forma de copa cotyledon2 (CUC2), a menudo tienen patrones de expresión específica de sólo una o unas pocas células 17, 18, 19, 20. Muchos se expresan solamente durante las etapas tempranas del desarrollo y no en el órgano maduro. Cuando se analizan órganos enteros o grandes dominios, estos transcritos específicos de células se diluyen y no pueden detectarse en los análisis más convencionales. Al permitir que los análisis de dominios definidos con precisión, LM RNA-Seq permite que estos genes específicos de tejido para ser identificados y cuantificados.
factores cruciales para el éxito de los experimentos descritos aquí fueron un análisis histológico exhaustivo que guió a la selección de la etapa de desarrollo apropiado y dominio para el análisis y la medida PA precisant de dominios de células de tejidos para LM. Para asegurar que los dominios equivalentes se tomaron muestras para todas las repeticiones, se recogió tejido de primordios de la hoja en la misma etapa de desarrollo y los dominios microdissected se mide en relación con puntos de referencia morfológicos tales como la lígula emergente (Figura 2). Se sabe que algunos genes se expresan en un gradiente desde la punta hasta la base de la hoja. Mediante la medición de dominios precisos, debido a la variación de muestreo de diferentes lugares a lo largo del eje proximal-distal de la hoja se mantiene al mínimo (Figura 3A). Por microdissecting dominios del mismo tamaño, la variación debido a la diferencia de dilución de los transcritos específicos de células también se redujo (Figura 3B). secciones longitudinales laterales del ápice del brote se utilizaron para todos microdisecciones. Estos son secciones que son perpendiculares al eje nervio central margen (Figura 4). Usando sólo las secciones que incluyen la SAM asegura que las regiones laterales equivalentes deSe analizan primordios foliares.
En las muestras procesadas y seccionados para LM, la primera señal morfológica del crecimiento de lígula es una protuberancia en el lado adaxial debido a las divisiones celulares periclinales en la epidermis adaxial (Figura 1 D, Figura 2). Se determinó que la lígula emergente podría ser fiable identificado en plastocrono 7 primordios foliares etapa. Estábamos interesados en los genes expresados en toda la región lígula, incluyendo la lígula emergentes y las células inmediatamente distales que formarán la aurícula. Con el fin de asegurar que se hicieron selecciones de tejidos equivalentes, la protuberancia lígula se utilizó como un punto de referencia morfológica y un rectángulo 100 micras centrado en la protuberancia lígula fue seleccionado para LM (Figura 2A, 2B). rectángulos de tamaño equivalente de pre-lámina y pre-envoltura fueron seleccionados de las mismas primordios foliares.
Los análisis de las plantas mutantes liguleless presentaron un challe diferenteESN; LG1-R mutantes no forman una lígula, por lo tanto, esta característica morfológica no se podría utilizar para seleccionar la región de LM. En lugar de ello, se determinó el dominio de la acumulación de transcripción lg1 en los primordios de la hoja de tipo salvaje, y se definió una región que abarque este dominio. Estos análisis preliminares se realizaron en plantas de semillero de la misma plantación que se utilizaron para el análisis final, ya que el trabajo previo ha demostrado que la ubicación de la PLB varía dependiendo de las condiciones de crecimiento. La hibridación in situ indicó que los transcritos LG1 se acumulan en el PLB de P6 primordios foliares (Figura 1E). Hemos seleccionado un dominio de 400-900 micras desde la base de la primordios foliares que abarcaba el dominio de la expresión lg1 (rectángulos de color violeta, Figura 2A) y capturó estas regiones equivalentes de tipo salvaje y las plantas lg1-R. Para minimizar la variación en el fondo de crecimiento y condiciones genéticas cuando se comparan trascripciónSe utilizaron t acumulación en lg1-R y plantas de tipo salvaje, la segregación de las familias de los mutantes y de tipo salvaje hermanos.
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Protocol
NOTA: Fijar tejido para el análisis histológico, al mismo tiempo que el tejido se fija por LM. Examinar secciones teñidas para las características morfológicas que orientarán más tarde LM. Al comparar mutante de tipo salvaje, lleve a cabo la hibridación in situ o inmunolocalización para definir el dominio en el que se expresa el gen de interés (en este caso lg1).
1. fijación del tejido y Procesamiento
- Crecer pisos de plántulas de maíz de dos semanas de edad en condiciones estándar 6.
- Diseccionar ápices de las secciones laterales (Figura 4).
- Impuestos Especiales de plántulas justo por debajo de la línea del suelo.
- Utilizando una hoja de afeitar, eliminar rodajas finas de la base del tallo (cortes 1, Figura 4A) hasta un óvalo de caña rodeado por una o dos hojas maduras es visible (Figura 4B).
- Hacer otro corte de aproximadamente 10 mm por encima de la base (corte 2, Figura 4A).Este segmento de 10 mm contendrá el SAM y primordios foliares jóvenes.
- Gire el segmento de 10 mm para que la base quede hacia arriba. Hacer dos cortes paralelos al eje lateral de manera que se obtiene un trozo de tejido de 2-3 mm de espesor (cortes 3, y 4, la Figura 4B). Desechar las dos partes exteriores y retener la rebanada central para la fijación e inclusión.
NOTA: hojas exteriores pueden ser recortados y se descartan.
- Fijar un tejido y un proceso para la incrustación.
- Asegúrese de que todos los materiales que se utilizarán en las etapas subsiguientes son RNasa libre. Tratar soluciones con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (1 ml DEPC por litro de solución. Incubar durante la noche con agitación ocasional, y autoclave). cristalería Hornear en un horno a 200 ° C o más durante al menos 6 horas y el tratamiento de artículos de plástico con una solución de descontaminación RNasa.
- Día 1: Sumergir las rebanadas de tejido en ~ 10 ml de solución de Farmer (3: 1 de etanol: ácido acético) en un vial de vidrio sobre hielo. Después de todas las muestras han sido disecados, aplicar vacuum para eliminar las burbujas de aire y la penetración ayuda de fijador. Mantenga al vacío durante 10 minutos y después se liberan lentamente el vacío. Reemplazar fijador y se incuba a 4 ° C durante la noche con agitación suave.
- Día 2: Incubar en la siguiente serie de soluciones, ~ 10 ml cada uno, 1 hr cada uno, todo con agitación suave; 85% de etanol a 4 ° C, 95% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 1: 1 etanol: xilenos a temperatura ambiente, 100% xilenos a temperatura ambiente, 100% xilenos a temperatura ambiente.
NOTA: Los xilenos son tóxicos por contacto y la inhalación. Trabajar en una campana de extracción y el uso de guantes apropiados. - Añadir tejido parafina pelets medio a aproximadamente medio volumen de xilenos y se incuba durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave.
- Día 3: Traslado del vial a 60 ° C horno hasta que los gránulos se funden. Derrame la solución y reemplazar con fresco medio de inclusión de tejido derretida. Cambiar el medio dos veces másdurante el día.
- Día 4: Cambiar el tejido medio de inclusión vez por la mañana. Regreso a 60 ° C horno hasta la tarde.
- bloques elenco
- Colocar los moldes de incrustación en la placa caliente de la estación de incrustación de tejidos. El uso de fórceps para transferir las muestras de tejido de los moldes de la incrustación con la superficie cortada hacia abajo. Rellenar el molde con parafina derretida y colocar el anillo de incrustación en la parte superior del molde. Pasar a un plato frío hasta que la parafina se ha solidificado. Almacenar los bloques de parafina a 4 ° C en un recipiente hermético con gel de sílice.
2. Preparación de seccionamiento y diapositiva
- Cortar 10 micras secciones en un micrótomo 25.
- Examine las cintas y elegir secciones intermedias. La mediana de secciones son los que incluyen la SAM, que aparece como una cúpula de las células rodeadas por primordios foliares.
- secciones de montaje de diapositivas.
- Colocar los portaobjetos que son adecuados para LM (ya sea libre o RNasaal horno) en 42 ° C deslice más caliente y aplicar varias gotas de solución de etanol al 50% para cubrir la diapositiva.
- Flotar secciones en solución de etanol hasta que las secciones se han ampliado.
NOTA: Flotación de cortes en solución de etanol en vez de agua mantiene en un estado de ARN precipitado reducir la degradación del ARN. - Incline diapositiva y eliminar el exceso de solución de etanol por aspiración con una pipeta de transferencia desechable. Use toallitas sin pelusa para secar la solución de etanol adicionales.
- diapositivas de secado a 42 ° C durante varias horas o toda la noche. Tienda desliza a 4 ° C en un recipiente hermético con gel de sílice.
- Desparafinar desliza sobre el día de uso.
- Preparar tres frascos de vidrio que contienen Coplin; 100% xilenos (xilenos I), 100% xilenos (xilenos II), y 100% de etanol (~ 50 ml de cada solución).
- El uso de pinzas limpias para transferir diapositivas, sumerja diapositivas en xilenos yo por 2 min, xilenos II durante 2 min, y 100% de etanol durante 1 min.
- drenaje deslizadoes sobre toallitas sin pelusa y secar al aire a temperatura ambiente.
3. La microdisección de Blade, lígula y la vaina muestras de plastocrono 7 primordios foliares
- Asegure las diapositivas en el escenario de microscopio LM. Utilice cinco o seis diapositivas para cada réplica, utilizando cinco secciones por portaobjetos.
NOTA: Tissue la puesta en común de una sola réplica se ilustra en la Figura 5. - Examinar los portaobjetos e identificar las cinco secciones más la mediana en cada diapositiva, utilizando el SAM ápice como el punto de referencia central.
NOTA: Esto se puede hacer a bajo aumento, por lo general un objetivo de 5X es suficiente. - Uso de 10X o 20X objetivo, identificar la posición de la lígula en la plastocrono 7 primordio de la hoja de cada sección. La lígula será visible como una protuberancia que sobresale de la superficie adaxial del primordio de hoja. Marque esta posición utilizando la herramienta de dibujo del software LM; seleccione el icono del lápiz, mueva el cursor a la positi apropiadaen y haga clic y arrastre el ratón para dibujar.
NOTA: Una 10X o 20X objetivo es apropiada para esto y los pasos subsiguientes. Al usar secciones laterales, los dos lados de cada primordio de hoja estarán presentes en cada sección (Figura 2A). - Utilizando la herramienta de la regla y la herramienta de dibujo rectangular, medir 100 m rectángulos altos centradas en la lígula de cada sección (rectángulos rojos, la Figura 2A, 2B). Estos serán la muestra "lígula".
- Para utilizar la herramienta regla; seleccione el icono regla, mueva el cursor a un extremo del objeto a medir, hacer clic y arrastrar para medir el objeto. La longitud de la regla se mostrará en la pantalla.
- Para dibujar un rectángulo; seleccione el icono rectángulo, mover el cursor a un punto que será una de las esquinas del rectángulo, haga clic y arrastre para dibujar un rectángulo del tamaño apropiado. Como alternativa, seleccione la herramienta de dibujo de línea recta y dibujar cuatro líneas rectas.
- medida 100 micras rectángulos posicionados 50 m por encima y por debajo del rectángulo "Lígula".
NOTA: Estos serán los "Blade" y "muestras" de la envoltura, respectivamente (verde y azul rectángulos, Figura 2A, 2B). En base a los datos histológicos, un rectángulo 100 micras abarca toda la región lígula. porciones de tamaño equivalente de la hoja y la vaina fueron elegidos de forma que se recogieron cantidades similares de tejido para cada uno. Se usaron espaciadores de 50 micras para garantizar que no tejido región lígula se inadvertidamente incluida en la microdisecciones cuchilla o de la vaina.
- Microdissect medido rectángulos (Figura 2D - 2F) 7, 8, 9, recogiendo muestras Lígula, la cuchilla y la vaina en tubos separados. Utilice la función de corte láser para cortar a través de la sección de tejido a lo largo del contorno del dominio seleccionado. Utilice la catafunción pult para propulsar el rectángulo de tejido fuera de la diapositiva y en la tapa del tubo (Figura 2D - 2F).
4. La microdisección de Blade, lígula y la envoltura adaxial epidérmicas Las muestras de plastocrono 7 primordios foliares
- Seleccionar secciones y utilizar la herramienta de regla para medir 100 micras segmentos altos centrados en la lígula plastocrono 7, tal como se describe en la sección 3 (arriba).
- Seleccionar sólo las células de la epidermis adaxial de cada 100 micras alta "Blade" y "la envoltura" del segmento (verde y azul selecciones, Figura 2C) esbozando con la herramienta de dibujo. La epidermis es la capa celular externa; el lado adaxial es el más cercano a la SAM.
- Para la muestra "lígula", seleccionar sólo las células de la protuberancia emergente lígula como se describe en la Sección 3.3 (selección de color rojo, Figura 2C).
- Microdissect regiones seleccionadas, la recogida de la hoja, lígula y Sheaº epidermis muestras en tubos separados, tal como se describe en la sección 3.5.
5. La microdisección de plastocrono 6 primordios foliares de lg1-R y de tipo salvaje Hermanos
- Crecer la segregación de las familias de los mutantes (LG 1-R) y plantas de tipo silvestre.
- Fijar y disparar proceso de ápices para LM, como se describe en las secciones 1.2-1.4. Fijar de tipo salvaje y mutantes ápices en viales separados con el fin de mantenerlos separados. Las muestras de la misma plantación deben ser fijados y procesados para hibridación in situ.
- Determinar dónde lg1 se transcribe en los hermanos de tipo salvaje, mediante la realización de lg1 hibridación in situ 6, 26, 27. La posición de la acumulación de transcripción lg1 desde la base del primordio de la hoja en múltiples muestras (Figura 1E) medir.
- Sobre la base de los datos de hibridación in situ, elegir porción de la hoja primordium que abarca la región en donde se transcribe lg1. En este caso, 400 a 900 micras desde la base de plastocrono 6 primordios foliares (rectángulos de color violeta, Figura 2A).
- Microdissect parte de primordios foliares seleccionada, como se describe en la sección 3.5, la recogida de muestras de tipo salvaje lg1-R y en tubos separados.
6. Aplicar RNA Extraction Buffer
- Aplique 50 l de tampón de extracción de RNA para el tejido microdissected y proceder con la extracción de RNA. Continuar con la extracción de RNA, la amplificación del ARN, la construcción de bibliotecas, secuenciación y análisis bioinformático como se describe en la referencia 6.
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Representative Results
Usando el esquema LM indica en la Figura 2, aproximadamente 1,000,000-1,500,000 m 2 de tejido se recogió para cada replican en el todos-Cell-capas LM (Figura 5), y 200.000 m 2 por réplica para la epidermis adaxial LM. Aproximadamente 2.500.000 m 2 de tejido se recogió para cada réplica en el LM de lg1-R y primordios foliares de tipo salvaje. Dos rondas de amplificación de ARN lineal produjeron cantidades de microgramos de ARN para cada réplica. La cantidad de ARN obtenida de cualquier microdissection dado dependerá del tamaño celular y la actividad transcripcional así como la cantidad de tejido capturado. La integridad del RNA afectará a la eficiencia de la amplificación del ARN.
la acumulación de transcripción fue analizada en todas las capas de células de la hoja, las regiones lígula y la vaina y un total de 2.359 DE GENNo se han encontrado es, con una tasa de falso descubrimiento (FDR), de <0,05 (Figura 6A). Específicamente, 1.714 genes eran DE entre lígula y la cuchilla, 1.044 genes eran DE entre lígula y la vaina, y 657 genes fueron DE entre la cuchilla y la vaina (algunos genes son DE en más de una comparación). Los genes se clasificaron como upregulated en la región lígula si se upregulated significativamente tanto en lígula en comparación con la cuchilla y lígula en comparación con vaina. En el todas las capas de células LM, 373 genes fueron significativamente upregulated en la región lígula.
la acumulación de transcripción se analizó en las regiones de hoja epidermis, lígula y la vaina adaxial y no se encontraron un total de 3.128 genes DE; 1.971 genes estaban DE entre lígula y la cuchilla, 2.032 genes estaban DE entre lígula y la vaina, y 871 genes fueron DE entre la hoja y la vaina (Figura 6B). 287 genes fueron regulados por incremento de manera significativa en la lígula en comparación con la hoja y la vaina epidermis.
Los datos de los genes seleccionados que se upregulated en la región lígula se presentan en la Tabla 1 y la Figura 7. Una inicial en el análisis de hibridación in situ indicó que los transcritos LG1 se acumulan específicamente en el PLB y la lígula emergente de los primordios de la hoja de tipo salvaje, y que LG1 es más altamente transcrito en la epidermis que en las capas de células internas (Figura 6C). Los datos de RNA-seq LM que se obtuvieron son consistentes con este resultado; la acumulación de transcripción lg1 es significativamente mayor en la lígula que en cualquiera cuchilla o funda tanto en la LM epidérmica y LM de todas las capas de células (Tabla 1, Figura 7A). lg1 tiene un CPM más alta en el análisis de la epidermis que en el análisis de todas las capas de células, similar a la situación ilustrada en la figura 8C.
ns1 se upregulated significativamente en la región lígula tanto en las todas las capas de células LM y la epidermis adaxial LM (Tabla 1, Figura 7B). Este hallazgo se confirmó mediante hibridación in situ, lo que demuestra que la transcripción ns1 acumula específicamente en la punta de la lígula emergente (Figura 6D). ns1 tiene un recuento de leer mucho más alta en la epidermis de sólo análisis LM que en LM de todas las capas de células (19,6 CPM y 2,7 CPM, respectivamente) debido a la dilución de la transcripción en el todas las capas LM. Este efecto de dilución se ilustra en la Figura 8A. Del mismo modo, GRMZM2G101682, un gen de función desconocida, tenía una lectura media de aumento en el recuento en el LM epidérmico lígula que en el todas las capas LM (Tabla 1, Figura 7C). La hibridación in situ reveló que este transcrito de gen también se acumula más fuertemente en las células epidérmicas (Figura 6E). Zm PIN1a no fue significativamente DE en el análisis de todas las capas de células, pero se upregulated significativamente en la lígula en el análisis epidermis solamente (Tabla 1, Figura 7D). Esto es más probable porque Zm PIN1a es altamente expresado en los tejidos vasculares y esta expresión vascular L2 derivados confunde diferencias en la acumulación Zm PIN1a en la epidermis cuando todas las capas de células se recogen (Figura 6F). Un escenario similar se representa en la figura 8B.
Para identificar los genes que se encuentran en lg1 DE-R mutantes, la acumulación de transcripción se comparó en una región definida de tipo salvaje y primordios foliares lg1-R P6. Noventa y seis genes estaban en lg1 DE-R (FDR <0,05); 59 se downregulated en lg1-R mutantes, y 37 fueron upregulated. Los datos correspondientes a los genes seleccionados que están en DE <em> lg1-R mutantes se presentan en la Tabla 2. bel14 es uno de los 34 genes que están regulados al alza tanto en la región lígula en los primordios de la hoja de tipo salvaje y downregulated en lg1-R mutantes. La hibridación in situ confirmó que las transcripciones bel14 se acumulan en la región preligule en las plantas de tipo salvaje, pero no en la región correspondiente de lg1-R primordios foliares 6.
Figura 2: Esquema de microdisección por láser de hoja dominios primordiales. (A) sección longitudinal lateral del ápice del brote de maíz procesado para LM. Las cajas indican regiones seleccionadas para microdisección. tejido región lígula (cuadro rojo) se microdissected de 100 micras rectángulos altos, centradas en el PLB. Pre-cuchilla (verde) y el tejido pre-vaina (azul) se tomó de 100 micrasrectángulos 50 m por encima y por debajo de la selección preligule respectivamente. Para la comparación de tipo salvaje y transcriptomes lg1-R, tejido entre 400-900 micras desde la base de primordios foliares P6 se microdissected de las secciones laterales (púrpura línea discontinua). (B) Primer plano de P7 primordio y regiones seleccionadas por microdisección de todas las capas de células. (C) Primer plano de P7 primordio y regiones seleccionadas por microdisección de la epidermis adaxial. (D) Preligule región del primordio P7 antes de microdisección. Punta de flecha indica la posición de iniciar lígula. (E) La línea roja indica región seleccionada para la microdisección. El láser se corta a lo largo de esta línea. Los círculos indican los puntos en los pulsos de láser catapultará tejido. (F) Primordium después de microdisección. Los círculos indican los puntos en los pulsos de láser han catapultado el tejido. SAM = disparar meristemo apical. P indica el número de plastocronos. Barras de escala = 100 y# 181; m. Esta cifra se ha modificado de la referencia 6 (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La región seleccionada para LM afecta a los recuentos de lectura de los genes que se de a lo largo del primordio de hoja. (A) El posicionamiento preciso de la región seleccionada para LM en relación con hitos morfológicos reduce la variación de los genes expresados en un gradiente a lo largo del eje de la hoja. En repeticiones 1-3 de la izquierda, las selecciones se centran en la lígula emergente resulta en una baja variación. En repeticiones 1-3 de la derecha, el posicionamiento de la región seleccionada para LM no es consistente resulta en una mayor variación. (B) microdissecting un tamaño uniforme selecciones reduce la variación (1-3 repeticiones a la izquierda) en comparación con microdissecting diferentes selecciones de tamaño (1-3 repeticiones a la derecha) de los genes con patrones de expresión específica lígula. Las transcripciones se diluyeron más en la selección más grande, lo que resulta en un conteo leído más bajo, y más concentrada en la selección más pequeña, lo que resulta en un conteo leído más alto. Caricaturas representan secciones longitudinales a través primordios foliares en la región lígula. Punta de flecha indica el inicio lígula. CPM = cuentas por millón. SD = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La disección de la plántula de maíz para las secciones laterales. (A) de plántulas de maíz de dos semanas de edad extirpado en el cruce entre raíces y brotes. Retire rebanadas delgadas from la base del brote (1) hasta un pequeño óvalo de caña es visible en la base de lanzamiento. Dar corte transversal de aproximadamente 10 mm por encima de la base (2) y retener este cilindro. (B) del cilindro de tejido orientado de modo de base quede hacia arriba. Nota ovalada de caña rodeada por hoja. Hacer dos cortes longitudinales paralelos al eje lateral (3 y 4). Retener y fijar la rebanada central de tejido, esta parte incluirá la SAM y los primordios de hojas jóvenes. (C) de la historieta que ilustra plano de sección lateral (verde línea discontinua) a través ápice del brote. círculo rojo indica el nervio medio, punta de flecha roja indica los márgenes de primordio de hoja gris. Azul línea discontinua: eje nervio central del margen. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Animación que ilustra la puesta en común de tejido microdissected láser para una réplica de la región lígula. Tejido microdissected de cinco a seis diapositivas se agruparon para cada réplica. Cinco secciones intermedias de cada diapositiva se utilizan y dos selecciones (rectángulos rojos) están hechos de cada sección. Cada rectángulo es de aproximadamente 20.000 m 2. Tejido para cada réplica se recoge en un tubo separado (óvalo azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: El número de genes DE en las comparaciones por pares entre las regiones de la hoja y la hibridación in situ de los genes se anula su selección. (A) Número de genes DE en comparación por pares entreblade, lígula y la vaina regiones, LM de todas las capas de células. (B) Número de genes DE en comparación por pares entre las regiones de cuchilla, lígula y la vaina, LM de sólo epidermis adaxial. (C) lg1 hibridación in situ. (D) ns1 hibridación in situ. (E) GRMZM2G101682 hibridación in situ. (F) ZmPIN1a hibridación in situ. DE: expresa de forma diferente. En L: en lígula, en B: en la hoja. En S: en la vaina. Las puntas de flecha indican en la FQ lígula emergente. Flecha F indica en la acumulación de transcripción en los tejidos vasculares. Barras de escala = 100 m. Esta cifra se ha modificado de la referencia 6 (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 7: Representación gráfica de datos de genes se anula su selección. La figura ilustra los datos presentados en la Tabla 1 y en los resultados de hibridación in situ. Caricaturas representan secciones longitudinales a través primordios foliares. El azul oscuro indica la acumulación de transcripción de un gen particular. cuadros de color verde, rojo y azul indican región seleccionada para la microdisección para las muestras de hoja, lígula y la vaina. Dibujos de la izquierda ilustran LM de todas las capas de células. Dibujos animados de la derecha ilustran LM de sólo epidermis adaxial. Ad: adaxial epidermis, Ab: la epidermis abaxial, CPM: recuentos por millón, asterisco indica diferencia significativa entre los dos dominios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 8: La historieta que ilustra cómo leer el recuento de los genes hipotéticos DE difieren dependiendo de las regiones precisas seleccionadas para microdisección. (A) Gen con la expresión-lígula específico. (B) gen expresado en la lígula y en los tejidos vasculares. (C) gen expresado específicamente en la región lígula en todas las capas de células pero con una mayor expresión en la epidermis. (D) gen expresado en la región lígula, capas de células derivadas de L2 solamente. Caricaturas representan secciones longitudinales a través primordios foliares. El azul oscuro indica la acumulación de transcripción de un gen particular. cuadros de color verde, rojo y azul indican región seleccionada para la microdisección para las muestras de hoja, lígula y la vaina. Dibujos de la izquierda ilustran LM de todas las capas de células. Dibujos animados de la derecha ilustran LM de sólo epidermis adaxial. Ad: epidermis adaxial, Ab: la epidermis abaxial, CPM: COU NTS por millón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Selección de genes regulados positivamente en la lígula primordial. Las cuentas por millones: recuentos totales por millón de transcripciones, media de tres réplicas, logFC = log de base 2 veces el cambio, FDR.BH: tasa de falso descubrimiento según el método de Benjamini y Hochberg. Todas las capas: LM de todas las capas de células. Epidermis: LM de sólo epidermis adaxial. Esta cifra se ha modificado de la referencia 6 (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Tabla 2: Los genes seleccionados del DE en lg1-R mutantes. Las cuentas por millones: recuentos totales por millón de transcripciones, media de tres réplicas, logFC = log de base 2 veces el cambio, FDR.BH: tasa de falso descubrimiento según el método de Benjamini y Hochberg. Esta cifra se ha modificado de la referencia 6 (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
Diseño experimental es un factor crítico en los experimentos de RNA-seq. Las principales consideraciones son el dominio preciso (s) y la etapa de desarrollo (s) para ser analizados, y se hará lo que las comparaciones. Es crucial para pensar en términos de comparaciones, ya que la salida es normalmente una lista de genes que se de entre dos o más condiciones. Al igual que con todos los experimentos, es importante para alterar sólo una variable a la vez. Por ejemplo, al comparar los diferentes dominios de la hoja, las hojas de la misma edad y etapa de desarrollo, que se cultiva en las mismas condiciones deben ser comparados.
El objetivo de estos experimentos era identificar los genes que son específicamente hacia arriba o hacia abajo-regulada en la región lígula de primordios foliares de tipo salvaje, y para identificar los genes que están en lg1 DE-R mutantes en comparación con el de tipo salvaje. Primero se estudió la morfología de desarrollo primordios foliares y el patrón de acumulación de transcripción lg1. Estos hitos morfológicos y moleculares wERE utiliza para seleccionar dominios precisos para LM 14, 15, 16. En el primer experimento, la acumulación de transcripción en la región lígula se comparó con otras regiones del mismo primordios foliares, eliminando así las diferencias debidas a las condiciones de crecimiento, los antecedentes genéticos, etapa de desarrollo, y la variación de la planta a planta. Para comparar mutante de tipo salvaje, es necesario para determinar dónde y cuando el gen de interés se expresa. Se recomienda analizar el patrón de expresión por cualquiera de hibridación in situ o inmunolocalización y la selección de una región de LM que abarca el dominio de la expresión génica. Es importante que los dominios equivalentes se comparan y que el fondo genético es el mismo para ambos de tipo salvaje y mutante.
La precisión de microdisecciones puede ser verificada mediante la comprobación de los recuentos de leer para los genes que son expresados específicamente en el dominio de interés, si suSe conocen los genes cap. Esto también se puede hacer mediante la realización de RT-PCR en ARN extraído de tejido LM antes de hacer las bibliotecas para la secuenciación. En los experimentos descritos aquí, lg1 sirvió como control para LM de la región lígula, ya que en los análisis de hibridación in situ se había demostrado que la expresión lg1 es específico de la PLB y lígula 5, 6 emergente.
A diferencia de métodos tales como RT-qPCR, donde debe ser conocido el gen (s) candidato, RNA-seq cuantifica la acumulación de todas las transcripciones en una muestra de tejido dada. Por lo tanto, LM RNA-seq es un método útil para identificar genes candidatos. Un ejemplo de este estudio es GRMZM2G101682, un gen de función desconocida que tiene un patrón de expresión-lígula específica sorprendente (Figura 6E). Este estudio también identifica los genes que se encuentran en lg1 DE-R, como bel14, que anteriormente no habían sido implicados como actuar aguas abajo de lg1. en This ejemplo, la comparación de múltiples conjuntos de datos (upregulated en la región lígula de tipo salvaje y DE en lg1-R) fue particularmente informativo. Es importante tener en cuenta que el patrón de expresión de un gen no demuestra su función: se requieren análisis genéticos y / o bioquímicos posteriores para establecer la función de genes.
Transcriptomic análisis que se centran en las áreas de desarrollo pequeños y discretos, que son diferencialmente distinta y fácilmente delineados, son los más exitosos. LM RNA-seq es un método apropiado para este tipo de análisis y tiene el potencial para ser aplicado a muchos fenómenos de desarrollo. Es especialmente adecuado para identificar la expresión diferencial de genes en mutantes de genes que han restringido espacialmente los patrones de expresión, o mutantes que afectan al desarrollo de las estructuras específicas. También puede ser aplicado a los procesos que se producen en las células o tejidos específicos e identificables, tales como la epidermis o la vasculatura, y se ha utilizado enun análisis de transcriptómica de maíz disparar meristemo apical (SAM) ontogenia 16. Es menos adecuado para estudiar la función de genes que se expresan de manera ubicua o para procesos que ocurren en todas las células. Los métodos que aquí se han aplicado con éxito a una gran variedad de especies vegetales (maíz, sorgo, Ocimum, Mentha y Antirrhinum) y estructuras (primordios foliares, meristemos, rizomas y tricomas).
LM no es necesario cuando un análisis implica relativamente grandes dominios. De hecho, RNA-Seq en los órganos diseccionados a mano o enteros se ha utilizado con éxito para identificar genes DE en las plantas 14, 15. Este enfoque tiene la ventaja de ser menos intensivo de trabajo y no se requiere experiencia con técnicas histológicas. Sin embargo, hay limitaciones a la precisión de las disecciones de la mano, lo que significa que la disección mano es menos adecuado para el estudio de principios desarrollo procesos.
Para los análisis de éxito LM RNA-Seq de los fenómenos de desarrollo, el contexto de desarrollo debe estar bien caracterizada. Recomendamos la realización de un examen histológico exhaustivo del proceso o dominio de interés antes de planear un experimento. La histología de las muestras procesadas para LM es generalmente pobre, ya que los tejidos son sin mancha y no se montan con cubreobjetos que proporcionan la profundidad de campo. Por lo tanto, es útil para fijar muestras separadas para la tinción y observación en el mismo tiempo que las muestras de LM se fijan (Figura 1C y D).
ARN obtenido a partir de material LM es generalmente fragmentada y el rendimiento total es de 8. Una etapa de amplificación se requiere para generar suficiente ARN para la preparación de la biblioteca 28. RNA de longitud de fragmentos debe evaluarse después de la amplificación y antes de la generación de la biblioteca. Una longitud media fragmento de seVeral cientos de pares de bases se consideran en general buena, 500 pares de bases es excelente. ARN rendimiento pobre podría presentarse si el tejido no está bien fija, si se produce la degradación debida a la contaminación RNasa, o si los bloques de parafina se almacenan de forma incorrecta. Es útil para probar la calidad del tejido fijado mediante la realización de una película de prueba de un área relativamente grande antes de dedicar mucho tiempo a microdissecting muy pequeños dominios. Debido a que el ARN obtenido de células LM está fragmentada y amplificación utilizando un cebador oligo dT introduce una fuerte "sesgo 3, este método no es adecuado para la detección de transcritos alternativos, tales como variantes de empalme. Tampoco es LM adecuado para detectar pequeños RNAs.
Un método alternativo para cuantificar la acumulación de transcripción en tejidos específicos o dominios celulares se RNA-seq de células separadas por fluorescencia de células activadas (FACS) 21. Este método generalmente requiere la identificación de un gen marcador adecuado para la región de interés,la generación de plantas transgénicas que expresan una proteína y protoplastos fluorescente etiquetados. FACS combinados con microarray se ha utilizado para generar un mapa de expresión de la raíz de Arabidopsis mediante la separación de las células que expresan promotores específicos del tipo de células en la raíz 22, 23. FACS de tejidos de brotes es más difícil que los tejidos de la raíz debido a la clorofila autofluorescencia 24. Una limitación de LM es que el dominio de interés debe ser identificable en secciones histológicas. FACS puede ser un método más apropiado en los casos en que un gen marcador adecuado está disponible. La elección de qué células o tejidos para aislar y comparar es una consideración importante en los análisis de transcriptómica que utilizan cualquiera de FACS o LM.
Los datos aquí presentados ilustran que se obtendrán resultados diferentes dependiendo de los dominios seleccionados precisas para LM (Figura 3, Figura 8). Las transcripciones de genes que se expresan en una o unas pocas células, tales como ns1, se diluyen cuando se analizan grandes dominios de tejido. Es probable que si se tomaron muestras de los primordios de hoja entera, no sería detectado transcripción ns1. ZmPIN1a está regulada positivamente de manera significativa en la lígula en comparación con la hoja y la vaina de la epidermis, pero esta diferencia es confundida por la expresión vascular cuando se toman muestras de todas las capas de células. Por el contrario, no serán detectados genes que se expresan sólo en las capas de células derivadas de L2 cuando sólo la epidermis se toman muestras (Figura 8D). Este estudio demuestra que, si bien LM RNA-Seq es una poderosa herramienta para la detección de diferencias en la expresión génica durante la morfogénesis, los dominios seleccionados para el análisis son cruciales para el éxito del experimento.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a S. Hake para la colaboración en curso y estimular los debates sobre el desarrollo lígula. Este trabajo es apoyado por la National Science Foundation Grants MCB 1052051 y IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
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