Abstract
I geni con ruoli importanti nello sviluppo spesso hanno modelli di espressione spazialmente e / o temporalmente limitati. Spesso questi trascritti genici non vengono rilevate o non sono identificati come differenzialmente espressi (DE) in analisi trascrittomica di organi vegetali integrali. Microdissezione laser RNA-Seq (LM RNA-Seq) è un potente strumento per identificare i geni che sono DE in specifici ambiti di sviluppo. Tuttavia, la scelta dei domini cellulari per microdissect e confrontare, e la precisione dei microdissections sono cruciali per il successo degli esperimenti. Qui, due esempi illustrano considerazioni di progettazione per gli esperimenti trascrittomica; un LM analisi RNA-seq per identificare geni che sono de lungo l'asse prossimale-distale foglia di mais, e un secondo esperimento di identificare geni che sono DE in liguleless1-R (lg1-R) mutanti rispetto al wild-type. Gli elementi chiave che hanno contribuito al successo di questi esperimenti sono stati dettagliati istologica e in SItu ibridazione analisi della regione da analizzare, la selezione della foglia primordi a stadi di sviluppo equivalenti, l'uso di punti di riferimento morfologici per selezionare le regioni per microdissezione e microdissezione dei domini misurato con precisione. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per l'analisi dei domini di sviluppo da LM RNA-Seq. I dati qui presentati illustrano come l'area selezionata per microdissezione influenzerà i risultati ottenuti.
Introduction
La foglia mais è un modello ideale per studiare la formazione di campi di sviluppo durante morfogenesi, in quanto ha un confine netto tra la lama e guaina che è suscettibile di dissezione genetica (Figura 1A). Durante le prime fasi di sviluppo foglia, una banda lineare di celle più piccole, la band preligule (PLB), suddivide il primordio foglia in domini pre-blade e pre-guaina. A ligule frange-like e atri triangolari sviluppano dalla PLB (Figura 1A, C, D). schermi genetici hanno identificato mutazioni che inficiano il confine lama-guaina. Ad esempio, liguleless1 recessivo (LG1) mutazioni eliminare la ligula e orecchiette 1, 2, 3, 4 (Figura 1B). L'ibridazione in situ ha rivelato che la trascrizione LG1 si accumula al PLB e ligula emergente, che lo rende un ottimo indicatore per lo sviluppo ligula 5, 6 (Figura 1E).
Figura 1: wild-type e foglie di mais liguleless1-R. (A) regione Blade-guaina confine del maturo wild-type foglio che mostra le strutture ligula e padiglione auricolare. (B) regione Blade-guaina confine del maturo liguleless1-R foglio che mostra l'assenza di strutture ligula e padiglione auricolare. Foglie in A e B sono stati tagliati a metà lungo la nervatura centrale. (C) Sezione longitudinale attraverso wild-type foglia primordio. Esempio è stato elaborato e colorati per l'analisi istologica. Il ligule avvio è evidente come un urto che sporge dal piano della foglia (freccia). (D) sez longitudinaleioni attraverso wild-type foglia primordio. Esempio è stato elaborato per LM come descritto nel testo. Arrowhead indica l'avvio ligula. (E) lg1 ibridazione in situ di ripresa apex sezione longitudinale laterale. Gli asterischi indicano l'accumulo di trascrizione LG1 al PLB del primordio foglia P6. Le frecce indicano base del P6 primordio. La barra indica misura dalla base del primordium al PLB. Barre di scala in A e B = 20 mm. Barre di scala nella CE = 100 micron. Questa cifra è stata modificata da riferimento 6 (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In questo studio, LM RNA-Seq è stato impiegato per identificare una serie di geni che sono differenzialmente espressi (DE) alla lama fodero confine rispetto ad altre parti del primordium foglia e di ide i geni che sono ntify DE in LG1-R mutanti rispetto al wild-type fratelli. LM RNA-Seq è un metodo per quantificare l'accumulo di trascrizione in cellule specifiche o domini cellulari 7. sistemi LM combinano un laser e un microscopio con una fotocamera digitale. tessuto sezionato è montato su guide e vista attraverso il microscopio. Il software LM in genere include strumenti di disegno che consentono all'utente di delineare qualsiasi regione selezionata per microdissezione. I tagli laser lungo la linea, e il tessuto selezionato viene catapultato dal vetrino e in un tubo sospeso sopra la diapositiva. LM consente all'utente di microdissect domini precise, comprese strati cellulari specifici e anche le cellule singole 8, 9. RNA può quindi essere estratta dal tessuto microdissezione. Successivamente, il componente di RNA-Seq utilizza sequenziamento di prossima generazione per sequenziare librerie di cDNA generate dal estratto RNA 10,= "xref"> 11.
I principali vantaggi di LM RNA-Seq sono la capacità di quantificare l'accumulo di trascrizione in domini ben definiti e la capacità di profilare l'intero trascrittoma contemporaneamente 7. La tecnica è particolarmente adatto per sondare eventi precoci di sviluppo in cui la regione di interesse è spesso microscopica. Studi precedenti hanno utilizzato LM combinato con la tecnologia microarray per studiare i processi evolutivi nelle piante 9, 12, 13. RNA-Seq ha il vantaggio di quantificare trascritti attraverso un'ampia gamma dinamica, compresi i geni espressi basso, e le informazioni prima sequenza non è necessaria 10, 11. Inoltre, LM RNA-Seq ha il potenziale per evidenziare evolutivamente importanti geni che possono essere perse nelle schermate di mutagenesi a causa di ridondanza genetica, o per letalità della perdita-di-funzione di mutante.
Geni evolutivamente importanti, come sheath1 stretto (NS1) e a forma di coppa cotyledon2 (cuc2), hanno spesso specifici pattern di espressione di una sola o poche cellule 17, 18, 19, 20. Molti sono espressi solo durante le prime fasi di sviluppo e non nell'organo maturo. Quando interi organi o grandi domini vengono analizzate, queste trascrizioni specifici delle cellule sono diluiti e non possono essere rilevati nelle analisi più convenzionali. Permettendo analisi di domini ben definiti, LM RNA-Seq permette a questi geni tessuto-specifici per essere identificati e quantificati.
fattori cruciali per il successo degli esperimenti descritti qui erano una approfondita analisi istologica che ha guidato la selezione della fase di sviluppo appropriato e dominio per l'analisi, e precisa MeasureMent dei domini delle cellule dei tessuti per LM. Per assicurare che i domini equivalenti sono stati campionati per tutte le repliche, il tessuto è stato raccolto dalla foglia primordi allo stesso stadio di sviluppo ei domini microdissezione stati misurati rispetto a punti di riferimento morfologici come la ligule emergente (Figura 2). E 'noto che alcuni geni sono espressi in un gradiente dalla punta alla base della foglia. Misurando domini precisi, variazione dovuta al campionamento da posizioni diverse lungo l'asse prossimale-distale foglia è stato ridotto al minimo (figura 3A). Con microdissecting domini della stessa dimensione, variazione dovuta differenziale diluizione dei trascritti specifici delle cellule è stato ridotto (Figura 3B). Laterali sezioni longitudinali dell'apice riprese stati usati per tutte microdissections. Questi sono sezioni che sono perpendicolari all'asse nervatura-margine (Figura 4). Usando solo le sezioni che includono il SAM assicura che le regioni laterali equivalenti diprimordi fogliari vengono analizzati.
In campioni trattati e sezionate per LM, il primo segno morfologico escrescenza ligule è un urto sul lato adaxial causa di divisioni cellulari periclinal nell'epidermide adaxial (Figura 1D, Figura 2). È stato stabilito che la ligula emergente potrebbe essere identificate in modo attendibile a plastochron 7 primordi fogliari fase. Eravamo interessati a geni espressi in tutta la regione, tra cui la ligula ligula emergenti e le cellule immediatamente distali che formeranno il padiglione auricolare. Al fine di garantire che le selezioni tessuto equivalenti sono state effettuate, il bump ligula è stato utilizzato come punto di riferimento morfologica e un rettangolo 100 micron centrata su urto ligule stato selezionato per LM (Figura 2A, 2B). rettangoli equivalenti dimensioni di pre-lama e pre-guaina sono stati selezionati dalle stesse primordi fogliari.
Le analisi delle piante mutanti liguleless presentato un Challe diversoESN; LG1-R mutanti non formano un ligule, quindi questa caratteristica morfologica non può essere utilizzato per selezionare la regione per LM. Invece, il dominio di accumulo trascrizione lg1 in wild-type leaf primordia stata determinata, ed una regione che comprenda questo dominio è stato definito. Queste analisi preliminari sono state effettuate su piantine dalla stessa piantagione come sono stati utilizzati per l'analisi finale, dal lavoro precedente ha mostrato che la posizione del PLB varia a seconda delle condizioni di crescita. L'ibridazione in situ ha indicato che le trascrizioni LG1 si accumulano nel PLB di P6 foglia primordi (Figura 1E). Abbiamo scelto un dominio 400-900 micron dalla base della primordia foglia che comprendeva il dominio di espressione lg1 (rettangoli viola, Figura 2A) e catturato queste regioni equivalenti da wild-type e piante lg1-R. Per ridurre al minimo la variazione in background e di crescita genetiche condizioni quando si confrontano transcript accumulo in LG1-R e le piante wild-type, segreganti famiglie di mutanti e wild-type fratelli sono stati utilizzati.
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Protocol
NOTA: Fix tessuto per l'analisi istologica allo stesso tempo che il tessuto è fissato per LM. Esaminare sezioni colorate per caratteristiche morfologiche che guideranno successivamente LM. Quando si confrontano mutante wild-type, eseguire ibridazione in situ o immunolocalizzazione per definire il dominio in cui viene espresso il gene di interesse (in questo caso lg1).
1. Fissazione dei tessuti e la lavorazione
- Crescere appartamenti di piantine di mais a due settimane in condizioni standard 6.
- Sezionare apici sparare per le sezioni laterali (figura 4).
- Excise piantina appena sotto la linea del terreno.
- Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere fette sottili dalla base del fusto (tagli 1, Figura 4A) finché un ovale culm circondata da uno o due foglie adulte è visibile (Figura 4B).
- Fare un altro taglio di circa 10 mm sopra la base (tagliare 2, figura 4A).Questo segmento 10 millimetri conterrà il SAM e giovani primordi fogliari.
- Ruotare il segmento di 10 mm, in modo che la base sia rivolto verso l'alto. Fare due tagli paralleli all'asse laterale in modo che una porzione di spessore del tessuto 2-3 mm si ottiene (tagli 3 e 4, Figura 4B). Eliminare le esterne due porzioni e mantenere la fetta centrale per la fissazione e inclusione.
NOTA: foglie esterne possono essere tagliati e scartati.
- Fissare il tessuto e il processo per l'incorporamento.
- Assicurarsi che tutti i materiali da utilizzare nei passaggi successivi sono RNasi gratuito. Trattare soluzioni con dietilpirocarbonato (DEPC) (1 ml DEPC per litro di soluzione. Incubare per una notte con agitazione intermittente, e autoclave). Cuocere vetreria in forno a 200 ° C o superiore per almeno 6 ore e trattare articoli di plastica con una soluzione di decontaminazione RNasi.
- Giorno 1: Immergere le fette di tessuto a ~ 10 ml di soluzione di Farmer (3: 1 Etanolo: Acido acetico) in flacone di vetro sul ghiaccio. Dopo che tutti i campioni sono stati sezionati, applicare vacuum per rimuovere le bolle d'aria e la penetrazione ausilio di fissativo. Tenere sotto vuoto per 10 minuti quindi rilasciare il vuoto lentamente. Sostituire fissativo e incubare a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento.
- 2 ° giorno: incubare nella seguente serie di soluzioni, ~ 10 ml ciascuna, 1 ora ciascuna, tutte con dolce agitazione; 85% di etanolo a 4 ° C, 95% di etanolo a 4 ° C, 100% di etanolo a 4 ° C, 100% di etanolo a 4 ° C, 100% di etanolo a 4 ° C, 1: 1 etanolo: xileni a temperatura ambiente, 100% xileni a temperatura ambiente, 100% xileni a temperatura ambiente.
NOTA: Xileni sono tossici per contatto e l'inalazione. Lavorare in una cappa aspirante e usare guanti appropriati. - Aggiungere tessuto inclusione in paraffina pellet di media a circa la metà del volume di xileni e incubare una notte a temperatura ambiente agitando delicatamente.
- Giorno 3: Trasferire il flacone a 60 ° C forno fino a quando il pellet si sciolgono. Eliminare la soluzione e sostituirlo con fresco tessuto fuso mezzo di inclusione. Modificare le medie altre due voltedurante il giorno.
- 4 ° giorno: Modifica tessuto mezzo di inclusione una volta al mattino. Ritorno a 60 ° C forno fino al pomeriggio.
- blocchi del cast
- Mettere stampi embedding sulla piastra calda della stazione di tessuti incorporamento. Utilizzare pinze per trasferire i campioni di tessuto per gli stampi incorporamento con la superficie di taglio rivolto verso il basso. Riempire lo stampo con paraffina fusa e posizionare l'anello incorporamento sulla parte superiore dello stampo. Trasferire in un piatto freddo fino a quando la paraffina si è solidificato. Memorizzare i blocchi di paraffina a 4 ° C in un contenitore ermetico con gel di silice.
2. Sezioni e scorrere Preparazione
- Tagliare 10 sezioni micron su un microtomo 25.
- Esaminare nastri e scegliere le sezioni mediane. sezioni mediani sono quelli che includono la SAM, che appare come una cupola di cellule circondate da primordi fogliari.
- sezioni Montare su diapositive.
- Collocare i vetrini che sono adatti per LM (sia RNasi gratuito oal forno) su 42 ° C più caldo scorrere e applicare alcune gocce di soluzione di etanolo al 50% per coprire la diapositiva.
- Float sezioni sulla soluzione di etanolo fino a che le sezioni hanno ampliato.
NOTA: le sezioni di galleggiamento sulla soluzione di etanolo piuttosto che l'acqua continua a RNA in uno stato precipitato ridurre la degradazione dell'RNA. - Inclinare scivolo e rimuovere soluzione di etanolo in eccesso mediante aspirazione con una pipetta di trasferimento usa e getta. Utilizzare salviettine privo di lanugine per allontanare qualsiasi soluzione di etanolo aggiuntivo.
- diapositive a secco a 42 ° C per diverse ore o durante la notte. Conservare scivola a 4 ° C in un contenitore ermetico con gel di silice.
- Deparaffinare scorre il giorno di utilizzo.
- Preparare tre vasetti di vetro contenenti Coplin; 100% xileni (xileni I), 100% xileni (xilene II), e 100% di etanolo (~ 50 ml di ciascuna soluzione).
- Utilizzando pinze pulite per trasferire le diapositive, immergere i vetrini in xileni I per 2 minuti, xileni II per 2 minuti, e il 100% di etanolo per 1 min.
- drain scivolatoes su salviettine senza peli e aria secca a temperatura ambiente.
3. Microdissezione di Blade, ligula e guaina campioni di Plastochron 7 Leaf Primordia
- Fissare le diapositive sul palco del microscopio LM. Utilizzare cinque o sei diapositive per ogni replica, utilizzando cinque sezioni per diapositiva.
NOTA: Tissue pool per un singolo replicato è illustrato in figura 5. - Esaminate diapositive e identificare le cinque sezioni più mediani su ciascun vetrino, utilizzando il SAM apice come punto di riferimento centrale.
NOTA: Questo può essere fatto a basso ingrandimento, di solito un obiettivo 5X è sufficiente. - Utilizzando 10X o 20X obiettivo, identificare la posizione del ligule sul plastochron 7 foglio primordium di ogni sezione. Il ligula sarà visibile come un urto che sporge dalla superficie adaxial del primordio foglia. Segnare questa posizione utilizzando lo strumento di disegno del software LM; selezionare l'icona della matita, spostare il cursore sulla positi appropriatasu e fare clic e trascinare il mouse per disegnare.
NOTA: un obiettivo 10X o 20X è adatto per questo e per passi successivi. Quando si utilizzano sezioni laterali, i due lati di ogni foglio primordium saranno presenti in ogni sezione (Figura 2A). - Utilizzando lo strumento righello e lo strumento di disegno rettangolare, misura 100 micron alti rettangoli centrate sulla ligule di ciascuna sezione (rettangoli rossi, Figura 2A, 2B). Questi saranno il campione "Ligula".
- Per utilizzare lo strumento righello; selezionare l'icona righello, spostare il cursore su una estremità dell'oggetto da misurare, fare clic e trascinare per misurare l'oggetto. La lunghezza del righello verrà visualizzato sullo schermo.
- Per disegnare un rettangolo; selezionare l'icona di rettangolo, spostare il cursore su un punto che sarà uno degli angoli del rettangolo, fare clic e trascinare per disegnare un rettangolo di dimensioni adeguate. In alternativa, selezionare lo strumento di disegno linea retta e disegnare quattro linee rette.
- misura 100 micron rettangoli posizionati 50 micron sopra e sotto il rettangolo "Ligula".
NOTA: Questi saranno il "Blade" e campioni "guaina", rispettivamente (verde e blu rettangoli, Figura 2a, 2b). Sulla base dei nostri dati istologici, un rettangolo di 100 micron abbraccia l'intera regione ligula. sono stati scelti porzioni equivalenti dimensioni della lama e guaina per garantire che simili quantità di tessuto sono stati raccolti per ciascuna. Distanziali di 50 micron sono stati usati per garantire che nessun tessuto regione ligula è inavvertitamente incluso nella lama o guaina microdissections.
- Microdissect misurata rettangoli (Figura 2D - 2F) 7, 8, 9, la raccolta di campioni Ligula, Lama e guaina in tubi separati. Utilizzare la funzione di taglio laser per tagliare il sezione di tessuto lungo il contorno del dominio selezionato. Utilizzare il catafunzione pult per spingere il rettangolo di tessuto dal vetrino e nel coperchio del tubo (Figura 2D - 2F).
4. Microdissezione di Blade, ligula e guaina adaxial epidermiche campioni di Plastochron 7 Leaf Primordia
- Selezionare le sezioni e utilizzare lo strumento righello per misurare 100 micron alti segmenti centrati sulla plastochron 7 ligula, come descritto nella sezione 3 (sopra).
- Selezionare solo le cellule epidermiche adaxial di ogni 100 micron alto "Blade" e (selezioni verdi e blu, Figura 2C) "guaina" segmento delineando con lo strumento di disegno. L'epidermide è lo strato cellulare esterno; lato adaxial è quello più vicino al SAM.
- Per il campione "Ligula", selezionare solo le cellule del urto ligula emergente come descritto nella Sezione 3.3 (selezione rosso, Figura 2C).
- Microdissect selezionato regioni, la raccolta di Lama, Ligula e Sheath epidermide campioni in tubi separati, come descritto nella sezione 3.5.
5. Microdissezione di Plastochron 6 Leaf Primordia da Wild-type Fratelli LG1-R e
- Crescere segregare famiglie di mutanti (LG1-R) e le piante wild-type.
- Fissare e sparare processo apici per LM, come descritto nelle sezioni 1,2-1,4. Fissare wild-type e mutanti apici dei germogli in flaconcini separati in modo da tenerli separati. I campioni provenienti dalla stessa semina devono essere fissati e trattati per l'ibridazione in situ.
- Determinare dove LG1 è trascritto nel wild-type fratelli, effettuando LG1 ibridazione in situ 6, 26, 27. Misurare la posizione del accumulo di trascrizione LG1 dalla base della foglia primordio in campioni multipli (Figura 1E).
- Sulla base dei dati in situ ibridazione, scegliere porzione di foglia Primordium che comprende la regione in cui è trascritto LG1. In questo caso, 400-900 micron dalla base di plastochron 6 foglia primordi (rettangoli viola, Figura 2A).
- Microdissect selezionata porzione di foglia primordi, come descritto nella sezione 3.5, raccogliendo LG1-R e campioni wild-type in tubi separati.
6. Applicare RNA tampone di estrazione
- Applicare 50 microlitri tampone di estrazione di RNA al tessuto microdissezione e procedere con l'estrazione di RNA. Continuare con l'estrazione di RNA, l'amplificazione di RNA, la costruzione biblioteca, il sequenziamento e l'analisi bioinformatica, come descritto in riferimento 6.
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Representative Results
Utilizzando lo schema di LM delineato nella figura 2, a circa 1,000,000-1,500,000 micron 2 di tessuto sono stati raccolti per ogni replica in tutti i-Cell-strati LM (Figura 5), e 200.000 micron 2 per replicare per l'epidermide adaxial LM. Circa 2.500.000 micron 2 di tessuto è stato raccolto per ogni replica nel LM di wild-type primordi foglia LG1-R e. Due turni di amplificazione RNA lineare ha prodotto microgrammi quantità di RNA per ogni replica. La quantità di RNA ottenuto da qualsiasi microdissezione dipenderà dalla dimensione cellulare e dell'attività trascrizionale nonché la quantità di tessuto catturato. L'integrità dell'RNA interesserà l'efficienza dell'amplificazione RNA.
l'accumulo di trascrizione è stata analizzata in tutti gli strati di cellule della lama, regioni ligula e guaina per un totale di 2.359 DE genES sono stati trovati, con un tasso di falsi scoperta (FDR) del <0.05 (figura 6A). In particolare, 1.714 geni erano DE tra ligule e la lama, 1.044 geni erano DE tra ligule e guaina, e 657 geni erano DE tra lama e guaina (alcuni geni sono DE in più di un confronto). I geni sono stati classificati come upregulated nella regione ligule se fossero significativamente upregulated in entrambi ligule rispetto alla lama e ligule rispetto al fodero. In tutti gli strati di cellule LM, 373 geni erano significativamente upregulated nella regione ligula.
l'accumulo di trascrizione è stata analizzata nelle regioni lama epidermide, ligula e guaina adaxial e un totale di 3.128 DE geni sono stati trovati; 1.971 geni erano DE tra ligula e la lama, 2.032 geni erano DE tra ligula e guaina, e 871 geni erano DE tra lama e guaina (Figura 6B). 287 geni erano significativamente upregulated nel ligula rispetto alla lama e fodero epidermis.
I dati per geni selezionati sovraregolati nella regione ligule sono presentati nella Tabella 1 e nella Figura 7. Un iniziale analisi di ibridazione in situ ha indicato che le trascrizioni LG1 accumulano in particolare nel PLB e la ligula emergente di wild-type foglia primordi, e che LG1 è più altamente trascritto nell'epidermide che in strati di cellule interne (Figura 6C). La LM dati RNA-Seq che sono stati ottenuti sono coerenti con questo risultato; accumulo trascrizione LG1 è significativamente superiore nel ligule che sia lama o guaina sia nel LM epidermica e LM di tutti gli strati cellulari (Tabella 1, Figura 7A). LG1 ha un CPM superiore nell'analisi epidermica che nell'analisi di tutti gli strati di cellule, simile allo scenario illustrato in figura 8C.
NS1 era significativamente upregulated nella regione ligule in entrambi i tutti gli strati di cellule LM e l'epidermide adaxial LM (Tabella 1, Figura 7B). Questo risultato è stato confermato mediante ibridazione in situ, il che dimostra che trascritto ns1 accumula specificamente nella punta della ligule emergenti (Figura 6D). NS1 ha un numero molto più elevato di leggere nell'epidermide sola analisi LM rispetto LM di tutti gli strati cellulari (19.6 CPM e 2,7 CPM rispettivamente) a causa della diluizione del trascritto in tutti gli strati LM. Questo effetto di diluizione è illustrato nella figura 8A. Analogamente, GRMZM2G101682, un gene di funzione sconosciuta, aveva una media maggiore leggere conteggio nel LM epidermica ligule che in tutti gli strati LM (Tabella 1, Figura 7C). L'ibridazione in situ ha rivelato che questo gene trascrizione si accumula anche più fortemente nelle cellule epidermiche (Figura 6 sexies). Zm PIN1a non era significativamente DE nell'analisi di tutti gli strati di cellule, ma è stato significativamente upregulated in ligule nell'analisi nell'epidermide soli (Tabella 1, Figura 7D). Questo è molto probabilmente perché Zm PIN1a è altamente espresso nei tessuti vascolari e questa espressione vascolare L2-derivati confonde differenze di accumulo Zm PIN1a nell'epidermide, quando tutti gli strati di cellule sono raccolte (Figura 6F). Uno scenario simile è rappresentato nella Figura 8B.
Per identificare i geni che sono in DE mutanti LG1-R, l'accumulo di trascrizione è stato confrontato in una regione definita di wild-type e LG1-R P6 primordi fogliari. Novantasei geni erano DE in LG1-R (FDR <0,05); 59 sono stati smorzati in mutanti LG1-R, e 37 sono stati upregulated. I dati per geni selezionati che sono in DE <em> mutanti LG1-R sono presentati nella tabella 2. bel14 è uno dei 34 geni che sono entrambi sovraregolati nella regione ligula in wild-type foglia primordi e inibiti in mutanti LG1-R. In situ ibridazione confermato che trascritti bel14 accumulano nella regione preligule nelle piante wild-type, ma non nella regione corrispondente lg1-R foglia primordi 6.
Figura 2: Schema di microdissezione laser di foglia domini primordiali. (A) sezione longitudinale laterale del vertice di mais tiro trasformati per LM. Scatole indicano regioni selezionate per microdissezione. regione tessuto ligula (scatola rossa) è stato microdissezione da 100 micron alti rettangoli, incentrate sul PLB. Pre-lama (verde) e tessuti pre-guaina (blu) è stata scattata da 100 micronrettangoli 50 micron sopra e sotto la selezione preligule rispettivamente. Per il confronto delle wild-type e la trascrittomica LG1-R, tessuto tra 400-900 micron dalla base del P6 foglia primordi fu microdissezione da sezioni laterali (viola linea tratteggiata). (B) Primo piano di P7 primordio e regioni selezionate per microdissezione di tutti gli strati cellulari. (C) Primo piano di P7 primordio e regioni selezionate per microdissezione dell'epidermide adaxial. (D) Preligule regione P7 primordio prima microdissezione. Arrowhead indica la posizione di avviare ligula. (E) linea rossa indica regione selezionata per microdissezione. Il laser taglierà lungo questa linea. Cerchi indicano i punti in cui gli impulsi laser si catapulta tessuto. (F) Primordium dopo microdissezione. Cerchi indicano i punti in cui gli impulsi laser hanno catapultato il tessuto. SAM = meristema apicale. P indica il numero plastochron. Barre di scala = 100 &# 181; m. Questa cifra è stata modificata da riferimento 6 (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La regione selezionata per LM colpisce i conteggi di lettura per i geni che sono De lungo il primordio foglia. (A) posizionamento esatto della regione selezionata per LM relativi a punti di riferimento morfologiche riduce la variazione di geni espressi in un gradiente lungo l'asse del foglio. In replicati 1-3 a sinistra, le selezioni sono centrati sulla ligula emergente con conseguente bassa variazione. In replicati 1-3 sulla destra, il posizionamento della regione scelta per la LM non è coerente con conseguente aumento della variazione. (B) Microdissecting a dimensioni sempre selezione riduce la variazione (replica 1-3 a sinistra) rispetto al microdissecting selezioni di diverse dimensioni (1-3 replica a destra) per geni con pattern di espressione specifici ligula. Trascrizioni sono più diluite nella selezione più ampia, con conseguente un tasso inferiore leggere, e più concentrato nella selezione più piccolo, risultando in un conteggio più alto lettura. Cartoni animati rappresentano sezioni longitudinali attraverso foglia primordi della regione ligula. Arrowhead indica l'avvio ligula. CPM = conteggi per milione. DS = deviazione standard. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: dissezione di mais piantina per le sezioni laterali. (A) due settimane di età piantina mais asportato allo svincolo di root-shoot. Rimuovere fettine sottili from la base del tiro (1) fino a un piccolo ovale del culmo è visibile alla base della ripresa. Assicurarsi taglio trasversale di circa 10 mm al di sopra di base (2) e conservare questo cilindro. (B) Cilindro di tessuto orientato in modo di base è rivolto verso l'alto. Nota ovale del culmo circondato da foglia. Fare due tagli longitudinali parallele all'asse laterale (3 e 4). Trattenere e fissare fetta centrale del tessuto, questa porzione includerà il SAM e giovani primordi fogliari. (C) del fumetto che illustra piano di sezione laterale (linea verde tratteggiata) attraverso riprese apice. cerchio rosso indica nervatura centrale, punta di freccia rossa indica margini di foglio grigio primordio. Linea blu tratteggiata: asse nervatura-margine. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cartoon illustrare messa in comune di tessuto microdissezione laser per una replica della regione ligula. Tissue microdissezione da cinque a sei diapositive è riunito per ogni replica. Cinque sezioni mediane di ciascuna diapositiva vengono utilizzati e due selezioni (rettangoli rossi) sono in ogni sezione. Ogni rettangolo è di circa 20.000 micron 2. Tissue per ciascun replicato viene raccolto in un tubo separato (ovale blu). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Numero di De geni in confronti a coppie tra le regioni foglia e ibridazione in situ dei geni DE selezionati. (A) Numero di DE geni in confronto a coppie tralama, ligula e guaina regioni, LM di tutti gli strati cellulari. (B) Numero di DE geni in confronto a coppie tra lama, ligula e guaina regioni, LM di soli epidermide adaxial. (C) LG1 ibridazione in situ. (D) NS1 ibridazione in situ. (E) GRMZM2G101682 ibridazione in situ. (F) ZmPIN1a ibridazione in situ. DE: differenzialmente espressi. Fino a L: fino a ligula, Up in B: fino a lama. Fino a S: fino a guaina. Punte di freccia in CF indicano emergenti ligula. Freccia in F indica l'accumulo di trascrizione nei tessuti vascolari. Barre di scala = 100 micron. Questa cifra è stata modificata da riferimento 6 (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 7: Rappresentazione grafica dei dati per i geni DE selezionati. La figura illustra i dati presentati nella tabella 1 e nei risultati di ibridazione in situ. Cartoni animati rappresentano sezioni longitudinali attraverso primordi fogliari. blu scuro indica l'accumulo di trascrizione per un particolare gene. scatole verde, rosso e blu indicano regione selezionata per microdissezione per i campioni lama, ligula e guaina. Cartoons sulla sinistra illustrano LM di tutti gli strati di cellule. Cartoons on the destra illustrano LM di soli epidermide adaxial. Annunci: adaxial epidermide, AB: epidermide abaxial, CPM: conteggi per milione, asterisco indica una differenza significativa tra i due domini. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 8: Il fumetto che illustra come leggere i conteggi per ipotetici geni DE variano a seconda delle regioni selezionate per precise microdissezione. (A) Gene con l'espressione specifici ligula. (B) Gene espressa nella ligule e nei tessuti vascolari. (C) Gene espresso specificamente nella regione ligule in tutti gli strati di cellule, ma con una maggiore espressione nell'epidermide. (D) Gene espresso nella regione ligule, solo strati cellulari L2-derivati. Cartoni animati rappresentano sezioni longitudinali attraverso primordi fogliari. blu scuro indica l'accumulo di trascrizione per un particolare gene. scatole verde, rosso e blu indicano regione selezionata per microdissezione per i campioni lama, ligula e guaina. Cartoons sulla sinistra illustrano LM di tutti gli strati di cellule. Cartoons on the destra illustrano LM di soli epidermide adaxial. Annunci: epidermide adaxial, AB: epidermide abaxial, CPM: cou nti per milione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: selezionati i geni upregulated nel ligule primordiali. Conti per milione: conteggi per milione di trascrizioni totale, in media, tre repliche, logFC = logaritmo in base 2 Fold Change, FDR.BH: false discovery rate secondo il metodo Benjamini e Hochberg. Tutti i livelli: LM di tutti gli strati di cellule. Epidermide: LM di soli epidermide adaxial. Questa cifra è stata modificata da riferimento 6 (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Tabella 2: selezionati i geni mutanti de a LG1-R. Conti per milione: conteggi per milione di trascrizioni totale, in media, tre repliche, logFC = logaritmo in base 2 Fold Change, FDR.BH: false discovery rate secondo il metodo Benjamini e Hochberg. Questa cifra è stata modificata da riferimento 6 (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Disegno sperimentale è un fattore critico in esperimenti di RNA-Seq. Considerazioni chiave sono il dominio precisi (s) e fase di sviluppo (s) da analizzare, e quali i confronti saranno fatti. E 'fondamentale pensare in termini di confronto, poiché l'uscita è in genere un elenco di geni che sono de tra due o più condizioni. Come con tutti gli esperimenti, è importante modificare una sola variabile alla volta. Ad esempio, quando si confrontano diversi domini di foglie, foglie della stessa età e stadio di sviluppo, cresciuto nelle stesse condizioni dovrebbero essere confrontati.
Lo scopo di questi esperimenti è stato quello di identificare i geni che sono specificamente up- o down-regolato nella regione ligula di wild-type foglia primordi, e per identificare i geni che sono in DE mutanti LG1-R rispetto al wild-type. In primo luogo abbiamo studiato la morfologia di sviluppo primordi foglia e il modello di accumulazione trascrizione LG1. Questi punti di riferimento morfologici e molecolari were usato per selezionare domini precisi per LM 14, 15, 16. Nel primo esperimento, l'accumulo di trascrizione nella regione ligula è stato confrontato ad altre regioni dello stesso primordia foglia, eliminando così le differenze dovute a condizioni di crescita, il background genetico, fase di sviluppo, e le piante-to-impianto di variazione. Per confrontare mutante wild-type, è necessario determinare dove e quando il gene di interesse viene espresso. Si consiglia di analizzare il pattern di espressione da parte sia in ibridazione in situ o immunolocalizzazione e la selezione di una regione per LM che comprende il dominio dell'espressione genica. È importante che i domini equivalenti vengono confrontati e che il background genetico è la stessa per entrambi mutante e di tipo selvatico.
La precisione di microdissections può essere verificato controllando conteggi leggere per geni che sono espressi specificamente nel dominio di interesse, se sugeni ch sono noti. Questo può essere fatto anche effettuando RT-PCR su RNA estratto da tessuto LM prima di effettuare librerie per sequencing. Negli esperimenti descritti qui, LG1 servito come controllo per LM della regione ligule, poiché in situ ibridazione analisi ha mostrato che l'espressione lg1 è specifico per il PLB e ligule 5, 6 emergente.
A differenza dei metodi come RT-qPCR, dove deve essere noto il gene candidato (s), RNA-seq quantifica accumulo di tutti i trascritti in un dato campione di tessuto. Così, LM RNA-seq è un metodo utile per identificare geni candidati. Un esempio di questo studio è GRMZM2G101682, un gene di funzione sconosciuta che ha un sorprendente pattern di espressione specifici ligule (Figura 6E). Questo studio ha anche identificato i geni che sono in DE LG1-R, come bel14, che non erano stati precedentemente implicati come agire a valle del LG1. in this esempio, il confronto di più set di dati (upregulated nella regione ligula wild-type e DE in LG1-R) è stata particolarmente istruttiva. È importante notare che il pattern di espressione di un gene non dimostra la sua funzione: successive analisi genetiche e / o biochimici sono necessarie per stabilire la funzione del gene.
analisi trascrittomica che si concentrano su piccoli, i domini di sviluppo discrete, che sono distinti in modo differenziato e facilmente delineato, sono il maggior successo. LM RNA-Seq è un metodo adeguato per tali analisi e ha il potenziale per essere applicata a molti fenomeni evolutivi. È particolarmente adatto per identificare l'espressione genica differenziale in mutanti di geni che sono spazialmente ristrette pattern di espressione, o mutanti che influenzano lo sviluppo di strutture specifiche. Esso può essere applicato anche a processi che si verificano in cellule o tessuti specifici e identificabili, come l'epidermide o vascolare, ed è stato utilizzato inun'analisi trascrittomica di mais sparare apicale meristema (SAM) ontogenesi 16. È meno opportuno studiare la funzione di geni che sono espressi ubiquitariamente o processi che si verificano in tutte le cellule. I metodi qui presentati sono stati applicati con successo ad una varietà di specie vegetali (mais, sorgo, Ocimum, Mentha e Antirrhinum) e strutture (foglia primordi, meristemi, rizomi e tricomi).
LM non è richiesto quando l'analisi comporta relativamente grandi domini. In effetti, l'RNA-Seq sugli organi sezionati a mano o interi è stato utilizzato con successo per identificare DE geni nelle piante 14, 15. Questo approccio ha il vantaggio di essere meno laborioso e non è richiesta alcuna esperienza con tecniche istologiche. Tuttavia, vi sono limitazioni alla precisione di dissezioni mano, il che significa che la dissezione mano è meno adatto per studiare anticipata dprocessi evelopmental.
Per successo LM RNA-Seq analisi dei fenomeni evolutivi, il contesto di sviluppo deve essere ben caratterizzato. Si consiglia di procedere ad un esame istologico approfondito del processo o dominio di interesse prima di pianificare un esperimento. L'esame istologico dei campioni trattati a LM è generalmente scarsa, dal momento che i tessuti sono senza macchia e non vengono montati con vetrini che forniscono la profondità di campo. Pertanto, è utile fissare campioni separati per la colorazione e osservazione al tempo stesso come campioni LM sono fissi (Figura 1C, e D).
RNA ottenuto dal materiale di LM è generalmente frammentata e la resa totale è basso 8. Un passo di amplificazione è necessaria per generare l'RNA sufficiente per la preparazione libreria 28. RNA lunghezza del frammento dovrebbe essere valutata dopo l'amplificazione e la prima generazione biblioteca. Una lunghezza media frammento di séveral centinaio di paia di basi è generalmente considerato buono, 500 paia di basi è eccellente. Scarsa resa RNA può provocare se il tessuto non è ben fisso, se si verifica il degrado a causa di RNasi contaminazione, o se i blocchi di paraffina vengono correttamente conservati. È utile per testare la qualità del tessuto fissato intraprendendo un LM processo di un'area relativamente grande prima di dedicare un sacco di tempo per microdissecting molto piccoli domini. Poiché l'RNA ottenuto da cellule LM è frammentato ed amplificazione utilizzando un oligo dT iniettore presenta una forte 'polarizzazione 3, questo metodo non è adatto per rilevare trascritti alternativi come varianti di splicing. Né è LM adatto per la rilevazione di piccoli RNA.
Un metodo alternativo per quantificare l'accumulo di trascrizione in tessuti specifici o domini cellulari è RNA-Seq di cellule separate da Fluorescence Activated Cell ordinamento (FACS) 21. Questo metodo richiede generalmente l'identificazione di un gene marcatore adatto per la regione di interesse,la generazione di piante transgeniche che esprimono una proteina e protoplasting fluorescente-tag. FACS combinati con microarray è stato usato per generare una mappa espressione della radice Arabidopsis separando cellule esprimenti tipo-specifici promotori cellule nella radice 22, 23. FACS di tessuti sparare è più impegnativo di tessuti radicali a causa della clorofilla autofluorescenza 24. Una limitazione di LM è che il dominio di interesse deve essere identificabile in sezioni istologiche. FACS può essere un metodo più appropriato nel caso in cui un gene marcatore idoneo. La scelta di quali cellule o tessuti per isolare e confrontare è una considerazione importante nelle analisi trascrittomica che utilizzano sia FACS o LM.
I dati qui presentati dimostrano che risultati diversi saranno ottenuti secondo i settori precisi selezionati per LM (Figura 3, Figura 8). Trascrizioni di geni che sono espressi in una o poche cellule, come NS1, saranno diluiti quando i domini di tessuto di grandi dimensioni vengono analizzati. E 'probabile che se tutto il primordi fogliari sono stati campionati, trascrizione NS1 non sarebbe rilevato. ZmPIN1a è significativamente upregulated nella ligula rispetto alla lama e guaina epidermide ma questa differenza è confuso con espressione vascolare quando tutti gli strati di cellule sono campionati. Al contrario, i geni che sono espressi solo in strati di cellule L2-derivati non saranno rilevati quando solo l'epidermide viene campionato (Figura 8D). Questo studio dimostra che, mentre LM RNA-Seq è un potente strumento per rilevare differenze di espressione genica durante morfogenesi, domini selezionati per l'analisi sono cruciali per il successo dell'esperimento.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano S. Nasello per collaborazione in corso e stimolare discussioni sullo sviluppo ligula. Questo lavoro è supportato dalla National Science Foundation Grants MCB 1.052.051 e IOS-1.848.478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
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