Abstract
Gener med viktiga roller i utvecklingen har ofta rumsligt och / eller tidsmässigt begränsade uttrycksmönster. Ofta är dessa gentranskript inte upptäcks eller inte identifieras som differentiellt uttryckt (DE) i transcriptomic analyser av hela växtorgan. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) är ett kraftfullt verktyg för att identifiera gener som är DE särskilda utvecklingsområden. Men valet av cellulära domäner microdissect och jämföra, och noggrannheten av microdissections är avgörande för framgången för experimenten. Här, två exempel illustrerar design överväganden för transkriptomik experiment; en LM-RNA-seq analys för att identifiera gener som är de längs majsblad proximala-distala axeln, och ett andra experiment för att identifiera gener som är DE i liguleless1-R (LG1-R) mutanter jämfört med vildtypen. Viktiga delar som bidragit till framgången för dessa experiment detaljerade histologiska och situ hybridisering analyser av regionen som skall analyseras, val av blad primordia vid motsvarande utvecklingsstadier, användning av morfologiska landmärken för att välja regioner för microdissection, och microdissection av exakt uppmätta domäner. Detta dokument ger en detaljerad protokoll för analys av utvecklings domäner genom LM RNA-Seq. De data som presenteras här visar hur ut för microdissection regionen kommer att påverka resultaten.
Introduction
Bladet majs är en idealisk modell för att studera bildandet av utvecklingsområden under morfogenes, eftersom den har en tydlig gräns mellan bladet och manteln som är mottaglig för genetisk dissektion (Figur 1A). Under de tidiga stadierna av bladutveckling, en linjär band av mindre celler, den preligule bandet (PLB), delar upp blad primordium in i pre-bladiga och pre-slida domäner. En frans-liknande ligule och triangulära flikar utvecklas från PLB (Figur 1A, C, D). Genetiska skärmar har identifierat mutationer som stör blad manteln gränsen. Till exempel, recessiv liguleless1 (LG1) mutationer radera ligule och förmaksöronen 1, 2, 3, 4 (Figur 1B). In situ hybridisering visade att LG1 avskrift ackumuleras i PLB och nya ligule, vilket gör den till en utmärkt markör för ligule utveckling 5, 6 (figur 1E).
Figur 1: Vildtyp och liguleless1-R majsblad. (A) Blade-mantel gränsområdet av mogen vildtyp blad visar ligule och ytteröra strukturer. (B) Blade-mantel gränsområdet av mogen liguleless1-R blad som visar frånvaro av ligule och ytteröra strukturer. Bladen i A och B har halverats längs Mittnerven. (C) Längdsnitt genom vildtyp leaf primordium. Prov har behandlats och färgades för histologisk analys. Den initierande ligule framgår som en bula som skjuter ut från planet för blad (pilspets). (D) Longitudinell sektjon genom vildtyp leaf primordium. Provet har bearbetats för LM som beskrivs i texten. Pilspets indikerar initiering ligule. (E) LG1 in situ hybridisering av skott apex sidolängdsnitt. Asterisker indikerar LG1 avskrift ansamlingen på PLB av P6 blad primordium. Pilar anger basen av P6 primordium. Bar indikerar mätning från basen av primordium till PLB. Skala barer i A och B = 20 mm. Skala barer i CE = 100 pm. Denna siffra har modifierats referens 6 (Copyright American Society of Plant Biologists). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I denna studie var LM RNA-Seq användas för att identifiera en uppsättning gener som är differentiellt uttryckta (DE) vid bladets-mantelgräns i förhållande till andra delar av blad primordium och till IDE ntify gener som är DE LG1-R-mutanter i förhållande till vildtyp syskon. LM RNA-Seq är en metod för att kvantifiera avskrift ackumulering i specifika celler eller cellulära domäner 7. LM system kombinerar en laser och ett mikroskop med en digital kamera. Sektionerade vävnaden monteras på objektglas och betraktas genom mikroskopet. LM Programvaran innehåller typiskt ritverktyg som gör det möjligt för användaren att beskriva någon utvald region för microdissection. Laser skär längs linjen, och den valda vävnaden slungades från glaset och in i ett rör upphängd ovanför bilden. LM tillåter användaren att microdissect exakta domäner, inklusive specifika cellskikt och även enstaka celler 8, 9. RNA kan sedan extraheras från microdissected vävnaden. Därefter använder RNA-Seq komponent nästa generations sekvensering för att sekvensera cDNA-bibliotek som genereras från det extraherade RNA 10,= "xref"> 11.
Viktigaste fördelarna med LM RNA-punkter är förmågan att kvantifiera avskrift ackumulering i exakt definierade domäner och förmågan att profilera hela transkriptom samtidigt 7. Tekniken är särskilt lämpad för att sondera tidiga utvecklings evenemang där regionen av intresse är ofta mikroskopiska. Tidigare studier har använt LM kombinerat med microarray-teknik för att studera utvecklingsprocesser i växter 9, 12, 13. RNA-Seq har fördelen att kvantifiera transkript över ett brett dynamiskt omfång, inklusive lågt uttryckt gener och före sekvensinformation krävs inte 10, 11. Dessutom har LM RNA-Seq potential att lyfta fram utvecklings viktiga gener som kan missas i mutagenes skärmar på grund av genetiska redundans eller för dödlighet av förlusten-of-funktion mutanten.
Utvecklings viktiga gener, såsom smala sheath1 (NS1) och skålformad cotyledon2 (CUC2), har ofta specifika uttrycksmönster för bara en eller ett fåtal celler 17, 18, 19, 20. Många uttrycks endast under tidiga utvecklingsstadier och inte i den mogna organet. När hela organ eller stora domäner analyseras, är dessa cellspecifika transkript utspädd och kan inte upptäckas i mer konventionella analyser. Genom att tillåta analyser av exakt definierade domäner, LM RNA-Seq möjliggör dessa vävnadsspecifika gener kan identifieras och kvantifieras.
Avgörande faktorer för framgång de experiment som beskrivs här var en grundlig histologisk analys som styrt valet av lämplig utvecklingsstadiet och domän för analys, och exakt MeasureMent av cellvävnads domäner för LM. För att säkerställa att motsvarande domäner samplades för alla replikat, ades vävnad uppsamlades från blad primordia vid samma utvecklingsstadium och de microdissected domänerna mättes i förhållande till morfologiska landmärken, såsom den framväxande ligule (Figur 2). Det är känt att vissa gener uttrycks i en gradient från spetsen till basen av bladet. Genom att mäta exakta domäner, variation på grund av provtagning från olika platser längs blad proximal-distal axel hölls till ett minimum (figur 3A). Genom microdissecting domäner av samma storlek, för att variation på grund differentiell utspädning av cellspecifika transkript minskade också (figur 3B). Laterala längsgående sektioner av shoot apex användes för alla microdissections. Dessa är delar som är vinkelräta mot Mittnerven marginal axeln (Figur 4). Genom att bara använda delar som inkluderar SAM säkerställer att motsvarande sidoområdena avblad primordia analyseras.
I prover som behandlas och sektione för LM, är den första morfologiska tecken på ligule utväxt en bula på adaxial sidan på grund av periclinal celldelningar i adaxial epidermis (Figur 1D, Figur 2). Det konstaterades att den framväxande ligule kan tillförlitligt identifieras på plastochron 7 skede blad primordia. Vi var intresserade av gener som uttrycks i hela ligule regionen, inklusive den framväxande ligule och cellerna omedelbart distala som ska ligga ytterörat. I syfte att säkerställa att motsvarande vävnads urval gjordes, var ligule bula som används som en morfologisk landmärke och en 100 | j, m rektangel centrerad på ligule bump valdes för LM (figur 2A, 2B). Ekvivalenta stora rektanglar av pre-bladet och pre-mantel valdes från samma blad primordia.
Analyser av liguleless muterade växter presenterade en annan ChalleNBE; LG1-R-mutanter inte bildar en ligule, därför denna morfologiska funktionen inte kan användas för att välja region för LM. I stället var domänen för LG1 avskrift ackumulering i vild-typ blad primordia bestämdes och en region som skulle omfatta detta område definierades. Dessa preliminära analyser utfördes på plantor från samma plantering som användes för den slutliga analysen, eftersom tidigare arbete har visat att placeringen av PLB varierar beroende på odlingsbetingelser. In situ hybridisering indikerade att LG1 transkript ackumuleras i PLB av P6 blad primordia (figur 1E). Vi valde en domän 400-900 pm från basen av bladet primordia som omfattade domän LG1 uttryck (lila rektanglar, figur 2A) och fångade dessa motsvarande regioner från vild-typ och LG1-R växter. För att minimera variationer i genetisk bakgrund och tillväxtbetingelser när man jämför transcript ackumulering i LG1-R och vildtypsväxter, segregerande familjer mutanter och vildtyp syskon användes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Fix vävnad för histologisk analys samtidigt som vävnaden fixeras för LM. Undersök färgade sektioner för morfologiska funktioner som kommer att vägleda senare LM. När man jämför mutant till vildtypen, utför in situ hybridisering eller immunolokalisering att definiera den domän där genen av intresse uttrycks (i detta fall LG1).
1. Vävnads Fixering och Processing
- Odla lägenheter av plantor majs till två veckor under standardbetingelser 6.
- Dissekera skjuta spetsar för sidosektionerna (Figur 4).
- Punkt fröplanta precis under marklinjen.
- Med användning av ett rakblad, ta bort tunna skivor från basen av stammen (nedskärningar 1, Figur 4A) till dess att en oval av culm omgiven av en eller två mogna blad är synligt (figur 4B).
- Gör en annan snitt ca 10 mm ovanför basen (klipp 2, figur 4A).Denna 10 mm segment kommer att innehålla SAM och unga blad primordia.
- Vrid 10 mm segment så att basen är vänd uppåt. Göra två snitt parallellt med den laterala axeln, så att en skiva av vävnad 2-3 mm tjock erhålls (snitt 3, och 4, figur 4B). Kasta de två yttre delarna och behålla den centrala skiva för fixering och inbäddning.
OBS: yttre bladen kan trimmas och kasseras.
- Fixa vävnad och process för inbäddning.
- Se till att alla material som skall användas i efterföljande steg är RNas-fritt. Behandla lösningar med dietylpyrokarbonat (DEPC) (1 ml DEPC per liter lösning. Inkubera över natten med skakning då och då, och autoklav). Baka glas i en ugn vid 200 ° C eller högre under åtminstone sex timmar och behandla plastartiklar med RNas sanering lösning.
- Dag 1: Doppa vävnadssnitt i ~ 10 ml bondens fix (3: 1 etanol: ättiksyra) i glasflaska på is. När alla prover har dissekeras, tillämpa vacuum för att avlägsna luftbubblor och stöd penetration av fixativ. Håll under vakuum i 10 min släpp sedan vakuumet långsamt. Ersätta fixativ och inkubera vid 4 ° C över natt med försiktig skakning.
- Dag 2: Inkubera i följande serie av lösningar, ~ 10 ml vardera, 1 timme vardera, alla med försiktig skakning; 85% etanol vid 4 ° C, 95% etanol vid 4 ° C, 100% etanol vid 4 ° C, 100% etanol vid 4 ° C, 100% etanol vid 4 ° C, 1: 1 etanol: xylener vid rumstemperatur, 100% xylener vid rumstemperatur, 100% xylener vid rumstemperatur.
OBS: xylener giftigt vid hudkontakt och inandning. Arbetet i ett dragskåp och använda lämpliga handskar. - Lägg paraffin vävnad inbäddningsmedium pellets till ungefär halva volymen av xylener och inkubera över natten vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Dag 3: Överför flaskan till 60 ° C ugn tills pelletsen smälta. Häll bort lösningen och ersätta med färsk smält vävnad inbäddning medium. Ändra mediet två gångerunder dagen.
- Dag 4: Ändra vävnad inbäddning mediet en gång på morgonen. Återgå till 60 ° C ugn tills eftermiddagen.
- gjutna block
- Placera inbäddning formar på värmeplatta av vävnad inbäddning station. Använd pincett för att överföra vävnadsprover till inbäddning formar med snittytan nedåt. Fylla formen med smält paraffin och placera inbäddning ringen på toppen av formen. Överföring till en kall platta tills paraffin har stelnat. Förvara paraffinblock vid 4 ° C i en lufttät behållare med kiselgel.
2. Snitt och glaspreparering
- Skär 10 um sektioner på en mikrotom 25.
- Undersök band och välja median sektioner. Median avsnitt är sådana som innehåller SAM, som visas som en kupol av celler omgivna av blad primordia.
- Mount avsnitt om bilder.
- Placera objektglasen som är lämpliga för LM (antingen RNas fritt ellerbakade) på 42 ° C glida varmare och tillämpa flera droppar 50% etanollösning för att täcka bilden.
- Float avsnitten om etanollösning tills sektionerna har expanderat.
OBS: Flytande avsnitt om etanollösning snarare än vatten håller RNA i en utfälld tillstånd minska RNA nedbrytning. - Luta bild och avlägsna överskott etanollösning genom aspiration med en disponibel överföringspipett. Använd luddfria våtservetter att transportera bort ytterligare etanollösning.
- Torra objektglas vid 42 ° C under flera timmar eller över natten. Store glider vid 4 ° C i en lufttät behållare med kiselgel.
- Avparaffinera glider på användningsdagen.
- Förbered tre glas Coplin burkar innehållande; 100% xylener (xylener I), 100% xylener (xylener II) och 100% etanol (~ 50 ml av varje lösning).
- Använda rena pincett för att överföra bilder, fördjupa glasen i xylen I för 2 minuter, xylen II under 2 minuter, och 100% etanol under 1 minut.
- drain gledes på luddfria våtservetter och lufttorka vid rumstemperatur.
3. Microdissection Blade, ligule och mantel Prover från Plastochron 7 Leaf Primordia
- Fäst bilderna på scenen av LM mikroskop. Använd fem eller sex bilder för varje kopia, som utnyttjar fem sektioner per bild.
OBS: Tissue pooling för en enda replikat illustreras i figur 5. - Undersök bilder och identifiera de fem mest median avsnitten om varje bild, med hjälp av SAM spetsen som central referenspunkt.
OBS: Detta kan göras vid låg förstoring, är tillräcklig vanligtvis en 5X objektiv. - Med användning av 10X eller 20X objektiv, identifiera läget för ligule på plastochron 7 blad primordium av varje sektion. Den ligule kommer att synas som en bula som skjuter ut från adaxial ytan av bladet primordium. Markera denna position med hjälp av ritverktyget av LM programvara; Välj pennikonen, flytta markören till rätt positipå och klicka och dra musen för att rita.
OBS: En 10X eller 20X målet är lämplig för detta och efterföljande steg. Vid användning av sidosektionerna, kommer de två sidorna av varje blad primordium vara närvarande i varje avsnitt (Figur 2A). - Använda linjalen och den rektangulära ritverktyget mäter 100 um höga rektanglar centrerade på ligule av varje avsnitt (röda rektanglar, Figur 2A, 2B). Dessa kommer att vara "ligule" prov.
- För att använda linjalen; välj ikonen linjal, flytta markören till ena änden av det föremål som skall mätas genom att klicka och dra för att mäta objektet. Längden på linjalen kommer att visas på skärmen.
- För att rita en rektangel; välj ikonen rektangel, flytta markören till en punkt som kommer att vara ett hörn av rektangeln, klicka och dra för att rita en rektangel av lämplig storlek. Alternativt kan du välja den raka linjen ritverktyget och dra fyra raka linjer.
- åtgärd 100 pm rektanglar placerade 50 pm ovanför och nedanför "ligule" rektangel.
OBS: Dessa kommer att vara den "Blade" och "mantel" prover, respektive (grön och blå rektanglar, Figur 2A, 2B). Baserat på våra histologiska data, omfattar en 100 um rektangel hela ligule regionen. Motsvarande medelstora delar av blad och slida valdes för att säkerställa att liknande mängder vävnad samlades för varje. Distanser av 50 um användes för att säkerställa att ingen ligule regionen vävnad oavsiktligt ingår i bladet eller slida microdissections.
- Microdissect mätt rektanglar (Figur 2D - 2F) 7, 8, 9, samla ligule, Blade och mantel prover i separata rör. Använda laserskuma funktion för att skära genom vävnaden sektion längs konturerna av den valda domänen. Använd katapult funktion för att framdriva rektangeln av vävnad från glaset och in i locket av röret (Figur 2D - 2F).
4. Microdissection Blade, ligule och Mantel Adaxial Epidermala Prover från Plastochron 7 Leaf Primordia
- Välj sektioner och använda linjal verktyg för att mäta 100 um höga segment centrerad på plastochron 7 ligule, som beskrivs i avsnitt 3 (ovan).
- Välj bara de adaxial epidermala cellerna i varje 100 fim hög "Blade" och "mantel" segmentet (gröna och blå markeringar, figur 2C) med att redogöra med ritverktyget. Epidermis är det yttre cellskiktet; den adaxial sidan är det en närmast SAM.
- För "ligule" prov, välj bara cellerna i den framväxande ligule bump som beskrivs i avsnitt 3.3 (röd urval figur 2C).
- Microdissect utvalda regioner, samla Blade, ligule och Sheath epidermis prover i separata rör, som beskrivs i avsnitt 3.5.
5. Microdissection Plastochron 6 Leaf Primordia från LG1-R och vildtyp syskon
- Väx segregerande familjer mutant (LG1-R) och plantor av vild typ.
- Fix och process skjuta spetsar för LM, som beskrivs i avsnitt 1,2-1,4. Fix vildtyp och mutanta shoot spetsar i separata flaskor för att hålla dem åtskilda. Prover från samma plantering bör fastställas och behandlas för in situ hybridisering.
- Bestämma var LG1 transkriberas i vildtyp syskon, genom att utföra LG1 in situ hybridisering 6, 26, 27. Mät position LG1 avskrift ackumulering från basen av blad primordium i flera prover (Figur 1E).
- Baserat på situ hybridisering data, välj delen av blad primordium som omfattar den region där LG1 transkriberas. I det här fallet, 400-900 pm från basen av plastochron sex blad primordia (lila rektanglar, figur 2A).
- Microdissect vald del av blad primordia, som beskrivs i avsnitt 3.5, samla LG1-R och vildtyp prover i separata rör.
6. Applicera RNA Extraction Buffer
- Applicera 50 pl RNA extraktionsbuffert till microdissected vävnad och fortsätt med RNA-extraktion. Fortsätt med RNA-extraktion, RNA-förstärkning, bibliotek konstruktion, sekvensering och bioinformatik analys som beskrivs i referens 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda LM schemat i figur 2, ungefär 1,000,000-1,500,000 pm två av vävnad samlades för varje replikera i all-cellskikt LM (Figur 5), och 200.000 im 2 per replikera för LM den adaxial epidermis. Cirka 2.500.000 fim två av vävnad samlades för varje replikera i LM av LG1-R och vildtyp blad primordia. Två omgångar av linjär RNA förstärkning gav mikrogram mängder av RNA för varje kopia. Mängden RNA som erhållits från en given microdissection kommer att bero på cellstorlek och transkriptionsaktivitet samt mängden vävnad fångas. Integriteten av RNA kommer att påverka effektiviteten av RNA-amplifiering.
Transkript ackumulering analyserades i alla cellager av bladet, ligule och slida regioner och totalt 2359 DE genes befanns, med ett falskt upptäckt hastighet (FDR) av <0,05 (Figur 6A). Specifikt 1.714 gener var DE mellan ligule och blad, 1,044 gener var DE mellan ligule och mantel, och 657 gener var DE mellan bladet och mantel (vissa gener är DE mer än en jämförelse). Gener klassificerades som uppregleras i ligule regionen om de var signifikant uppregleras i både ligule jämfört med blad och ligule jämfört med manteln. I alla cellager LM var 373 gener signifikant uppregleras i ligule regionen.
Transkript ackumulering analyserades i adaxial bladhuden, ligule och slida regioner och totalt 3.128 DE gener konstaterades; 1.971 gener var DE mellan ligule och blad, 2,032 gener var DE mellan ligule och mantel, och 871 gener var DE mellan blad och hölje (Figur 6B). 287 gener signifikant uppregleras i ligule jämfört med blad och slida epidermis.
Data för utvalda gener som är uppreglerade i ligule regionen presenteras i tabell 1 och figur 7. En initial in situ hybridisering analys visade att LG1 transkript ackumuleras specifikt i PLB och den framväxande ligule av vild-typ blad primordia, och att LG1 är högre transkriberas i epidermis än interna cellskikt (figur 6C). LM RNA-punkter data som erhölls är förenliga med detta resultat; LG1 avskrift ackumulering är betydligt högre i ligule än antingen blad- eller hölje i både epidermal LM och LM av alla cellager (Tabell 1, Figur 7A). LG1 har en högre CPM i den epidermala analysen än i analysen av alla cellskikt, liknande det scenario som visas i fig 8C.
ns1 var signifikant uppregleras i ligule regionen i både de alla cellskikt LM och LM den adaxial epidermis (Tabell 1, Figur 7B). Denna slutsats bekräftades genom hybridisering in situ, vilket visar att NS1 avskrift ackumuleras specifikt i spetsen av den framväxande ligule (figur 6D). NS1 har en mycket högre läsa räkningen i epidermis endast LM analys än i LM av alla cellager (19,6 CPM och 2,7 CPM, respektive) på grund av utspädning av transkript i alla lager LM. Denna späd effekt illustreras i figur 8A. På liknande sätt GRMZM2G101682, en gen med okänd funktion, hade en högre medel läsa räkningen i ligule epidermal LM än i alla lager LM (Tabell 1, Figur 7C). In situ hybridisering visade att denna gen transkript ackumuleras också starkast i epidermala celler (figur 6E). Zm PIN1a var inte signifikant DE i analysen av alla cellager, men avsevärt uppreglerat i ligule i analysen epidermis-endast (Tabell 1, Figur 7D). Detta är troligen på grund Zm PIN1a starkt uttryck i kärlvävnader och denna L2-härledda vaskulär uttryck confounds skillnader i Zm PIN1a ackumulering i överhuden när alla cellskikt samlas (Figur 6F). Ett liknande scenario avbildas i figur 8B.
För att identifiera gener som är DE LG1-R-mutanter var avskrift ackumulering jämförs i ett definierat område av vild-typ och LG1-R P6 blad primordia. Nittiosex gener var DE LG1-R (FDR <0,05); 59 var nedregleras i LG1-R-mutanter, och 37 var uppreglerade. Data för utvalda gener som är DE <em> LG1-R-mutanter presenteras i tabell 2. bel14 är en av 34 gener som båda uppregleras i ligule regionen i vildtyp blad primordia och nedregleras i LG1-R-mutanter. In situ bekräftade hybridisering att bel14 transkript ackumuleras i preligule regionen vildtypsväxter men inte i motsvarande region av LG1-R blad primordia 6.
Figur 2: System för laser microdissection blad primordiala domäner. (A) Lateral längdsnitt av skott majs apex behandlas för LM. Rutor indikerar regioner som valts ut för microdissection. Ligule regionen vävnad (röd ruta) var microdissected från 100 um höga rektanglar, centrerade på PLB. Pre-blad (grön) och pre-mantel (blå) vävnad togs från 100 | j, mrektanglar 50 pm ovanför och nedanför preligule val respektive. För jämförelse av vildtypen och LG1-R transcriptomes, vävnad mellan 400-900 pm från basen av P6 blad primordia var microdissected från sidosektionerna (lila streckad linje). (B) Närbild av P7 primordium och regioner ut för microdissection av alla cellager. (C) Närbild av P7 primordium och regioner ut för microdissection av adaxial epidermis. (D) Preligule regionen P7 primordium innan microdissection. Pilspets indikerar läget för att initiera ligule. (E) Röda linjen indikerar regionen ut för microdissection. Lasern kommer att skära längs denna linje. Cirklarna indikerar punkter där laserpulser kommer katapult vävnad. (F) primordium efter microdissection. Cirklarna indikerar punkter där laserpulser har slungades vävnad. SAM = skjut apikala meristem. P anger plastochron nummer. Skalstrecken = 100 &# 181; m. Denna siffra har modifierats referens 6 (Copyright American Society of Plant Biologists). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Regionen ut för LM påverkar lästa räknas för gener som är de längs bladet primordium. (A) Noggrann positionering av ut för LM i förhållande till morfologiska landmärken region minskar variationen för gener som uttrycks i en gradient längs bladaxeln. I replikat 1-3 på vänster, är val centrerade på den framväxande ligule vilket resulterar i låg variation. I replikat 1-3 på höger, är inte konsekvent positionering av regionen ut för LM resulterar i ökad variation. (B) microdissecting en konsekvent storlek sval minskar variationen (replikerar 1-3 till vänster) jämfört med microdissecting olika storlekar val (replikerar 1-3 till höger) för gener med ligule specifika uttrycksmönster. Transkript mer utspädd i den större urval, vilket resulterar i en lägre läsa räkna, och mer koncentrerad i den mindre urval, vilket resulterar i en högre läsa räkna. Karikatyrerna representerar längdsnitt genom blad primordia i ligule regionen. Pilspets indikerar initiering ligule. CPM = pulser per miljon. SD = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Dissekering av majs plantor för sidosektionerna. (A) Två veckor gamla majs plantor skars vid roten-shoot korsning. Ta bort tunna skivor frOm basen av skott (1) tills en liten oval culm syns på basen av skott. Gör tvären ca 10 mm ovanför botten (2) och behålla denna cylinder. (B) Cylinder av vävnad orienterad så basen uppåt. Obs oval culm omgiven av löv. Gör två längsgående snitt som är parallella med den laterala axeln (3 och 4). Behålla och fixa central del av vävnad, kommer denna del inkluderar SAM och unga blad primordia. (C) tecknad illustrerar plan sidosektion (grön streckad linje) genom skjuta spetsen. Röd cirkel indikerar Mittnerven, röd pil indikerar marginaler grå blad primordium. Blå streckad linje: Mittnerven-marginal axel. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Tecknad illustrerar sammanslagning av laser microdissected vävnad för en kopia av den ligule regionen. Vävnad microdissected från fem till sex glider slås samman för varje kopia. Fem median sektioner från varje bild används och två val (röda rektanglar) är gjorda av varje avsnitt. Varje rektangel är cirka 20.000 pm 2. Vävnad för varje replikat samlas i ett separat rör (blå oval). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Antal DE gener i parvisa jämförelser mellan blad regioner och in situ hybridisering av utvalda DE gener. (A) Antal DE gener i parvis jämförelse mellanblad, ligule och slida regioner, LM av alla cellskikt. (B) Antal DE gener i parvis jämförelse mellan blad, ligule och slida regioner, LM endast adaxial epidermis. (C) LG1 in situ-hybridisering. (D) ns1 in situ-hybridisering. (E) GRMZM2G101682 in situ-hybridisering. (F) ZmPIN1a in situ-hybridisering. DE: differentiellt uttryckt. Upp i L: i ligule, upp i B: i bladet. Upp i S: upp i slidan. Pilspetsar i CF indikerar emerging ligule. Pilen i F indikerar avskrift ackumulering i kärlvävnader. Skalstrecken = 100 ^ m. Denna siffra har modifierats referens 6 (Copyright American Society of Plant Biologists). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
t = "Bild 7" src = "/ filer / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Figur 7: Grafisk representation av data för utvalda DE gener. Figuren illustrerar data som presenteras i tabell 1 och in situ hybridiserings-resultaten. Karikatyrerna representerar längdsnitt genom blad primordia. Mörkblå indikerar avskrift ansamling för en viss gen. Grön, röd och blå rutorna anger region ut för microdissection för blad, ligule och slida prover. Tecknad film till vänster illustrerar LM av alla cellager. Karikatyrerna på höger illustrerar LM endast adaxial epidermis. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: räkningar per miljon, asterisk anger signifikant skillnad mellan två domäner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
"Src =" / filer / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Figur 8: Cartoon illustrerar hur läser räknas för hypotetiska DE gener varierar beroende på de exakta regioner som valts ut för microdissection. (A) Gene med ligule specifika uttryck. (B) Gene uttrycks i ligule och i vaskulära vävnader. (C) Gene uttrycks specifikt i ligule regionen i alla cellskikt men med högre uttryck i epidermis. (D) Gene uttrycks i ligule regionen, endast L2-härledda cellskikt. Karikatyrerna representerar längdsnitt genom blad primordia. Mörkblå indikerar avskrift ansamling för en viss gen. Grön, röd och blå rutorna anger region ut för microdissection för blad, ligule och slida prover. Tecknad film till vänster illustrerar LM av alla cellager. Karikatyrerna på höger illustrerar LM endast adaxial epidermis. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: COU nätter per miljon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Utvalda gener uppreglerade i primordial ligule. Räknar per miljon: räkningar per miljon totalt transkript, medelvärdet av tre replikat, logFC = log bas två faldig förändring, FDR.BH: falska upptäckt ränta enligt Benja och Hochberg-metoden. Alla lager: LM av alla cellager. Epidermis: LM endast adaxial epidermis. Denna siffra har modifierats referens 6 (Copyright American Society of Plant Biologists). Klicka här för att se en större version av denna tabell.
e 2 "src =" / filer / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tabell 2: Utvalda gener DE LG1-R-mutanter. Räknar per miljon: räkningar per miljon totalt transkript, medelvärdet av tre replikat, logFC = log bas två faldig förändring, FDR.BH: falska upptäckt ränta enligt Benja och Hochberg-metoden. Denna siffra har modifierats referens 6 (Copyright American Society of Plant Biologists). Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentell design är en kritisk faktor i RNA-seq experiment. Viktiga överväganden är den exakta domän (er) och utvecklingsstadium (er) som skall analyseras, och vilka jämförelser kommer att göras. Det är viktigt att tänka i termer av jämförelser, eftersom produktionen är typiskt en lista av gener som är de mellan två eller flera villkor. Som med alla experiment, är det viktigt att ändra endast en variabel i taget. Till exempel, när man jämför olika blad domäner, blad av samma ålder och utvecklingsstadium, som odlas under samma betingelser bör jämföras.
Syftet med dessa experiment var att identifiera gener som är särskilt upp- eller nedreglerade i ligule regionen vildtyp blad primordia, och för att identifiera gener som är DE LG1-R-mutanter jämfört med vildtypen. Vi studerade först morfologin utvecklingsblad primordia och mönstret av LG1 avskrift ackumulering. Dessa morfologiska och molekylära landmärken were används för att välja exakta domäner för LM 14, 15, 16. I det första experimentet var avskrift ansamling i ligule regionen jämfört med andra regioner i samma blad primordia, vilket eliminerar skillnader på grund av tillväxtbetingelser, genetisk bakgrund, utvecklingsstadium och växt till växt variation. Att jämföra mutant till vildtyp, är det nödvändigt att bestämma var och när genen av intresse uttrycks. Vi rekommenderar att analysera uttrycksmönstret antingen in situ hybridisering eller immunlokalisering och välja ett område för LM som omfattar området för genuttryck. Det är viktigt att ekvivalenta domäner jämförs och att den genetiska bakgrunden är densamma för både mutant och vildtyp.
Noggrannheten av microdissections kan verifieras genom att kontrollera läst räknas för gener som uttrycks specifikt i området av intresse, om SUch gener är kända. Detta kan också göras genom att utföra RT-PCR på RNA extraherat från LM vävnad innan du köper bibliotek för sekvensering. I de experiment som beskrivs här, LG1 tjänade som en kontroll för LM av ligule regionen, eftersom in situ-hybridisering analyser hade visat att LG1 uttryck är specifik för PLB och tillväxt ligule 5, 6.
Till skillnad från metoder såsom RT-qPCR, där genen kandidat (s) måste vara kända, kvantifierar RNA-seq ackumulering av alla transkript i ett givet vävnadsprov. Sålunda är LM-RNA-seq en användbar metod för att identifiera kandidatgener. Ett exempel från denna studie är GRMZM2G101682, en gen med okänd funktion, som har en slående ligule specifikt expressionsmönster (figur 6E). Denna studie identifierade också gener som är DE LG1-R, såsom bel14, som inte tidigare varit inblandade som agerar nedströms LG1. i this exempel, jämförelse av flera datauppsättningar (uppregleras i vildtypen ligule region och DE LG1-R) var särskilt informativt. Det är viktigt att notera att uttrycksmönstret av en gen inte visa sin funktion: efterföljande genetiska och / eller biokemiska analyser krävs för att etablera geners funktion.
Transcriptomic analyser som är inriktade på små, diskreta utvecklings domäner, som är differentiellt distinkt och lätt avgränsade, är de mest framgångsrika. LM RNA-punkter är en lämplig metod för sådana analyser och har potential att tillämpas på många fenomen utvecklings. De är särskilt lämpliga för att identifiera differentiell genexpression i mutanter av gener som rumsligt ha begränsat uttrycksmönster, eller mutanter som påverkar utveckling av specifika strukturer. Den kan också tillämpas på processer som sker i specifika och identifierbara celler eller vävnader, såsom epidermis eller vaskulatur, och har använts ien transcriptomic analys av majs skjuta apikala meristem (SAM) ontogenin 16. Det är mindre lämpligt att studera funktionen hos gener som uttrycks ubiquitously eller processer som sker i alla celler. De metoder som presenteras här har tillämpats med framgång på en mängd olika växtarter (majs, sorghum, Ocimum, Mentha och Antirrhinum) och strukturer (blad primordia, meristem, rhizom och trichomes).
LM är inte nödvändig när en analys innebär relativt stora domäner. I själva verket har RNA-Seq på hand dissekeras eller hela organ använts framgångsrikt för att identifiera DE-gener i växter 14, 15. Detta tillvägagångssätt har fördelen av att vara mindre arbetskrävande och ingen erfarenhet med histologiska tekniker krävs. Det finns dock begränsningar för precision hand dissektioner, vilket innebär att handen dissektion är mindre lämplig för att studera tidig developmental processer.
För framgångsrik LM RNA-Seq analyser av utvecklings fenomen, måste utvecklings sammanhang vara väl karakteriserad. Vi rekommenderar att genomföra en grundlig histologisk undersökning av processen eller domän av intresse innan du planerar ett experiment. Histologin av prover som behandlats för LM är i allmänhet dålig, eftersom vävnaderna är ofärgade och ej är monterade med täckglas som ger djup-of-field. Därför är det användbart att fastställa separata prover för färgning och observation på samma gång som LM Proverna fixeras (Figur 1C, och D).
RNA erhållet från LM material är i allmänhet fragmenterad och det totala utbytet är lågt 8. En förstärkning steg krävs för att generera tillräcklig RNA för biblioteks beredning 28. RNA-fragment längd bör bedömas efter förstärkning och före biblioteket generation. En genomsnittlig fragmentlängd av sigVeral hundra baspar anses allmänt bra, är 500 baspar utmärkt. Dålig RNA avkastning kan uppstå om vävnad är inte väl fast, om nedbrytning på grund av RNas kontaminering sker, eller om paraffinblock är felaktigt lagras. Det är bra att testa kvaliteten på fast vävnad genom att utföra en studie LM av ett relativt stort område innan ägnar en hel del tid att microdissecting mycket små områden. Eftersom det RNA som erhållits från LM-celler är fragmenterad och amplifiering med användning av en oligo dT-primer introducerar en stark 3 'bias, är denna metod inte lämplig för detektering av alternativa transkript, såsom splitsningsvarianter. Inte heller är LM lämplig för att detektera små RNA.
En alternativ metod för att kvantifiera transkriptet ackumulering i specifika vävnader eller cellulära domäner är RNA-seq av celler separerade genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 21. Denna metod kräver i allmänhet identifiering av en lämplig markörgen för regionen av intresse,generering av transgena växter som uttrycker ett fluorescent-märkt protein och protoplasting. FACS kombination med mikromatris har använts för att generera en expressions karta över Arabidopsis root genom att separera celler som uttrycker cell typspecifika promotorer i roten 22, 23. FACS av skjuta vävnader är mer utmanande än rot vävnader på grund av klorofyll autofluorescens 24. En begränsning av LM är att området av intresse måste kunna identifieras i histologiska sektioner. FACS kan vara en mer lämplig metod i fall där en lämplig markörgen finns. Valet av celler eller vävnader för att isolera och jämföra är en viktig faktor i transcriptomic analyser som använder antingen FACS eller LM.
De data som presenteras här visar att olika resultat kommer att erhållas beroende på de exakta domäner som valts ut för LM (Figur 3, Figur 8). Transkript av gener som uttrycks i en eller ett fåtal celler, såsom ns1, kommer att spädas ut när stora vävnadsområden analyseras. Det är troligt att om hela blad primordia Prover togs, NS1 utskrift inte skulle upptäckas. ZmPIN1a signifikant uppregleras i ligule jämfört med blad- och slida epidermis men denna skillnad förvirrad av vaskulär uttryck när alla cellager samplas. Omvänt kommer gener som uttrycks endast i L2-härledda cellskikt inte detekteras när endast epidermis samplas (Figur 8D). Denna studie visar att, medan LM RNA-Seq är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka skillnader i genuttryck under morfogenes, domänerna som valts ut för analys är avgörande för framgången för experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar S. Hake för pågående samarbete och stimulera diskussioner om ligule utveckling. Detta arbete stöds av National Science Foundation MCB 1052051 och IOS-1.848.478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
