Summary
هنا، نحن تقرير فضية بسيطة ومنخفضة التكلفة تلطيخ البروتوكول الذي يتطلب سوى ثلاثة من الكواشف ودقيقة 7 من تجهيز، وهو مناسبة لتوليد سريعة عالية الجودة الاشتراكية السوفياتية البيانات في التحليل الجيني.
Abstract
تكرار تسلسل بسيط (SSR) واحد من العلامات الأكثر فعالية استخدامها في البحوث الجينية النباتية والحيوانية وبرامج التربية الجزيئية. تلوين الفضة أسلوب مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في جل بولياكريلاميدي. ومع ذلك، البروتوكولات التقليدية لتلطيخ الفضية من الناحية التقنية شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. مثل العديد من المختبرات البيولوجية الأخرى تم التقنيات، والفضة تلطيخ البروتوكولات اطراد الأمثل لتحسين كفاءة الكشف. هنا، نحن تقرير فضية مبسطة تلطيخ الأسلوب الذي يقلل تكاليف الكاشف إلى حد كبير ويعزز وضوح القرار وصورة كشف. يتطلب الأسلوب الجديد الكواشف الثلاثة (نترات الفضة, هيدروكسيد الصوديوم وفورمالدهايد)، خطوتين رئيسيتين (التشريب والتنمية) وفقط 7 دقائق لتجهيز لجل polyacrylamide غير يشوه. بالمقارنة مع بروتوكولات سبق الإبلاغ عنها، هذا الأسلوب الجديد هو أسهل وأسرع ويستخدم أقل من الكواشف الكيميائية للكشف عن إصلاح قطاع الأمن. ولذلك، سيستفيد هذا فضية بسيطة ومنخفضة التكلفة وفعالة تلطيخ البروتوكول بمساعدة الواسمات تربية قبل جيل سريعة لإصلاح قطاع الأمن علامة البيانات ورسم الخرائط الجينية.
Introduction
وضع علامات على أساس بكر قد أحدث ثورة في علم الوراثة النباتية وتربية1. ومن علامات (SSR) تكرار تسلسل بسيط بين علامات الحمض النووي الأكثر شيوعاً والأكثر تنوعاً. تغطية الجينوم واسعة ووفرة وخصوصية الجينوم، والتكرار بعض الأسس الموضوعية لعلامات الاشتراكية السوفياتية بالإضافة إلى الإرث كودومينانت للكشف عن الأنماط الجينية متخالف2. واستخدمت عدة دراسات علامات الاشتراكية السوفياتية للتحقيق في التنوع الوراثي وتتبع النسب وبناء خرائط الربط الجينية ورسم خريطة للجينات للسمات الهامة اقتصاديا3،4.
يتم فصل منتجات PCR علامات الاشتراكية السوفياتية يشيع استخدام التفريد [اغروس] أو هلام polyacrylamide وتصور مع تلطيخ الفضة أو تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ثم بعد تلطيخ مع اثيديوم بروميد. تلوين الفضة لشظايا من الحمض النووي في الهلام بولياكريلاميدي هو أكثر حساسية من غيرها المصبوغة أساليب5،6 وقد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن شظايا من الحمض النووي مثل الاشتراكية السوفياتية علامات7.
مثل العديد من تقنيات المختبرات البيولوجية، تلطيخ الفضة من المواد الهلامية polyacrylamide تحسنا مطردا منذ، أولاً يتم الإبلاغ عنها كأسلوب تصور يفتت في 19798. التقنية تعديل في البداية للكشف عن شظايا من الحمض النووي من قبل بسام et al. 6 وفي عام 1991 وتحسنت ثم سانغينتي وزملاء العمل9 في عام 1994. وقد تم تحسين الأسلوب كذلك في الماضي بضعة عقود6،7،9،10،11،12،13،14 , 15-ومع ذلك، معظم هذه الإصدارات المحدثة من البروتوكولات لا تزال لديها بعض العيوب مثل ارتفاع الطلب التقنية وطويلة تجهيز الوقت للتثبيت وتركيب6، التي تحد من تطبيق هذه البروتوكولات7، 11. وضع بروتوكول أمثل الذي يجمع بين منخفضة التكلفة بكفاءة عالية من الحمض النووي جزء الكشف عن حاجة ملحة للتطبيق الروتيني للفضة تلطيخ في الأبحاث البيولوجية.
وباﻹضافة إلى ذلك، جل polyacrylamide يمكن تقسيم المواد الهلامية polyacrylamide يشوه وغير يشوه، وكلاهما يمكن استخدامها للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية استخدام الفضة تلطيخ الأسلوب. التأثير والقرار التي لا تختلف كثيرا، ولكن غير يشوه الهلام polyacrylamide هي أسهل للعملية وتأخذ أقل وقت16.
استناداً إلى البحوث السابقة15، هدف الدراسة الحالية لوصف فضة أمثل تلطيخ البروتوكول بالتفصيل للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في جل polyacrylamide غير يشوه سريعة وسهلة ومنخفضة التكاليف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد منتجات PCR علامات الاشتراكية السوفياتية
- تحضير جميع المواد الكيميائية والمواد الكاشفة لبكر ردود الفعل بما في ذلك قالب الحمض النووي (30 نانوغرام/ميليلتر)، 2 × PCR ميكس الرئيسية (التي تحتوي على 2 × PCR العازلة، 0.4 ملم لكل دنتب، 3 مم من مجكل2، يو/ميليلتر 0.1 بوليميراز "الدنا بوليميراز" والأصباغ)، 10 ميكرون لكل منهما إلى الأمام وعكس الإشعال ، والمقطر أو منزوع الماء (dH2س).
ملاحظة: علامات الاشتراكية السوفياتية المستخدمة في هذه الدراسة كانت PT51333 (الأمام تسلسل التمهيدي: 5 '-جكاككتتجتاتككجاكا-3' والتمهيدي عكس التسلسل: 5 '-تجكتتاجتكاتجتاككااتجا-3') و PT50903 (الأمام تسلسل التمهيدي: 5 '-آآتتتكتتكجتجتجاتاكتج-3' و عكس تسلسل التمهيدي: 5 '-أجاجاكتجككجتتجاتتجا-3') للتبغ، ومعادل-43 (الأمام تسلسل التمهيدي:-تجججاتجتجاجكتكتكت 5 '-3' وعكس التمهيدي التسلسل: 5 '-أججتككتتجججتجاتا-3') و CX-157 (الأمام تسلسل التمهيدي: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 'وعكس التسلسل التمهيدي: 5'-جاكاجكتكاكاكاتتجك-3 ') ملفوف صيني المزهرة. - إعداد 10 ميليلتر من مزيج PCR للتضخيم بإضافة 2 ميليلتر من قالب الحمض النووي، 5 ميليلتر 2 × PCR مزيج الرئيسي وميليلتر 0.2 كل التمهيدي إلى الأمام وعكس التمهيدي وميليلتر 2.6 dH2o.
- إجراء PCR التضخيم رد فعل في ثيرموسيكلير مع خطوة أولية 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، واتبع دورات 38 من 45 ثانية في 94 درجة مئوية تمسخ، 45 s في 55 درجة مئوية للصلب التمهيدي 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية للتمديد، وخطوة تمديد نهائي من 10 دقيقة في 72 ° ج؛ ثم تخزين منتجات PCR عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
2-إعداد الحلول Polyacrylamide الهلام الصب
- إعداد ل 1 × 5 TBE العازلة بتذويب ز 54 قاعدة تريس وحمض البوريك ز 27.5 في dH2س وإضافة 20 مل من 0.5 م يدتا (pH 8.0) وضبط الحل لوحدة تخزين نهائي من 1، 000 مل مع dH2o.
ملاحظة: يمكن تخزين TBE العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة أشهر. - إعداد ل 2 × 0.5 TBE العازلة بإضافة 200 مل من 5 × TBE العازلة إلى dH2س إلى وحدة تخزين نهائي ل 2، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد حل جل polyacrylamide غير يشوه 6% بتذويب ز 29 اكريلاميد الصف البيولوجيا الجزيئية وز 1 للبيولوجيا الجزيئية الصف ن، ن '--ميثيلينيبيساكريلاميدي في × 0.5 TBE العازلة إلى حجم 500 مل نهائي. تغطي زجاجة الحل مع رقائق الألومنيوم ومخزن في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
تنبيه: اكريلاميد يعتبر عصبي قوية وينبغي التعامل معها بحذر. دائماً ارتداء قفازات عند وزن مسحوق والتعامل مع الحلول التي تحتوي عليها. - تحضير حلاً (الجزائرية) فوق كبريتات أمونيوم 20% بتذويب ز 2 لوكالة الأنباء الجزائرية مع dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 10 مل. يمكن تخزينه في-20 درجة مئوية لمدة أشهر.
ملاحظة: لمزيد من الراحة، 10 مل من محلول APS 20% يمكن أن يكون الكوتيد إلى 1.5 مل أو 2 مل من أنابيب الطرد المركزي للتخزين في-20 درجة مئوية. ذوبان الجليد وتخلط جيدا قبل الاستخدام. - تحضير حلاً سيلاني ربط مخفف بإذابة 3 ميليلتر من ربط-سيلاني في 0.997 مل إيثانول 95% يحتوي على 0.5% حمض الخليك. يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة أسابيع.
تنبيه: ربط سيلاني السامة وارتداء القفازات عند التعامل مع الحل وإبقاء غرفة جيدة التهوية.
3-إعداد المواد الهلامية Polyacrylamide للتفريد
- أغسل مجموعة واحدة من ألواح الزجاج والفواصل مع المنظفات في ماء الصنبور، متبوعاً كاملة الشطف بدرهم2أولمبيك الجوية الجافة اللوحات بإعداد منهم في لوحة تجفيف الرف.
- تفريق 1 مل محلول ربط سيلاني على السطح الداخلي للوحة زجاجية مستطيلة الشكل، وجافة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا لم ينتشر الحل سيلاني ربط موحد على سطح اللوحة، الهلام قد تكون منفصلة خلال تلطيخ ويسفر عن تأثير المصبوغة غير مرضية. - تفريق 1 مل من صد سيلاني على السطح الداخلي لصفيحة الزجاج حقق مع مسحه وتمحو سيلاني صد الزائدة مع المناديل الورقية، والهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا لا معطف ريبيل-سيلاني على سطح لوحة زجاج موحد، قد تضر الهلام بتجريد جزئيا. - تجميع ألواح الزجاج مع الفواصل مع لوحة مسنن أعلى، والمشبك كلا الجانبين للجمعية مع صب المشابك.
- صب المبلغ المناسب (40 مل) من 6% غير يشوه حل جل polyacrylamide لكوب لمجموعة لوحة العرض 33 سم × 10 سم ارتفاع ومباعدة سمك 1.5 مم، وإضافة 20 ميليلتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) و 200 µLfresh 20% وكالة الأنباء الجزائرية وتخلط برفق.
ملاحظة: تم حساب المبلغ المناسب (40 مل) من حل جل من وحدة التخزين الداخلية لوحات اثنين مع سماكة الفواصل (30 سم × 8.5 سم × 0.15 سم). أما بالنسبة لمقدار تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية لجل البلمرة، هناك نسبة قياسية لحل جل تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية استناداً إلى مرجعية17. حل جل الموصوفة أعلاه يتم تخزينها في 4 درجات مئوية. إذا كان حل جل يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة، 20 ميليلتر من تيميد وميليلتر 100% 20 ينبغي أن تستخدم وكالة الأنباء الجزائرية. يحرك برفق خليط حل جل بعصا زجاجية لتجنب فقاعات الهواء في الحل. - من أجل الحل فورا بعناية إلى ألواح الزجاج المجتمعون على طول حافة لوحة مسنن، تملأ المساحة تقريبا إلى الأعلى، وإدراج المشط. إضافة كمية صغيرة من هلام الحل عبر المشط.
ملاحظة: الاحتفاظ ألواح الزجاج الأفقية للحيلولة دون تسرب الهلام. قم بإزالة أي فقاعات مع ربط فقاعة، إذا لزم الأمر. - السماح للهلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن تغيير وقت البلمرة مع درجات الحرارة لحل جل والبيئة. - بعد الجل تماما البلمرة، إزالة المشابك الصب وموقف مجموعة لوحة في وحدة الدبابات التفريد مع لوحة مسنن يواجه نحو الخزان العلوي المخزن المؤقت، وتستخدم المشابك الكبيرة لإرفاق لوحة تعيين إلى وحدة الدبابات.
- صب ل 1 × 0.5 TBE العازلة في كل من الجزء العلوي والسفلي الدوائر. إزالة المشط ومسح جميع الآبار جيدا مع المخزن المؤقت باستخدام ماصة أو حقنه.
ملاحظة: تأكد من أن ساندويتش جل في الجزء السفلي من اللوحة هو تماما غارقة في المخزن المؤقت دون أي فقاعات.
4-تشغيل والهلام
- تحميل حوالي 1 ميليلتر من منتج PCR في كل بئر من جل بولياكريلاميدي. تحميل سلم حجم الحمض النووي لكلا الجانبين من جل جنبا إلى جنب مع عينات منتجات PCR. إصلاح غطاء السلامة إلى الدائرة العليا المخزن المؤقت.
- الاتصال بالعملاء المتوقعين للإمداد بالطاقة، مطابقة المرمزة اللون الأحمر إلى الأحمر والأسود إلى الأسود. تشغيل الهلام في جهد مستمر من 110 V حتى تصل الصبغة إلى موقف محدد، عادة ~ 70 دقيقة.
ملاحظة: يمكن ضبط الوقت والجهد والتشغيل وفقا لحجم المنتجات PCR.
5-الفضة تلطيخ للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في غير Polyacrylamide هلام-
- بعد التفريد، تصب المخزن المؤقت من مجلس الشيوخ في كوب كبيرة عبر الصمام. فصل المشابك الجانبية وإزالة اللوحات من الجهاز، بعناية فصل لوحة زجاج مسنن واحد جنبا إلى جنب مع ملعقة وتأكد من أن رفات جل تعلق على لوحة زجاجية أخرى مغلفة بربط سيلاني.
- جعل 1 لتر حل التشريب الطازجة بإذابة 1.5 غم من إنيو3 في 1 ل dH2سين تحضير 1 لتر من حل تطوير جديدة بتذويب 10 جرام من هيدروكسيد الصوديوم في 900 مل من dH2س، وإضافة 1 مل من 37% فورمالدهيد ، وضبط حجم نهائي ل 1 استخدام dH2o.
ملاحظة: ارتداء القفازات، والتعامل مع المواد الكيميائية والحلول مع الرعاية المذكورة أعلاه. فإنه ليس من الضروري للحفاظ على الحلول والخطوات المقابلة مع الحلول في الظلام. - أشطف بعناية لوحة جل والزجاج مع وافرة dH2س لإزالة المخزن المؤقت التفريد، ثم ضع اللوحة مع هلام مواجهة على علبة بلاستيكية وتغرق الهلام في 1 لتر حل التشريب. وضع العلبة شاكر.
- اهتزاز الدرج برفق في ص 60/دقيقة لمدة 3-4 دقيقة.
ملاحظة: الهز وقت يمكن تعديلها وفقا لسماكة هلام وتركيز نترات الفضة في الحل التشريب. - نقل اللوحة خارج الحل التشريب ووضعها على صينية أخرى. شطف الحل التشريب المتبقية قبالة من سطح اللوحة وهلام استخدام dH وافرة2س مرتين لكل من 3-5 ق.
- ضع اللوحة مع هلام مواجهة على صينية أخرى وتغرق اللوحة في 1 لتر من تطوير حل، ثم يهز العلبة برفق في 50 ص/دقيقة لدقيقة ~ 3 رصد شظايا المظهر من الحمض النووي ووقف التنمية عند نسبة أعلى الإشارة للحمض النووي وشظايا لوحظ أن ضجيج الخلفية (هذه الخطوة يأخذ ~ 3 دقيقة).
- شطف اللوحة والهلام مع وافرة dH2س مرتين، وجاف لوحة جل مع المناديل الورقية.
- مسح الجل باستخدام ماسح ضوئي مناسب. ويعطي قرار 300 نقطة في البوصة وضع تصور واضح لشظايا من الحمض النووي. الهلام يمكن أيضا أن يتم تصويرها باستخدام كاميرا.
- يمكن سجل النطاقات نمط علامات الاشتراكية السوفياتية استناداً إلى الشظايا من الحمض النووي في الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أمبليكونس بكر قد أنتجت باستخدام أزواج التمهيدي الاشتراكية السوفياتية المقابلة في ملفوف صيني المزهرة والتبغ. بعد التفريد، كانت ملطخة الجل polyacrylamide استخدام الفضة أعلاه تلطيخ البروتوكول، الذي لا لبس فيه الكشف عن أنماط النطاقات من علامات الاشتراكية السوفياتية (الشكل 1).
لمقارنة كفاءة الكشف عن مختلف الفضة تلطيخ البروتوكولات، منتجات PCR علامات الاشتراكية السوفياتية في التبغ والمزهرة ملفوف صيني تم فصل استخدام التفريد جل polyacrylamide وتصور استخدام خمسة تلطيخ الفضة المنشورة بروتوكولات9،،من1112،،من1314 والبروتوكول الجديد. جميع البروتوكولات الستة الكشف عن الاشتراكية السوفياتية النطاقات أنماط للتبغ والمزهرة ملفوف صيني الأنماط الجينية (الشكل 2)، ولكن هذا البروتوكول كان أدنى ضجيج الخلفية وتباين أعلى من الحمض النووي وشظايا، حيث أنها تنتج الصورة أعلى الوضوح لفحص مجمع الأشكال المتعددة الاشتراكية السوفياتية لا لبس فيها. أن إدارة الوقت وعدد من الخطوات الرئيسية والكواشف المستخدمة لإكمال الفضية تلطيخ عملية مدرجة في الجدول 1 لكل بروتوكول، ويأخذ هذا البروتوكول الجديد الأقل وقتاً ويتطلب أقل من الكواشف الكيميائية وخطوات عملية.
ويبين الشكل 3 حساسية البروتوكول مقاسا ب bp 50-2,000 ماركر الحمض النووي في جل polyacrylamide غير يشوه.
رقم 1: الكشف عن الاشتراكية السوفياتية تباين أنماط. أنماط الكشف عن النطاقات الاشتراكية السوفياتية للأنماط الجينية ملفوف الصيني المزهرة (A) والتبغ (ب) استخدام تلطيخ الفضة الجديدة البروتوكول. منتجات PCR فصل على 6% غير يشوه polyacrylamide الجل والملون وفقا لتلطيخ البروتوكول الفضية المذكورة أعلاه. م لين هو علامة حجم الحمض النووي، الممرات تمثل 1 إلى 62 أمبليكونس من الأنماط الجينية 62 تضخيمه بأزواج التمهيدي الاشتراكية السوفياتية "CX-157" (التسلسل الإشعال إلى الأمام وعكس هي-تكجاكجكتجاكتكاكتجاك 5 '-3' و 5''-جاكاجكتكاكاكاتتجك-3 على التوالي) في المزهرة ملفوف صيني (الشكل 1A) و "PT51333" (تسلسل الإشعال إلى الأمام وعكس هي 5'' -جكاككتتجتاتككجاكا-3 و 5'-تجكتتاجتكاتجتاككااتجا-3'، على التوالي) في التبغ (الشكل 1B). الأسهم تشير إلى عصابات الاشتراكية السوفياتية المستهدفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مقارنة بين كفاءة الكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في التبغ والأنماط الجينية ملفوف صيني المزهرة الفضة مختلفة تلطيخ البروتوكولات باستخدام- تم فصل المنتجات بكر في 6% الهلام polyacrylamide غير يشوه وملطخة باستخدام خمسة نشرت الفضة المصبوغة البروتوكولات9،11،،من1213،14 والجديد البروتوكول. م لين علامة حجم الحمض النووي. حارات 1 إلى 4 تمثل أمبليكونس الاشتراكية السوفياتية كبسولة تفجير من "PT50903" (تسلسل الإشعال إلى الأمام وعكس هي 5'-آآتتتكتتكجتجتجاتاكتج-3' و 5 '-أجاجاكتجككجتتجاتتجا-3'، على التوالي) في أربعة التبغ الوراثية؛ الممرات 5 إلى 8 تشير إلى أمبليكونس الإشعال الاشتراكية السوفياتية "CX-43" (تسلسل الإشعال إلى الأمام وعكس 5 '-تجججاتجتجاجكتكتكت-3' و 5 '-أججتككتتجججتجاتا-3'، على التوالي) في أربعة المزهرة ملفوف صيني الوراثية. يتم الإشارة إلى العصابات الاشتراكية السوفياتية المستهدفة مع الأسهم. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 2 من ليو وآخرون. 8 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حساسية البروتوكول كما تقاس 50-2000 bp الحمض النووي علامة على جل polyacrylamide غير يشوه. لين الأولى كانت محملة 1µL ماركر الحمض النووي مع أحجام جزء من 50، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 1000، bp 1500 و 2000، كل منهما في 10 نانوغرام/ميليلتر. تم تحميل العينات المتبقية مع إضعاف مسلسل 1:2 في الممرات السابقة. وكان الحد الأدنى للمبلغ يمكن كشفها للبروتوكول pg 9.8 في حارةال 11 (2.2 بيكوغرام/م2 في 4، 5 مم2 جيدا). وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 1 من ليو et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| البند | سانغينتي et al. 9 | تشو وآخرون 11 | Et al. 12 | باين et al. 13 | كومار et al. 14 | بروتوكول جديد |
| إدارة الوقت (دقيقة) | 30 | 12 – 25 | 8-9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| عدد الخطوات | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| عدد من الكواشف | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
الجدول 1: إدارة الوقت، عدد من الخطوات الرئيسية والكواشف المستخدمة في الفضة مختلفة تلطيخ البروتوكولات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الغسيل جل بعد التلقيح خطوة حاسمة. حجم الغسيل عدم كفاية الوقت والمياه قد تتسبب إزالة الحل التشريب ناقصة على سطح اللوحة والهلام، ويؤدي إلى خلفية داكنة. النامية الوقت المناسب خطوة رئيسية أخرى، يمكن أن يؤدي تطوير الإفراط في خلفية بني داكن مع الصورة التباين المنخفض من شظايا من الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يؤثر خطوة التلقيح إلى حد كبير على كفاءة المصبوغة من شظايا من الحمض النووي. على الرغم من تمديد وقت الحمل أكثر من 5 دقيقة أو زيادة مقدار3 إنيو في الحل التشريب لم تتحسن إلى حد كبير نوعية المصبوغة، الحد من الإشباع في الوقت إلى أقل من 3 دقائق أو إنقاص مقدار إنيو (3 < 1 ز) يمكن أن ينتج ضحلة أو رمادي أسود شظايا من الحمض النووي.
عملية سريعة وسهلة لكفاءة الكشف عن الحمض النووي من المرغوب فيه فضة تلطيخ الأسلوب. يتجنب البروتوكول الجديد نمواً في هذه الدراسة تحديد، وقف والعديد من الخطوات الغسيل الموصوفة في الأخرى بروتوكولات6،،من910،11،12،13 , 14 دون التأثير على نوعية المصبوغة (الشكل 1 و الشكل 2)، ويتطلب خطوتين بسيطة التشريب والتنمية التي تأخذ 7 دقائق فقط. ولذلك، البروتوكول الجديد أسرع من كافة الأخرى المصبوغة البروتوكولات الحالية المتاحة6،7،9،10،11،12، 13،14. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب البروتوكول الجديد سوى ثلاث مواد كيميائية، أي. إنيو3وفورمالدهايد هيدروكسيد الصوديوم، في مبالغ مماثلة كالتي تستخدم في الأخرى بروتوكولات6،،من79،10،11،12، 13،14، ولذلك هو أكثر اقتصادا البروتوكول الجديد ويولد أقل من المواد الكيماوية الخطرة، الذي لا يقلل من تكلفة المواد الكيميائية فحسب بل يقلل أيضا من عملية مناولة المواد الخطرة للمواد الكيميائية الإضافية في مختبر.
البروتوكول الجديد تنتج صوراً واضحة مع ضجيج الخلفية منخفضة للكشف عن لا لبس فيها للجمهورية الاشتراكية السوفياتية النطاقات أنماط في التبغ والمزهرة ملفوف صيني الأنماط الجينية (الشكل 1). بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات، أنتجت البروتوكول الجديد أفضل تلطيخ تأثير الضوضاء الخلفية أدنى وأعلى الصورة التباين (الشكل 2). في نطاق 50-500 شركة بريتيش بتروليوم، حساسية البروتوكول الجديد للكشف عن الحمض النووي كان أقل من 19.5 بيكوغرام/ميليلتر (4.3 بيكوغرام/مم2) مع تركيز الحد أدنى من 9.8 بيكوغرام/ميليلتر (2.2 بيكوغرام/م2) (الشكل 3)، وهو أعلى من التي ذكرت في البروتوكولات الأخرى 7 , 12 , 13.
على الرغم من أن يمكن أن توفر تكنولوجيات وسم fluorescence إنتاجية عالية والكشف عن القرار أمبليكونس الحمض النووي، أنها تتطلب معدات متخصصة وأغلى الكواشف التي قد لا تكون متاحة للعديد من المختبرات البيولوجية، لا سيما تلك التي وفي البلدان النامية. البروتوكول الجديد المصبوغة بسيط وسريع أن شاشة ~ 800 عينات الحمض النووي للشخص الواحد يوميا، وبالتالي، وهو خيار جيد لهذه المختبرات إجراء الأبحاث الروتينية.
وفي الختام، البروتوكول الجديد نمواً في هذه الدراسة هو أسرع للعملية، أسهل في التنفيذ، وأرخص، وإلا يستخدم الكواشف الثلاثة – دون المساس بالكشف عن أثر أو صورة الوضوح – من جميع الفضة الموجودة الأخرى تلطيخ التقنيات. الفضية الجديدة تلطيخ البروتوكول قد استخدمت بنجاح في التبغ والبحوث ملفوف صيني المزهرة، ويمكن أن يكون أداة قيمة لنجاح الاشتراكية السوفياتية التنميط في الأنواع الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بمؤسسة العلوم الطبيعية قوانغدونغ في الصين (2015A030313500) والمقاطعات الرئيسية التعاونية أبحاث منهاج العمل الدولي للرئيسية العلمية البحوث مشروع قوانغدونغ التعليم العالي (2015KGJHZ015)، العلم و خطة تكنولوجيا إدارة قوانغدونغ احتكار التبغ (201403، 201705) والعلوم والتكنولوجيا خطة قوانغدونغ الصين (2016B020201001)، مشروع التدريب الوطنية للابتكار لطلاب المرحلة الجامعية (201711078001). الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل "وزارة الزراعة الأمريكية". وزارة الزراعة هو موفر تكافؤ الفرص ورب العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
