Summary
Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.
Abstract
Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d'argento è un metodo ampiamente usato per l'individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d'argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l'efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d'argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.
Introduction
Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento1. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l'individuazione di genotipi eterozigoti2. Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economicamente importanti3,4.
I prodotti di PCR di marcatori SSR comunemente sono separati mediante elettroforesi dell'agarosi o gel di poliacrilammide e poi visualizzati con la macchiatura d'argento o sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio. Macchiatura d'argento di frammenti di DNA in gel di poliacrilammide è più sensibile rispetto al altri colorazione metodi5,6 ed è stato ampiamente utilizzata per rilevare i frammenti di DNA ad esempio SSR marcatori7.
Come molte tecniche di laboratorio biologico, macchiatura d'argento del gel di poliacrilammide è costantemente migliorato dal suo primo segnalato come una tecnica di visualizzazione frammento nel 19798. La tecnica è stata inizialmente modificata per il rilevamento dei frammenti del DNA da Bassam et al. 6 nel 1991 e poi migliorato da Sanguinetti e colleghe9 nel 1994. Il metodo è stato ulteriormente ottimizzato nelle ultime pochi decenni6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Tuttavia, la maggior parte di queste versioni aggiornate dei protocolli hanno ancora alcuni svantaggi, come alta richiesta tecnica e lungo tempo per la fissazione di elaborazione e montaggio6, che limitano l'applicazione di questi protocolli7, 11. Un protocollo ottimale che combina basso costo ad alta efficienza di rilevazione del frammento del DNA è urgente per applicazioni di routine d'argento che macchia nella ricerca biologica.
Inoltre, gel di poliacrilammide può essere diviso in gel di poliacrilammide denaturante e non-denaturante, ed entrambi possono essere utilizzati per l'individuazione di marcatori SSR usando l'argento che macchia il metodo. L'effetto e la risoluzione delle quali non differiscono significativamente, ma non-denaturante del gel di poliacrilammide sono più facile da processo e prendere meno tempo16.
Sulla base della precedente ricerca15, lo scopo di questo studio è di descrivere un argento ottimizzato protocollo dettagliatamente per rilevazione veloce, facile e basso costo di SSR markers in un non-denaturante del gel di poliacrilammide di colorazione.
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Protocol
1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR
- Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl2, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH2O).
Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e sequenza inversa primer: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e invertire la sequenza primer: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') per il tabacco e CX-43 (trasmettere la sequenza primer: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e reverse primer sequenza: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (trasmettere la sequenza primer: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e invertire la sequenza primer: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') per fioritura cavolo cinese. - Preparare 10 µ l di miscela di PCR per l'amplificazione aggiungendo 2 µ l di DNA campione, 5 µ l di 2 × PCR master mix, 0,2 µ l di ogni primer forward e reverse primer e 2,6 µ l di dH2O.
- Eseguire la reazione di amplificazione di PCR in un termociclatore con un passo iniziale di 94 ° C per 5 min, seguite da 38 cicli di 45 s a 94 ° C per denaturazione, 45 s a 55 ° C per la ricottura di primer e 1 min a 72 ° C per estensione e un passo di estensione finale di 10 min a 72 ° C; quindi memorizzare i prodotti di PCR a 4 ° C per un uso successivo.
2. preparazione di soluzioni per poliacrilammide gel Casting
- Preparare 1 L di buffer TBE 5 × 54 g di Tris base e 27,5 g di acido borico in dH2O di dissoluzione, aggiungendo 20 mL di EDTA 0.5 M (pH 8.0) e regolando la soluzione ad un volume finale di 1, 000 mL con dH2O.
Nota: Tampone TBE può essere conservato a temperatura ambiente per mesi. - Preparare 2 L di buffer di TBE 0,5 × aggiungendo 200 mL di buffer TBE × 5 dH2O ad un volume finale di 2 L e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione al 6% non-denaturante del gel di poliacrilammide sciogliendo 29 g di biologia molecolare grado acrilamide e 1 g di biologia molecolare grado N, N'-methylenebisacrylamide nel buffer TBE × 0,5 ad un volume finale di 500 mL. Coprire il flacone della soluzione con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per un uso successivo.
Attenzione: Acrilamide è considerato una potente neurotossina e deve essere maneggiato con cura. Indossare sempre i guanti quando pesatura polveri e soluzioni per la movimentazione che lo contengono. - Preparare una soluzione di 20% ammonio persolfato (APS) sciogliendo 2 g di APS con dH2O ad un volume finale di 10 mL. Esso può essere conservato a-20 ° C per mesi.
Nota: Per comodità, 10 mL di soluzione al 20% APS può essere aliquotati in 1,5 mL o 2 mL di provette da centrifuga per conservazione a-20 ° C. Scongelare e mescolare bene prima dell'uso. - Preparare una soluzione diluita di bind-Silano sciogliendo 3 µ l di binding-Silano in 0,997 mL di etanolo al 95% contenente 0.5% di acido acetico. Esso può essere conservato a 4 ° C per settimane.
Attenzione: Bind-Silano è tossico, indossare guanti per maneggiare la soluzione e mantenere la camera ventilata.
3. preparazione di gel di poliacrilammide per elettroforesi
- Lavare una serie di lastre di vetro e distanziali con detergente in acqua di rubinetto, seguito da un risciacquo completo con dH2O. aria a secco le piastre impostandoli in una piastra stendino.
- Disperdere 1 mL di soluzione di bind-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro rettangolare e secco per 5 min.
Nota: Se la soluzione di bind-silano non si diffonde uniformemente sulla superficie della piastra, il gel può essere staccata durante la colorazione e provocare un effetto di colorazione insoddisfacente. - 1 mL di respingere-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro dentellata con un tampone di disperdere, pulire respingere-Silano in eccesso con una velina e aria secca per 5 min.
Nota: Se il repellere-silano non uniformemente rivestire la superficie della lastra di vetro, ciò potrebbe danneggiare il gel spelando parzialmente. - Montare le lastre di vetro con distanziali con la piastra dentata sulla parte superiore ed entrambi i lati dell'Assemblea con casting morsetti di serraggio.
- Versare la quantità appropriata (40 mL) di soluzione non-denaturante gel di poliacrilammide al 6% in un bicchiere per il set di piatto di larghezza di 33 cm × 10 cm di altezza e distanziale spessore 1,5 mm, aggiungere 20 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e mescolare delicatamente.
Nota: La quantità appropriata (40 mL) di soluzione di gel è stata calcolata dal volume interno delle due piastre con uno spessore di distanziali (30 cm × 8,5 cm × 0.15 cm). Per quanto riguarda la quantità di TEMED e APS per la polimerizzazione del gel, c'è in un formato standard della soluzione di gel di TEMED e APS basato sul riferimento17. La soluzione di gel sopra descritta è conservata a 4° C. Se la soluzione di gel è conservato a temperatura ambiente, 20 µ l di TEMED e 100 µ l del 20% APS deve essere utilizzato. Mescolare delicatamente la miscela di soluzione di gel con un bastoncino di vetro per evitare bolle d'aria nella soluzione. - Versare la soluzione immediatamente e accuratamente nelle lastre di vetro assemblate lungo il bordo della piastra dentellata, riempire lo spazio quasi al top e inserire il pettine. Aggiungere un piccolo volume di soluzione di gel sopra il pettine.
Nota: Tenere le piastre di vetro orizzontale per impedire la fuoriuscita del gel. Rimuovere tutte le bolle con un gancio di bolla, se necessario. - Lasciare che il gel da impostare per 30 min a temperatura ambiente.
Nota: Il tempo di polimerizzazione cambiano le temperature della soluzione di gel e ambiente. - Dopo il gel è completamente polimerizzazione, rimuovere i morsetti di colata e posizionare la piastra impostata nella centralina di carro armato di elettroforesi con il piatto dentellato rivolto verso il serbatoio tampone superiore e usate grande fascette per fissare la piastra con impostazione in serbatoio.
- Versare 1 L di 0,5 × TBE buffer in ciascuna della tomaia e le camere inferiori. Togliere il pettine e lavare abbondantemente tutti i pozzetti con buffer utilizzando una pipetta o siringa.
Nota: Assicurarsi che il sandwich di gel nella parte inferiore della piastra è completamente imbevuto nel buffer senza eventuali bolle.
4. running gel
- Caricare circa 1 µ l di prodotto di PCR in ogni pozzetto del gel di poliacrilammide. Caricare una scaletta di formato di DNA ad entrambi i lati del gel insieme con i campioni dei prodotti di PCR. Fissare il coperchio di sicurezza per l'alloggiamento superiore del buffer.
- Collegare i cavi dell'alimentazione, di corrispondenza il codice colore rosso con rosso e nero al nero. Esegua il gel a una tensione costante di 110 V, fino a quando il colorante raggiunge una posizione definita, normalmente per ~ 70 min.
Nota: Il tempo di tensione e corrente può essere regolato in base alle dimensioni dei prodotti di PCR.
5. colorazione per la rilevazione di marcatori SSR in un Non-poliacrilammide Gel argento
- Dopo l'elettroforesi, svuotare il buffer dalla camera superiore in un grande bicchiere tramite la valvola. Staccare i morsetti laterali, rimuovere le piastre dall'apparecchio, attentamente separare la lastra di vetro dentellata lungo un lato con una spatola e assicurarsi che i gel rimane attaccato a altra piastra di vetro rivestito con bind silano.
- 1 L di soluzione di impregnazione fresco sciogliendo 1,5 g di AgNO3 in 1 L di dH2O. preparare 1 L di soluzione di sviluppo fresco sciogliendo 10 g di NaOH in 900 mL di dH2O, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% e regolare ad un volume finale di 1 L utilizzo dH2O.
Nota: Indossare guanti e gestire i prodotti chimici e le soluzioni con cura sopra. Non è necessario mantenere le soluzioni e i passaggi corrispondenti con le soluzioni al buio. - Risciacquare accuratamente la piastra gel e vetro con ampio dH2O per rimuovere il tampone di elettroforesi, quindi posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica e immergere il gel in 1 L di soluzione di impregnazione. Reinserire il vassoio su un agitatore.
- Agitare delicatamente il vassoio a 60 giri/min per 3-4 min.
Nota: Tempo di agitazione può essere regolata secondo lo spessore del gel e la concentrazione di nitrato di argento nella soluzione di impregnazione. - Spostare la piastra dalla soluzione di impregnazione e metterlo su un altro vassoio. Risciacquare la soluzione residua impregnazione fuori dalla superficie della piastra e il gel utilizzando un ampio dH2O due volte per 3-5 s ciascuno.
- Posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un altro vassoio, immergere la piastra in 1 L di soluzione di sviluppo, quindi agitare delicatamente il vassoio a 50 giri/min per un minimo di ~ 3 Monitor l'aspetto del DNA frammenti e fermare lo sviluppo quando il più alto rapporto del segnale del DNA frammenti al rumore di fondo è osservato (questo passaggio prende ~ 3 min).
- Sciacquare la piastra e il gel con un ampio dH2O due volte e asciugare la lastra di gel con una velina.
- Scansione il gel utilizzando uno scanner appropriato. Una risoluzione di 300 dpi dà una chiara visualizzazione dei frammenti del DNA. Il gel può essere fotografato anche utilizzando una macchina fotografica.
- Il disegno a strisce di marcatori SSR possa essere segnato basato su frammenti di DNA nell'immagine.
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Representative Results
Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l'elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l'argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1).
Per confrontare l'efficienza di rivelazione d'argento diverso protocolli di colorazione, prodotti di PCR di marcatori SSR nel tabacco e fioritura cavolo cinese sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e visualizzati usando la macchiatura d'argento pubblicato cinque protocolli9,11,12,13,14 e il nuovo protocollo. Tutti i sei protocolli rilevati SSR disegni per tabacco a strisce e la fioritura di genotipi di cavolo cinese (Figura 2), ma il presente protocollo aveva il rumore di fondo più basso e più alto contrasto del DNA frammenti, tale che ha prodotto la migliore immagine chiarezza per lo screening non ambigua dei polimorfismi SSR. Il tempo di esecuzione e il numero dei passaggi principali e i reagenti utilizzati per completare il processo di colorazione di argento sono elencati nella tabella 1 per ogni protocollo, il nuovo protocollo prende poco tempo e richiede un minor numero di reagenti chimici e fasi del processo.
La figura 3 Mostra la sensibilità del protocollo, come misurato da bp 50-2.000 marcatore del DNA su un gel di poliacrilammide non-denaturante.
Figura 1: rilevamento di disegni a strisce SSR. Modelli di rilevazione del SSR bendaggio per genotipi di fioritura cavolo cinese (A) e tabacco (B) usando la macchiatura d'argento nuovo protocollo. I prodotti PCR sono stati separati su gel di poliacrilammide 6% non-denaturante e tinto secondo il protocollo di macchiatura d'argento sopra riportati. Il vicolo M è marcatore di DNA, corsie 1 a 62 rappresentano gli ampliconi di 62 genotipi amplificato da coppie di primer SSR di "CX-157" (le sequenze dei primer forward e reverse sono 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' e 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', rispettivamente) in fioritura cavolo cinese (Figura 1A) e "PT51333" (le sequenze dei primer forward e reverse sono 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' e 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', rispettivamente) nel settore del tabacco (Figura 1B). Le frecce indicano le bande SSR di destinazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: confronto tra l'efficienza di rivelazione per marcatori SSR nel tabacco e genotipi di cavolo cinese fioritura utilizzando diverso argento che macchia i protocolli. I prodotti PCR sono stati separati nel 6% dei non-denaturante del gel di poliacrilammide e macchiato utilizzando cinque pubblicato di protocolli macchiatura d'argento9,11,12,13,14 e la nuova protocollo. Il vicolo M è marcatore di DNA. 1 a 4 corsie rappresentano gli ampliconi di primer SSR di "PT50903" (le sequenze dei primer forward e reverse sono 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'e 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', rispettivamente) in quattro genotipi di tabacco; 5 a 8 corsie indicano gli ampliconi di primer SSR di "CX-43" (le sequenze dei primer forward e reverse sono 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'e 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3', rispettivamente) in quattro genotipi di cavolo cinese di fioritura. Le bande SSR di destinazione sono indicate con le frecce. Questa figura è stata modificata dalla Figura 2 di Liu et al. 8 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sensibilità del protocollo come misurato da 50-2000 bp DNA marker su un gel di poliacrilammide non-denaturante. La prima corsia è stata caricata con 1 µ l di DNA marker con dimensioni di frammento di 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 e 2000 bp, ciascuno a 10 ng / µ l. I restanti campioni sono stati caricati con una diluizione seriale 1:2 in corsie precedente. L'importo minimo rilevabile per il protocollo era 9,8 pg nella corsia 11th (2,2 pg/mm2 in un 4,5 mm2 pure). Questa figura è stata modificata dalla Figura 1 di Liu et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Elemento | Sanguinetti et al. 9 | Qu et al. 11 | Un et al. 12 | Byun et al. 13 | Kumar et al. 14 | Nuovo protocollo |
| Tempo di esercizio (min) | 30 | 12 – 25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| Numero di passi | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Numero di reagenti | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabella 1: Durata, numero di passaggi chiave e dei reagenti utilizzati in argento diverso protocolli di coloritura.
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Discussion
Il lavaggio del gel dopo l'impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l'efficienza colorazione dei frammenti del DNA. Anche se estendere il tempo di impregnazione oltre 5 min o aumento AgNO3 quantità della soluzione di impregnazione non migliorare significativamente la qualità di colorazione, riducente l'impregnazione tempo a meno di 3 min o diminuendo la quantità di AgNO3 ( < 1 g) può causare frammenti di DNA di nero grigi o superficiali.
Un'operazione semplice e veloce per la rilevazione del DNA efficiente è auspicabile per un argento che macchia il metodo. Il nuovo protocollo sviluppato in questo studio evita la fissazione, arresto e diversi passaggi di lavaggio descritto in altri protocolli6,9,10,11,12,13 , 14 senza compromettere la qualità di colorazione (Figura 1 e Figura 2) e richiede solo due semplici passaggi di impregnazione e sviluppo che porterà a 7 min. Di conseguenza, il nuovo protocollo è più veloce di tutti gli altri colorazione protocolli correnti disponibili6,7,9,10,11,12, 13,14. Inoltre, il nuovo protocollo richiede solo tre prodotti chimici, vale a dire. AgNO3, formaldeide e NaOH, in quantità simile a quello utilizzato in altri protocolli6,7,9,10,11,12, 13,14, di conseguenza, il nuovo protocollo è più economico e genera pericoli meno chimici, che non solo riduce il costo di chimico ma anche riduce al minimo il processo di movimentazione dei materiali pericolosi dei prodotti chimici supplementari nella laboratorio.
Il nuovo protocollo prodotto immagini nitide con rumore di fondo basso per l'individuazione univoca della SSR disegni nel settore del tabacco a strisce e la fioritura di genotipi di cavolo cinese (Figura 1). Rispetto ad altri protocolli, il nuovo protocollo prodotto la migliore colorazione effetto con il rumore di fondo più basso e più alto contrasto dell'immagine (Figura 2). La gamma di 50-500 bp, la sensibilità del nuovo protocollo per la rilevazione del DNA era meno di 19,5 pg / µ l (4,3 pg / mm2) con una concentrazione minima di 9,8 pg / µ l (2,2 pg/mm2) (Figura 3), che è superiore a quello segnalato in altri protocolli 7 , 12 , 13.
Anche se tecnologie di etichettatura a fluorescenza possono fornire elevato throughput e rilevamento di risoluzione degli ampliconi del DNA, richiedono attrezzature specializzate e reagenti più costosi che potrebbero non essere accessibili per molti laboratori biologici, soprattutto quelli nei paesi in via di sviluppo. Il nuovo protocollo di colorazione è semplice e veloce che può schermo ~ 800 campioni di DNA per persona al giorno, così, è una buona opzione per questi laboratori eseguire la ricerca di routine.
In conclusione, il nuovo protocollo sviluppato in questo studio è più veloce di processo, più facile da implementare, più economico e utilizza solo tre reagenti — senza compromettere la chiarezza di effetto o immagine di rilevamento — rispetto a tutti gli altri argento esistente tecniche di colorazione. Il nuovo protocollo di colorazione argento è stato utilizzato con successo in tabacco e fioritura cavolo cinese ricerca e può essere uno strumento prezioso per la genotipizzazione SSR successo in altre specie.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato il Natural Science Foundation di Guangdong (2015A030313500), la piattaforma di ricerca di Key International Cooperative provinciali e i principali scientifico ricerca progetto di Guangdong istruzione superiore (2015KGJHZ015), la scienza e Piano per le tecnologie di Guangdong amministrazione del monopolio del tabacco (201403, 201705), la scienza e la tecnologia piano di Guangdong, Cina (2016B020201001), il progetto di formazione nazionale di innovazione per gli studenti (201711078001). Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell'agricoltura. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
