Summary
在这里, 我们报告一个简单和低成本的银染色协议, 只需三试剂和7分钟的处理, 并适合快速生成高质量的 SSR 数据的遗传分析。
Abstract
简单序列重复 (SSR) 是植物和动物遗传研究和分子育种项目中最有效的标记之一。银染色是一种广泛应用于聚丙烯酰胺凝胶中 SSR 标记检测的方法。然而, 传统的银染色协议在技术上要求和耗时。与许多其他生物实验室技术一样, 银染色协议已稳步优化, 以提高检测效率。在这里, 我们报告一个简化的银染色方法, 大大降低试剂成本, 提高检测分辨率和图像清晰度。新的方法需要两个主要步骤 (浸渍和开发) 和三试剂 (硝酸银, 氢氧化钠和甲醛), 和只有7分钟的加工为非变性聚丙烯酰胺凝胶。与以前报告的协议相比, 这种新方法更容易、更快, 并且使用较少的化学试剂进行 SSR 检测。因此, 这种简单、低成本、有效的银染色协议将通过快速生成 SSR 标记数据, 有利于遗传图谱和标记辅助育种。
Introduction
PCR 标记技术的发展使植物遗传学和育种学的研究发生了革命性的改变1。简单序列重复 (SSR) 标记是最常用和最多才多艺的 DNA 标记之一。其广泛的基因组覆盖率, 丰度, 基因组特异性和重复性是 SSR 标记的优点, 除了它们的呈共显性遗传检测异型基因型2。一些研究已经使用 SSR 标记来调查遗传多样性, 跟踪祖先, 构建基因连锁图, 并映射经济重要性状的基因3,4。
SSR 标记的 PCR 产物通常用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 然后用银染色或紫外光溴溴化物染色。聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 片段的银染色比其他染色方法更敏感5,6 , 并已广泛用于检测 dna 片段, 如 SSR 标记7。
与许多生物实验室技术一样, 聚丙烯酰胺凝胶的银染色已稳步改善, 因为它第一次被报告为片段可视化技术在 1979年8。该技术最初被修改为检测 DNA 片段的巴萨姆et 等。6在 1991年, 然后由桑吉内蒂和同事在1994年改进9 。在最近几十年中, 该方法已进一步优化6、7、9、10、11、12、13、14,15. 然而, 大多数这些更新版本的协议仍然有一些缺点, 如高技术需求和长时间的固定和安装6, 这限制了这些协议的应用7, 11。为了在生物研究中常规应用银染色, 迫切需要采用低成本、高效的 DNA 片段检测相结合的最优协议。
此外, 聚丙烯酰胺凝胶可分为变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶, 并可用于检测 SSR 标记使用银染色法。其效果和分辨率并无显著差异, 但非变性聚丙烯酰胺凝胶更易于处理, 且耗时较短16。
在以前的研究15的基础上, 本研究的目的是详细描述一个优化的银染色协议, 以便在非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速、简便、低成本地检测 SSR 标记。
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Protocol
1. SSR 标记 PCR 产物的制备
- 准备所有的化学试剂和 PCR 反应, 包括模板 DNA (30 ng/µL), 2× pcr 大师组合 (包含 2× pcr 缓冲器, 每 dNTP 的0.4 毫米, 3 毫米氯化镁2, 0.1 U/µL Taq 脱氧核糖核酸聚合酶和染料), 10 µM 每向前和反向引物、蒸馏或去离子水 (dH2O)。
注: 本研究使用的 SSR 标记为 PT51333 (正向底漆序列: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3 ' 和反向引物序列: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') 和 PT50903 (正向底漆序列: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 ' 和反向底漆序列: 5 '-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') 为烟草和 CX-43 (向前底漆序列: 5 '-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 ' 和反向引物 sequence:5 '-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ') 和 CX-157 (向前底漆序列: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 "和反向引物序列: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3 ') 为开花大白菜。 - 通过添加2µL 模板 DNA、5µL 2× pcr 总混合、每向前底漆和反向底漆0.2 µL 和 dH2.6O 的2µL, 制备10µL 的 pcr 组合物进行扩增。
- 执行 PCR 放大反应在一个 thermocycler 的初始步骤94°c 为5分钟, 跟随38周期四十五年代在94°c 为变性, 四十五年代在55°c 为底漆退火并且1分钟在72°c 为引伸, 并且最后的延长步骤 10 min 在72°C;然后存储 PCR 产品在4°c, 供以后使用。
2. 聚丙烯酰胺凝胶铸件溶液的制备
- 在 dh2o 中溶解54克的三基和27.5 克硼酸, 加入20毫升 (pH 0.5), 用 dh8.0o 将溶液调整为1、000毫升的最终体积, 5×1升。
注: 缓冲器可在室温下储存数月。 - 将200毫升的5×缓冲液添加到 dH2O 到最终容积2升, 并在室温下贮存, 0.5×2升的缓冲液。
- 在0.5×缓冲液中溶解29克分子生物学级丙烯酰胺和1克分子生物学级 n、n '-methylenebisacrylamide, 制备6% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液, 最终体积为500毫升。用铝箔盖住溶液瓶, 贮存在4摄氏度, 供以后使用。
注意: 丙烯酰胺被认为是一种强有力的神经毒素, 应该小心处理。在称量粉末和处理包含它的解决方案时, 总是戴上手套。 - 通过将2克 ap 与 dH2O 溶为10毫升的最终体积, 准备20% 过硫酸铵 (aps) 溶液。它可以储存在-20 °c 几个月。
注: 为方便起见, 10 毫升 20% APS 溶液可 aliquoted 为1.5 毫升或2毫升的离心管储存在-20 摄氏度。在使用前要解冻并混合好。 - 将3µL 的束缚硅烷溶于0.997 毫升的95% 乙醇中, 制备稀释的束缚硅烷溶液, 其中含有0.5% 的乙酸。它可以储存在4摄氏度的几个星期。
注意: 粘合硅烷是有毒的, 在处理溶液时戴上手套, 保持房间通风。
3. 电泳用聚丙烯酰胺凝胶的制备
- 在自来水中用洗涤剂清洗一组玻璃板和垫片, 然后用 dH2进行彻底冲洗, 然后将这些盘子放在板材烘干机架上晾干。
- 将1毫升的束缚硅烷溶液分散到矩形玻璃板的内表面, 干燥5分钟。
注: 如果粘合-硅烷溶液不均匀地分布在板材表面, 凝胶在染色过程中可能被分离, 导致染色效果不理想。 - 用拭子将1毫升的排斥硅烷分散到缺口玻璃板的内表面, 用纸巾擦拭多余的排斥硅烷, 空气干燥5分钟。
注: 如果排斥硅烷不均匀地涂层玻璃板材的表面, 它可能通过部分剥离损坏胶凝体。 - 在顶部装配有缺口板的玻璃板, 并用铸件夹具将装配的两侧夹紧。
- 倒入适当数量 (40 毫升) 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液的烧杯为33厘米宽 x 10 厘米高度和间隔厚度1.5 毫米, 添加20µL 的 tetramethylethylenediamine (TEMED) 和200µLfresh 20% APS 和混合轻轻。
注: 凝胶溶液的适量 (40 毫升) 是从两个板的内部容积 (30 厘米 x 8.5 厘米 x 0.15 厘米) 计算出来的。对于凝胶聚合的 TEMED 和 aps 的用量, 根据参考17, 有一个标准的凝胶溶液与 TEMED 和 aps 的比例。上面描述的凝胶溶液储存在4°c。如果凝胶溶液贮存在室温下, 应使用20µL 的 TEMED 和100µL 20% APS。用玻璃棒轻轻搅动凝胶溶液的混合物, 以避免溶液中气泡。 - 立即将溶液倒入切口板边缘的组装玻璃板上, 将空间几乎填满, 然后插入梳子。在梳子上加入一小块凝胶溶液。
注: 保持玻璃板水平, 防止凝胶泄漏。如有必要, 用气泡钩去除气泡。 - 允许凝胶在室温下设置为30分钟。
注: 聚合时间可能随着凝胶溶液和环境温度的变化而改变。 - 在凝胶完全聚合后, 取下铸件夹具, 将所设的板套放在电泳槽单元中, 并将缺口板朝向上缓冲储层, 用大钳将板材固定在油箱单元上。
- 将 0.5×1升的缓冲液倒入上、下腔。用吸管或注射器取出梳子, 用缓冲器彻底冲洗所有水井。
注: 确保在盘子底部的凝胶三明治完全浸泡在没有气泡的缓冲液中。
4. 运行凝胶
- 将1µL 的 PCR 产物载入聚丙烯酰胺凝胶的各个井中。将 DNA 大小的梯子和 PCR 产品的样品一起载入凝胶的两侧。将安全盖固定在上部缓冲室。
- 将引线连接到电源, 将颜色编码的红色与红色和黑色相匹配。在110伏的恒定电压下运行凝胶, 直到染料达到定义的位置, 通常为 ~ 70 分钟。
注: 电压和运行时间可根据 PCR 产品的大小进行调整。
5. 用于检测非聚丙烯酰胺凝胶中 SSR 标记的银染色法
- 电泳后, 将缓冲液从上部腔体排出到大烧杯中通过阀门。分离侧夹, 从设备上取下盘子, 小心地将缺口玻璃板沿一侧与刮刀分开, 并确保该凝胶仍然附着在涂有束缚硅烷的其它玻璃板上。
- 1 l 的新鲜浸渍溶液溶解1.5 克 AgNO3在 dh 的 1 L 中2o. 通过溶出毫升的氢氧化钠, 在 dh 1 O, 添加 10 ml 900 毫升甲醛的情况下, 制备2升的新开发溶液., 并调整为使用 dH2O 的最终卷1升。
注: 佩戴手套并小心处理上述化学品及解决方案。没有必要在黑暗中保留解决方案和相应的步骤。 - 用足够的 dH2O 仔细冲洗凝胶和玻璃板, 去除电泳缓冲液, 然后将该板与凝胶置于塑料托盘上, 将凝胶浸入浸渍液的1升中。把托盘放在振动筛上。
- 轻轻摇动托盘在 60 r/分钟3-4 分钟。
注: 在浸渍溶液中, 可根据硝酸银的凝胶厚度和浓度来调节震动时间。 - 把盘子移出浸渍液, 放到另一个托盘上。用足够的 dH2O 两次, 分别从板表面和凝胶中冲洗残余浸渍液, 每双3-5 秒。
- 将印版与胶面置于另一托盘上, 将板材浸入1升的开发溶液中, 然后轻轻地摇动托盘 50 r/分钟3分钟. 监测 dna 片段的出现和停止发育当 dna 片段信号的最高比率 对背景噪声被观察 (这步采取 ~ 3 分钟)。
- 用足够的 dH2O 两次冲洗盘子和凝胶, 用纸巾将凝胶板烘干。
- 使用适当的扫描仪扫描凝胶。300 dpi 的分辨率给出了 DNA 片段的清晰可视化。这种凝胶也可以用照相机拍照。
- SSR 标记的带状模式可以根据图像中的 DNA 片段进行评分。
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Representative Results
采用相应的 SSR 引物对 amplicons 甘蓝和烟草进行了 PCR 制备。电泳后, 采用上述银染色协议对聚丙烯酰胺凝胶进行染色, 明确检测到 SSR 标记的带状模式 (图 1)。
为了比较不同银染色协议的检测效率, 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离了烟草和开花白菜中 SSR 标记的 PCR 产物, 并用五的银染色方法进行了可视化。协议9,11,12,13,14和新协议。所有六协议都检测到烟草和开花大白菜基因型的 SSR 带型 (图 2), 但本协议的背景噪声最低, DNA 片段的对比度最高, 从而产生了最高的图像明确地筛选 SSR 多态性。在每个协议的表 1中列出了用于完成银色染色过程的主要步骤和试剂的运行时间和数量, 新的协议需要最少的时间, 并且需要较少的化学试剂和工艺步骤。
图 3显示了在非变性聚丙烯酰胺凝胶上由 50-2, 000 bp DNA 标记测量的协议的灵敏度。
图 1: 检测 SSR 带状模式.开花大白菜基因型 SSR 带型的检测(A)和烟草(B)使用新的银色染色协议。PCR 产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离, 根据上述银染色协议染色。车道 M 是 DNA 大小标记, 车道1到62代表了62基因型的 amplicons 由 SSR 引物对 "CX-157" (向前和反向引物的序列是 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3'和 5'-GGACAGCTTCACACATTTGC-3',分别) 在开花白菜 (图 1A) 和 "PT51333" (正向和反向引物序列是 5'-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3'和 5'-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3',分别为)烟草 (图 1B)。箭头指向目标 SSR 带。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用不同的银染色协议对烟草和开花大白菜基因型中 SSR 标记的检测效率进行比较.PCR 产物在6% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离, 并使用五种已发布的银染色协议9,11,12,13,14和新协议。车道 M 是 DNA 大小标记。车道1到4代表了 "PT50903" 的 SSR 引物的 amplicons (前向和反向引物的序列分别为5个'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 ' 和 5 '-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA 3 ') 在四烟草基因型;车道5到8表明了 "CX-43" 的 SSR 引物的 amplicons (前、反向引物序列为 5 '-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 ' 和 5 '-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ', 分别) 在四开花大白菜基因型。目标 SSR 带用箭头表示。此数字已从 "刘et"的图 2中进行了修改。8请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上用 50-2000 bp DNA 标记测量协议的灵敏度.第一条车道装载了 DNA 标记的1µL 与片断大小的 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 和 2000 bp, 每个在 10 ng/µL。剩余的样品在前面的车道被装载了1:2 连续稀释。该协议的最低检测量为 11th车道 (2.2 页/毫米2 4.5 毫米2 ) 中的9.8 页。此数字已从刘et 等的图 1中进行了修改。8.请单击此处查看此图的更大版本.
| 项目 | 桑吉内蒂等。9 | 曲等。11 | et 。12 | 边等。13 | 库马尔等14 | 新协议 |
| 运行时间 (分钟) | 30 | 12–25 | 8–9 | 9–31 | 42 | 6–7 |
| 步骤数 | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| 试剂数量 | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
表 1:运行时间、用于不同银染色协议的关键步骤和试剂的数量.
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Discussion
浸渍后的凝胶洗涤是一个关键步骤。洗涤时间和水量不足, 可能导致板材和凝胶表面的浸渍液不完全去除, 造成暗背景。适当的开发时间是另一个关键步骤, 过度开发可能导致黑褐色背景与低对比度图像的 DNA 片段。此外, 浸渍步骤显著影响 DNA 片段的染色效率。虽然在浸渍溶液中延长浸渍时间超过5分钟或增加 AgNO3量, 但不会显著改善染色质量, 将浸渍时间减少到少于3分钟或减少 AgNO3 (< 1 克) 可能导致灰色或浅黑色 DNA 片段。
一个快速和容易的操作, 以有效的 DNA 检测是可取的银染色方法。本研究开发的新协议避免了其他协议6、9、10、11、12、13中描述的固定、停止和几个洗涤步骤。,14不影响染色质量 (图 1 & 图 2), 只需要两个简单步骤进行浸渍和开发, 需要7分钟。因此, 新协议的速度比所有其他染色协议当前可用的6,7,9,10,11,12, 13,14。此外, 新的协议只需要三种化学品, i. e。AgNO3, 甲醛和氢氧化钠, 在其他协议6,7,9,10,11,12中使用的类似数量, 13,14因此, 新的协议更经济, 并产生更少的化学危害, 这不仅降低了化学成本, 而且还最大限度地减少了额外化学品的危险材料处理过程实验室。
新的协议产生了清晰的图像, 低背景噪声, 以明确检测的 SSR 带模式的烟草和开花大白菜基因型 (图 1)。与其他协议相比, 新协议产生的最佳染色效果是最低的背景噪音和最高的图片对比度 (图 2)。在 50-500 bp 的范围内, 新的 DNA 检测协议的灵敏度小于 19.5 pg/µL (4.3 页/毫米2), 最低浓度为 9.8 pg/µL (2.2 pg/毫米2) (图 3), 比其他协议中报告的要高。7,12,13。
虽然荧光标记技术可以提供高吞吐量和分辨率检测 DNA amplicons, 但它们需要专门的设备和更昂贵的试剂, 许多生物实验室可能无法访问, 特别是那些在发展中国家。新的染色协议简单快速, 每天可以筛查800份 DNA 样本, 因此, 对这些实验室进行例行研究是很好的选择。
总之, 本研究开发的新协议比所有现有的银染色技术更快地处理, 更易于实施, 更便宜, 而且只使用三试剂-不影响检测效果或图像清晰度。新的银染色协议已成功地应用于烟草和开花白菜的研究, 可作为成功的 SSR 基因分型在其他物种中的重要工具。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项工作由中国广东自然科学基金 (2015A030313500)、省级重点国际合作研究平台和广东省高等教育重点科研项目 (2015KGJHZ015)、科学与广东省烟草专卖管理技术方案 (201403、201705)、广东省科技计划 (2016B020201001)、全国大学生创新培训项目 (201711078001)。在本出版物中提及商号或商业产品, 纯粹是为了提供具体信息, 并不意味着美国农业部的建议或认可。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
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