Summary
Her rapporterer vi en enkel og billig sølvfarvning protokol, som kræver kun tre reagenser og 7 min. behandling, og er velegnet til hurtig generation af høj kvalitet SSR data i den genetiske analyser.
Abstract
Simpel sekvens gentages (SSR) er en af de mest effektive markører, der anvendes i plante- og genetisk forskning og molekylær avlsprogram. Sølv farvning er en meget anvendt metode til påvisning af SSR markører i en polyacrylamid gel. Men konventionelle protokoller for sølv farvning er teknisk krævende og tidskrævende. Ligesom mange andre biologisk laboratorium har teknikker, sølv farvning protokoller været støt optimeret for at forbedre detektion effektivitet. Her rapporterer vi en forenklet sølvfarvning metode, der væsentligt reducerer reagens omkostninger og forbedrer påvisning opløsning og billede klarhed. Den nye metode kræver to hovedtrin (imprægnering og udvikling) og tre reagenser (sølvnitrat, natriumhydroxid og formaldehyd) og kun 7 min. behandling for en ikke-denatureringen polyacrylamid gel. I forhold til tidligere rapporteret protokoller, denne nye metode er lettere, hurtigere og bruger færre kemiske reagenser til SSR påvisning. Derfor, denne enkle, billige og effektive sølvfarvning protokollen vil gavne genetiske kortlægning og markør-assisteret avl af en hurtig generation af SSR markør data.
Introduction
Udviklingen af PCR-baseret markører har revolutioneret science for Plantegenetik og avl1. Simpel sekvens gentages (SSR) markører er blandt de mest almindeligt anvendte og mest alsidige DNA markører. Deres brede genom dækning, overflod, genom specificitet og repeterbarhed er nogle af fordelene ved SSR markører ud over deres codominant arv til påvisning af heterozygous genotyper2. Flere undersøgelser har brugt SSR markører til at undersøge genetiske mangfoldighed, spore herkomst, konstruere genetisk kobling maps og kortlægge gener for økonomisk vigtige træk3,4.
PCR produkter af SSR markører er almindeligvis adskilt ved hjælp af Agarosen eller polyacrylamid gel elektroforese og derefter visualiseres med sølv farvning eller under UV-lys efter farvning med ethidiumbromid. Sølv farvning af DNA fragmenter i polyacrylamidgeler er mere følsomme end de andre farvning metoder5,6 og har været meget anvendt til at påvise DNA fragmenter såsom SSR markører7.
Ligesom mange biologiske laboratoriemetoder, har sølv farvning af polyacrylamidgeler støt forbedret siden sin første blev rapporteret som et fragment visualisering teknik i 19798. Teknikken blev først ændret til påvisning af DNA-fragmenter af Bassam et al. 6 i 1991 og derefter forbedret af Sanguinetti og kolleger9 i 1994. Metoden har været yderligere optimeret i de sidste par årtier6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de fleste af disse opdaterede versioner af protokoller har dog stadig nogle ulemper såsom høje tekniske krav og lang behandlingstid for fiksering og montering6, at begrænse anvendelsen af disse protokoller7, 11. En optimal protokol, der kombinerer lave omkostninger med høj effektivitet af DNA fragment opdagelse er bydende nødvendigt for rutinemæssig anvendelse af sølvfarvning i biologiske forskning.
Derudover Polyacrylamiden kan opdeles i denaturering og ikke-denatureringen polyacrylamidgeler, og begge kan bruges til påvisning af SSR markører ved hjælp af sølvfarvning metode. Effekt og opløsning som afviger ikke væsentligt, men ikke-denatureringen polyacrylamidgeler er lettere at processen og tage mindre tid16.
På grundlag af den tidligere forskning15er formålet med den aktuelle undersøgelse at beskrive en optimeret sølvfarvning protokollen detaljeret til hurtig, nem og billig påvisning af SSR markører i et ikke-denatureringen polyacrylamid gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af PCR produkter af SSR markører
- Forberede alle kemikalier og reagenser til PCR-reaktionerne, herunder skabelon DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (indeholdende 2 × PCR buffer, 0,4 mM for hver dNTP, 3 mM i MgCl2, 0,1 U/µL af Taq DNA polymerase og farvestoffer), 10 µM hver frem og bak primere , og destilleret eller deioniseret vand (dH2O).
Bemærk: SSR markører, der anvendes i den foreliggende undersøgelse blev PT51333 (videresende primer sekvens: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' og omvendt primer sekvens: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') og PT50903 (videresende primer sekvens: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' og vende primer sekvens: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') for tobak og CX-43 (videresende primer sekvens: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' og vende primer sekvens: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') og CX-157 (videresende primer sekvens: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' og vende primer sekvens: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') til blomstrende kinakål. - Forberede forstærkning 10 µL PCR mix ved at tilføje 2 µL af skabelon DNA, 5 µL af 2 × PCR master mix, 0,2 µL af hver fremad primer og omvendt primer og 2,6 µL af dH2O.
- Udføre PCR forstærkning reaktion i en thermocycler med et indledende skridt 94 ° c i 5 min, komme efter af 38 cyklusser af 45 s på 94 ° C denaturering, 45 s på 55 ° C for primer udglødning og 1 min. ved 72 ° C i forlængelse, og en sidste udvidelse trin i 10 min. ved 72 ° C; derefter gemme PCR produkter ved 4 ° C til senere brug.
2. forberedelse af løsninger til polyacrylamid geler Casting
- Forberede 1 L, 5 × TBE buffer ved at opløse 54 g Tris base og 27,5 g borsyre i dH2O, tilføjer 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) og justere løsningen på en endelige rumfang på 1 000 mL med dH2O.
Bemærk: TBE buffer kan opbevares ved stuetemperatur i måneder. - Forbered 2 L 0,5 × TBE buffer ved at tilføje 200 mL 5 × TBE buffer til dH2O til en endelige mængden af 2 L, og opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede en 6% ikke-denatureringen polyacrylamid gelopløsning ved at opløse 29 g af molekylær biologi klasse acrylamid og 1 g af molekylær biologi klasse N, N'-methylenebisacrylamide i 0,5 × TBE buffer til en endelige mængden af 500 mL. Dække løsning flasken med aluminiumfolie og opbevares ved 4 ° C til senere brug.
Forsigtig: Acrylamid betragtes som en potent nervegift og skal håndteres med omhu. Altid bære handsker når vejer pulver og håndtering løsninger, der indeholder det. - Forberede en 20% ammonium persulfat (APS) løsning ved at opløse 2 g af APS med dH2O til en endelige mængden af 10 mL. Det kan opbevares ved-20 ° C for måneder.
Bemærk: For bekvemmelighed, 10 mL af 20% APS løsning kan aliquoted i 1,5 mL eller 2 mL centrifugeglas for opbevaring ved-20 ° C. Tø og blandes grundigt inden brug. - Forberede en fortyndet binde-silan løsning ved at opløse 3 µL af binde-silan i 0.997 mL 95% ethanol indeholdende 0,5% eddikesyre. Det kan opbevares ved 4 ° C for uger.
Forsigtig: Binde-silane er giftige, brug handsker når du håndterer løsningen og holde rummet ventileret.
3. fremstilling af polyacrylamidgeler til elektroforese
- Vask et sæt glasplader og afstandsstykker med vaskemiddel i vand fra hanen, efterfulgt af en komplet skylning med dH2O. luft tørre pladerne ved at sætte dem i en plade, tørrestativ.
- Sprede 1 mL af binde-silan løsning på den indvendige side af en rektangulær glasplade, og tørre i 5 min.
Bemærk: Hvis den binde-silan løsning ikke er spredt ensartet på overfladen af pladen, kan gelen være udskilt under farvning og resultere i en utilfredsstillende farvning effekt. - Sprede 1 mL af frastøde silan på den indvendige flade af en indskåret glasplade med en vatpind, aftørre overskydende frastøde-silan med silkepapir og lufttørre i 5 min.
Bemærk: Hvis frastøde-silan ikke pels overfladen af glasplade ensartet, kan det beskadige gel af delvist stripping. - Samle glasplader med afstandsstykker med hakket plade på toppen og klemme begge sider af forsamlingen med støbning klemmer.
- Hæld passende mængde (40 mL) af 6% ikke-denatureringen polyacrylamid gelopløsning til et bægerglas til 33 cm bredde × 10 cm højde og spacer tykkelse 1,5 mm plade sæt, tilsæt 20 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) og 200 µLfresh 20% APS og bland forsigtigt.
Bemærk: Den passende mængde (40 mL) gelopløsning blev beregnet fra det indvendige volumen af de to plader med en tykkelse af afstandsstykker (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm). Med hensyn til mængden af TEMED og APS for gel polymerisering er der en standard ratio af gelopløsning til TEMED og APS baseret på reference17. Gelopløsning ovenfor beskrevne opbevares ved 4° C. Hvis gelopløsning opbevares ved stuetemperatur, 20 µL af TEMED og 100 µL af 20% APS bør anvendes. Forsigtigt Rør blandingen af gelopløsning med et glas stick til at undgå luftbobler i løsningen. - Hæld opløsningen øjeblikkeligt og omhyggeligt til de forsamlede glasplader langs kanten af den hak plade, udfylde plads næsten til toppen, og Indsæt kammen. Tilføje en lille mængde af gelopløsning over kammen.
Bemærk: Hold glasplader vandrette at forhindre gel fra utætte. Fjerne eventuelle bobler med en boble krog, hvis nødvendigt. - Tillad gel til at sætte i 30 min. ved stuetemperatur.
NOTE: Tid til polymerisering kan ændre med temperaturer på gelopløsning og miljø. - Når gelen er fuldt polymerisering, fjerne støbning klemmerne og placere plade sæt i elektroforese tank enhed med hakket plade vender mod den øverste buffer reservoir, og bruge store klemmer til at fastgøre pladen til tank enheden.
- Hæld 1 liter 0,5 × TBE buffer ind i hver af øvre og de nedre kamre. Fjern kammen og skyl alle brøndene grundigt med buffer ved hjælp af en pipette eller sprøjte.
Bemærk: Sikre at gel sandwichen i bunden af pladen er helt gennemblødt i buffer uden nogen bobler.
4. løb geler
- Læg ca. 1 µL PCR produkt i hver brønd af Polyacrylamiden. Indlæse en DNA størrelse stigen til begge sider af gel sammen med prøver af PCR-produkter. Fix sikkerhed dækning til den øverste buffer afdeling.
- Tilslut afledningerne til strømforsyning, matcher den farvekodede rød til rød og sort til sort. Kør gelen ved en konstant spænding på 110 V, indtil farvestoffet når en defineret holdning, normalt for ~ 70 min.
Bemærk: Spænding og løb tiden kan justeres efter størrelsen af PCR-produkter.
5. sølvfarvning til påvisning SSR markører i et ikke-polyacrylamid Gel
- Efter elektroforese, dræne buffer fra den øverste kammer i et stort baegerglas via ventilen. Frigøre side klemmer, fjerne pladerne fra apparatet, omhyggeligt adskille indskåret glasplade langs den ene side med en spatel, og sørg for at de gel forbliver fastgjort til de andre glasplade belagt med binde silan.
- Gøre 1 L af frisk imprægnering løsning ved at opløse 1,5 g af AgNO3 i 1 L dH2O. forberede 1 L af frisk udvikling løsning ved at opløse 10 g NaOH i 900 mL af dH2O, tilsættes 1 mL af 37% formaldehyd , og tilpasse sig en endelige volumen på 1 L med dH2O.
Bemærk: Brug handsker og håndtere ovenstående kemikalier og løsninger med omhu. Det er ikke nødvendigt at holde løsninger og tilsvarende skridt med løsninger i mørke. - Omhyggeligt skyl gel og glas plade med rigelig dH2O at fjerne elektroforese buffer, så pladen anbringes med gel vender mod en plastik bakke og dykke gel i 1 L, imprægnering løsning. Sætte bakken på en shaker.
- Ryst bakken forsigtigt 60 r/min. for 3-4 min.
Bemærk: Ryster tid kan reguleres efter gel tykkelse og koncentration af sølvnitrat i opløsningen imprægnering. - Flytte pladen ud af imprægnering løsning og sætte det på en anden skuffe. Skyl den resterende imprægnering løsning ud fra overfladen af pladen og gel ved hjælp af rigelig dH2O to gange for 3-5 s.
- Pladen anbringes med gel vender mod en anden bakke, dykke plade i 1 L i udvikling løsning, så Ryst bakken forsigtigt på 50 omdrejninger i ~ 3 min. skærm udseendet af DNA fragmenter og stoppe udviklingen, når det højeste forholdet mellem signalet fra DNA fragmenter støj i baggrunden er observeret (dette trin tager ~ 3 min).
- Skyl pladen og gel med rigelig dH2O to gange, og tørre gelpladen med en silkepapir.
- Skan gel ved hjælp af en passende scanner. En opløsning på 300 dpi giver en klar visualisering af DNA-fragmenter. Gelen kan også blive fotograferet ved hjælp af et kamera.
- Banding mønster af SSR markører kan blive scoret baseret på DNA-fragmenter i billedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR-amplikoner blev produceret ved hjælp af de tilsvarende SSR primer par i blomstrende kinakål og tobak. Efter elektroforese, var polyacrylamidgeler farves ved hjælp af den ovenstående sølvfarvning protokol, der utvetydigt opdaget banding mønstre af SSR markører (figur 1).
For at sammenligne forskellige sølvfarvning protokoller opdagelse effektivitet, PCR produkter af SSR markører i tobak og blomstrende kinakål blev adskilt ved hjælp af polyacrylamid gelelektroforese og visualiseres ved hjælp af fem offentliggjorte sølv farvning protokoller9,11,12,13,14 , og den nye protokol. Alle seks protokoller opdaget SSR banding mønstre for tobak og blomstring kinakål genotyper (figur 2), men denne protokol havde den laveste baggrundsstøj og højeste kontrast af DNA fragmenter, således at det produceret den højeste billede klarhed for entydig screening af SSR polymorfier. Køretid og antallet af de vigtigste skridt og reagenser, der anvendes til at fuldføre sølvfarvning proces er angivet i tabel 1 for hver protokol, den nye protokol tager mindst tid og kræver færre kemiske reagenser og behandle trin.
Figur 3 viser følsomheden af protokollen, som målt ved 50-2.000 bp DNA markør på en ikke-denatureringen polyacrylamid gel.
Figur 1: påvisning af SSR banding mønstre. Påvisning af SSR banding mønstre for genotyper af blomstrende kinakål (A) og tobak (B) ved hjælp af den nye sølv farvning protokol. PCR produkter var adskilt på 6% ikke-denatureringen polyacrylamidgeler og farves ifølge den ovenfor rapporterede sølvfarvning protokol. Lane Møller er DNA størrelse markør, baner 1 til 62 repræsenterer amplikoner af 62 genotyper forstærkes af SSR primer par af "CX-157" (sekvenser af forward og reverse primere er 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' og 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', henholdsvis) i blomstring kinesisk kål (figur 1A) og "PT51333" (sekvenser af forward og reverse primere er 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' og 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', henholdsvis) tobak (figur 1B). Pilene peger på SSR målzoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sammenligning af opdagelse effektivitet for SSR markører i tobak og blomstrende kinakål genotyper ved hjælp af forskellige sølvfarvning protokoller. PCR produkter var adskilt i 6% af ikke-denatureringen polyacrylamidgeler og farves bruger fem offentliggjort sølv farvning protokoller9,11,12,13,14 , og den nye protokol. Lane Møller er DNA størrelse markør. Baner 1 til 4 repræsenterer amplikoner SSR primere af "PT50903" (sekvenser af forward og reverse primere er 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'og 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', henholdsvis) i fire tobak genotyper; baner 5 til 8 angiver amplikoner SSR primere af "CX-43" (sekvenser af forward og reverse primere er 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'og 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3', henholdsvis) i fire blomstrende kinakål genotyper. SSR målzoner er angivet med pile. Dette tal er blevet ændret fra figur 2 af Liu mfl. 8 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: følsomhed i protokollen som målt ved 50-2000 bp DNA markør på en ikke-denatureringen Polyacrylamiden. Den første lane var læsset med 1µL af DNA markør med fragment størrelser af 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 og 2000 bp, hver på 10 ng/µL. De resterende prøver blev indlæst med en 1:2 seriel fortynding i foregående baner. Den påviselige minimumsbeløb for protokollen var 9,8 pg i 11th lane (2,2 pg/mm2 i en 4.5 mm2 godt). Dette tal er blevet ændret fra figur 1 af Liu et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Varen | Sanguinetti et al. 9 | Qu et al. 11 | En et al. 12 | Byun et al. 13 | Kumar et al. 14 | Ny protokol |
| Køretid (min) | 30 | 12-25 | 8-9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| Antal trin | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Antallet af reagenser | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabel 1: Kører tid, antal vigtige skridt og reagenser, der anvendes i de forskellige sølvfarvning protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vask af gel efter imprægnering er et kritisk skridt. Utilstrækkelig vask tid og vand volumen kan forårsage ufuldstændig fjernelse af imprægnering løsning på overfladen af pladen og gelen, og resultere i en mørk baggrund. Den passende udvikling tid er et andet vigtigt skridt, over-udvikling kan resultere i en mørkebrun baggrund med lav kontrast billede af DNA-fragmenter. Derudover påvirker trinnet imprægnering væsentligt farvning effektivitet af DNA-fragmenter. Selv om udvide imprægnering tid over 5 min eller forhøjelse af AgNO3 i opløsningen imprægnering ikke væsentligt forbedrer farvning kvalitet, en reduktion af imprægnering tid til mindre end 3 min. eller mindske mængden af AgNO ()3 < 1 g) kan resultere i grå eller lavvandede sort DNA fragmenter.
En hurtig og nem betjening for effektiv DNA påvisning er ønskeligt for en sølvfarvning metode. Den nye protokol udviklet i denne undersøgelse undgår fastsættelse, standsning og flere vask trin beskrevet i andre protokoller6,9,10,11,12,13 , 14 uden at påvirke den farvning kvalitet (figur 1 & figur 2), og kræver kun to enkle trin af imprægnering og udvikling, som tager 7 min. Derfor, den nye protokol er hurtigere end alle de andre farvning protokoller nuværende findes6,7,9,10,11,12, 13,14. Desuden kræver den nye protokol kun tre kemikalier, dvs. AgNO3, formaldehyd og NaOH, på lignende beløb som bruges i andre protokoller6,7,9,10,11,12, 13,14, derfor, den nye protokol er mere økonomisk og genererer mindre kemiske farer, som ikke kun reducerer den kemiske omkostninger men også minimerer farlige materialehåndtering processen med ekstra kemikalier i den laboratorium.
Den nye protokol udarbejdet klare billeder med lav baggrundsstøj til entydig påvisning af SSR banding mønstre i tobak og blomstring kinakål genotyper (figur 1). Sammenlignet med andre protokoller, produceret den nye protokol de bedste farvning effekt med den laveste baggrundsstøj og højeste billedkontrast (figur 2). På vifte af 50-500 bp, følsomheden af den nye protokol til registrering af DNA var mindre end 19,5 pg/µL (4,3 pg / mm2) med en minimum koncentration om 9,8 pg/µL (2,2 pg/mm2) (figur 3), som er højere end rapporteret i andre protokoller 7 , 12 , 13.
Selvom fluorescens-mærkning teknologier kan give høj overførselshastighed og opløsning påvisning af DNA amplikoner, kræver de specialudstyr og dyrere reagenser, der ikke muligvis er tilgængelige for mange biologiske laboratorier, især dem i udviklingslandene. Den nye farvning protokol er enkel og hurtigt, kan skærmen ~ 800 DNA prøver pr. person om dagen, dermed, er en god mulighed for disse laboratorier til at udføre rutinemæssige forskning.
Til sidst, den nye protokol udviklet i denne undersøgelse er hurtigere at processen, nemmere at implementere, billigere, og bruger kun tre reagenser — uden at kompromittere påvisning virkning eller billede klarhed — end alle andre eksisterende sølvfarvning teknik. Den nye sølvfarvning protokol har været anvendt med succes i tobak og blomstrende kinakål forskning og kan være et værdifuldt redskab for vellykket SSR genotypebestemmelse i andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), Provincial nøglen International kooperativ forskning Platform og den store videnskabelige forskning projekt af Guangdong videregående uddannelse (2015KGJHZ015), videnskab og Teknologi Plan af Guangdong tobak monopol Administration (201403, 201705), videnskab og teknologi Plan af Guangdong Kina (2016B020201001), den nationale Innovation uddannelsesprojekt for studerende (201711078001). Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af den US Department of Agriculture. USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
