Summary
यहां, हम रिपोर्ट एक सरल और कम लागत वाली रजत दाग प्रोटोकॉल है जो केवल तीन एजेंट और प्रसंस्करण के 7 मिनट की आवश्यकता है, और आनुवंशिक विश्लेषण में उच्च गुणवत्ता एसएसआर डेटा की तेजी से पीढ़ी के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
सरल अनुक्रम दोहराने (एसएसआर) सबसे प्रभावी संयंत्र और पशु आनुवंशिक अनुसंधान और आणविक प्रजनन कार्यक्रमों में इस्तेमाल मार्करों में से एक है । चांदी धुंधला एक polyacrylamide जेल में एसएसआर मार्करों का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, चांदी धुंधला के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से मांग कर रहे है और समय लेने वाली । कई अंय जैविक प्रयोगशाला तकनीक की तरह, चांदी के दाग प्रोटोकॉल तेजी से पता लगाने की क्षमता में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया गया है । यहां, हम एक सरलीकृत चांदी धुंधला विधि है कि काफी एजेंट लागत कम कर देता है और पता लगाने के संकल्प और चित्र स्पष्टता को बढ़ाता है की रिपोर्ट । नई विधि दो प्रमुख कदम (गर्भवती और विकास) और तीन रिएजेंट (सिल्वर नाइट्रेट, सोडियम हीड्राकसीड, और formaldehyde), और एक गैर-denaturing polyacrylamide जेल के लिए प्रसंस्करण के केवल 7 मिनट की आवश्यकता है । पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल की तुलना में, इस नई विधि आसान है, जल्दी है और एसएसआर का पता लगाने के लिए कम रासायनिक एजेंट का उपयोग करता है । इसलिए, यह सरल, कम लागत, और प्रभावी चांदी दाग प्रोटोकॉल आनुवंशिक मानचित्रण और मार्कर एसएसआर मार्कर डेटा की एक त्वरित पीढ़ी द्वारा प्रजनन सहायता लाभ होगा ।
Introduction
पीसीआर के विकास आधारित मार्करों संयंत्र आनुवंशिकी और प्रजनन1के विज्ञान में क्रांति आई है । सरल अनुक्रम दोहराने (एसएसआर) मार्करों सबसे अधिक इस्तेमाल किया और सबसे बहुमुखी डीएनए मार्करों में से हैं । उनके व्यापक जीनोम कवरेज, बहुतायत, जीनोम विशिष्टता, और दोहराव heterozygous पादी2का पता लगाने के लिए उनके codominant विरासत के अलावा एसएसआर मार्करों के गुण में से कुछ हैं । कई अध्ययनों एसएसआर मार्करों का इस्तेमाल किया है आनुवंशिक विविधता की जांच, पैतृक ट्रैक, आनुवंशिक संपर्क नक्शे का निर्माण, और आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण लक्षण3,4के लिए नक्शे जीन ।
एसएसआर मार्करों के पीसीआर उत्पादों सामांयतः agarose या polyacrylamide जेल ट्रो का उपयोग कर अलग कर रहे है और फिर चांदी के साथ धुंधला या यूवी प्रकाश के तहत ethidium ब्रोमाइड के साथ धुंधला के बाद visualized । polyacrylamide जैल में डीएनए टुकड़े की चांदी धुंधला अंय धुंधला विधि5,6 से अधिक संवेदनशील है और व्यापक रूप से इस तरह के एसएसआर मार्करों7के रूप में डीएनए टुकड़े का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
कई जैविक प्रयोगशाला तकनीक की तरह, polyacrylamide जैल की चांदी धुंधला तेजी से अपनी पहली १९७९8में एक टुकड़ा दृश्य तकनीक के रूप में सूचित किया जा रहा है के बाद से सुधार हुआ है । तकनीक Bassam एट अल द्वारा डीएनए टुकड़े का पता लगाने के लिए शुरू में संशोधित किया गया था । 6 में १९९१ और फिर १९९४ में Sanguinetti और सहकर्मियों9 द्वारा सुधार । विधि आगे पिछले कुछ दशकों में अनुकूलित किया गया है6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. हालांकि, इन प्रोटोकॉल के अद्यतन संस्करण के अधिकांश अभी भी उच्च तकनीकी मांग और निर्धारण के लिए लंबी संसाधन समय और6बढ़ते, कि इन प्रोटोकॉल7के आवेदन की सीमा के रूप में कुछ कमियां है, 11. डीएनए टुकड़ा का पता लगाने की उच्च दक्षता के साथ कम लागत को जोड़ती है कि एक इष्टतम प्रोटोकॉल तत्काल जैविक अनुसंधान में चांदी के दाग के नियमित आवेदन के लिए आवश्यक है ।
इसके अलावा, polyacrylamide जेल denaturing और गैर denaturing polyacrylamide जैल में विभाजित किया जा सकता है, और दोनों चांदी धुंधला विधि का उपयोग एसएसआर मार्करों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रभाव और संकल्प है जो काफी अलग नहीं है, लेकिन गैर denaturing polyacrylamide जैल प्रक्रिया करने के लिए आसान कर रहे हैं और कम समय लेने के लिए16.
पिछले अनुसंधान के आधार पर15, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक गैर denaturing polyacrylamide जेल में एसएसआर मार्करों के त्वरित, आसान और कम लागत का पता लगाने के लिए विस्तार से एक अनुकूलित चांदी दाग प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
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Protocol
1. एसएसआर मार्कर्स के पीसीआर प्रॉडक्ट्स की तैयारी
- सभी रसायनों और पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए रिएजेंट तैयार टेंपलेट डीएनए सहित (30 एनजी/µ एल), 2 × पीसीआर मास्टर मिक्स (2 × पीसीआर बफर, प्रत्येक dNTP के ०.४ मिमी, MgCl के 3 मिमी, Taq डीएनए पोलीमरेज़ और रंजक के µ l/, 10 µ मीटर के प्रत्येक आगे और रिवर्स प्राइमरों के , और आसुत या जल (डीएच2O) ।
नोट: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त एसएसआर मार्कर PT51333 (फॉरवर्ड प्राइमरी सीक्वेंस: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3 ' और रिवर्स प्राइमरी सीक्वेंस: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') और PT50903 (फॉरवर्ड प्राइमरी सीक्वेंस: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 ' और तंबाकू के लिए रिवर्स प्राइमर अनुक्रम: 5 '-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 '), और CX-४३ (आगे प्राइमर अनुक्रम: 5 '-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 ' और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम: 5 '-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ') और CX-१५७ (आगे प्राइमरी अनुक्रम: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3 ') फूल चीनी गोभी के लिए । - प्रवर्धन के लिए पीसीआर मिक्स के 10 µ एल खाका डीएनए के 2 µ एल जोड़कर तैयार, 5 µ एल के 2 × पीसीआर मास्टर मिक्स, ०.२ µ एल के प्रत्येक फॉरवर्ड प्राइमरी और रिवर्स प्राइमर और २.६ µ एल के डीएच2ओ ।
- एक thermocycler में पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया 5 मिनट के लिए ९४ ° c के एक प्रारंभिक चरण के साथ प्रदर्शन, ४५ एस के ३८ चक्र के लिए ९४ ° c पर विकार, ४५ एस के लिए प्राइमरी एनीलिंग और 1 मिनट में ५५ डिग्री सेल्सियस पर विस्तार के लिए, और 10 मिनट के एक अंतिम विस्तार कदम पर ७२ ° सी; फिर बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पादों की दुकान ।
2. Polyacrylamide जैल कास्टिंग के लिए समाधान की तैयारी
- Tris आधार और २७.५ जी बोरिक एसिड की डीएच2o में ५४ g को भंग करके 5 × TBE बफर के 1 एल तैयार करें, ०.५ एम EDTA (पीएच ८.०) के 20 मिलीलीटर जोड़ने और 1, 000 एमएल के डीएच के साथ एक अंतिम मात्रा के समाधान के लिए समायोजन2हे ।
नोट: TBE बफर महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । - 2 एल की एक अंतिम मात्रा करने के लिए डीएच करने के लिए 5 × TBE बफर के २०० मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा ०.५ × TBE बफर के 2 l तैयार, और कमरे के तापमान पर स्टोर ।
- आणविक जीवविज्ञान ग्रेड acrylamide के 29 जी भंग करके एक 6% गैर denaturing polyacrylamide जेल समाधान तैयार करने और आणविक जीवविज्ञान ग्रेड एन के 1 जी, N'-methylenebisacrylamide में ०.५ × TBE बफर ५०० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए । एल्यूमीनियम पंनी और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के साथ समाधान बोतल कवर ।
चेतावनी: Acrylamide एक शक्तिशाली neurotoxin माना जाता है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । हमेशा दस्ताने पहनते है जब पाउडर वजनी और समाधान है कि यह शामिल हैंडलिंग । - 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए डीएच2O के साथ ए पी एस के 2 जी भंग करके एक 20% अमोनियम persulfate (एपीएस) समाधान तैयार करें । यह महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
नोट: सुविधा के लिए, 20% अनुप समाधान के 10 मिलीलीटर १.५ मिलीलीटर में aliquoted जा सकता है या-20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए केंद्रापसारक ट्यूबों के 2 मिलीलीटर । गल और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण । - एसिटिक अम्ल के ०.५% युक्त ९५% इथेनॉल के ०.९९७ मिलीलीटर में बाँध-silane के 3 µ l को भंग करके एक पतला बाँध-silane समाधान तैयार करें । यह सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
चेतावनी: बांध-silane विषाक्त है, जब समाधान हैंडलिंग और कमरे हवादार रखने के दस्ताने पहनते हैं ।
3. ट्रो के लिए Polyacrylamide जैल की तैयारी
- नल के पानी में डिटर्जेंट के साथ ग्लास प्लेटें और स्पेसर के एक सेट धोने, डीएच के साथ एक पूरा धोने के बाद2ओ हवा एक थाली सुखाने रैक में उंहें स्थापित करके प्लेटें सूखी ।
- एक आयताकार कांच की थाली के भीतरी सतह पर बांध-silane समाधान के 1 मिलीलीटर फैलाने, और 5 मिनट के लिए सूखी ।
नोट: यदि बाइंड-silane समाधान प्लेट की सतह पर समान रूप से फैल नहीं है, जेल धुंधला और एक असंतोषजनक दाग प्रभाव में परिणाम के दौरान अलग किया जा सकता है । - घृणा उत्पंन करने के 1 मिलीलीटर-silane एक झाड़ू के साथ एक पायदान वाले ग्लास प्लेट की भीतरी सतह पर, बंद हटाना अधिक घृणा उत्पंन करना-ऊतक कागज के साथ silane, और 5 मिनट के लिए शुष्क हवा ।
नोट: यदि पीछे हटाना-silane कांच की थाली की सतह समान रूप से कोट नहीं है, यह आंशिक रूप से अलग करना द्वारा जेल नुकसान हो सकता है । - शीर्ष पर पायदान पर प्लेट के साथ स्पेसर के साथ ग्लास प्लेटें इकट्ठा, और कास्टिंग clamps के साथ विधानसभा के दोनों पक्षों दबाना ।
- उचित राशि डालो (४० एमएल) की 6% गैर denaturing polyacrylamide जेल समाधान की थाली सेट के लिए एक चोंच ३३ सेमी चौड़ाई × 10 सेमी ऊंचाई और स्पेसर की मोटाई १.५ mm, tetramethylethylenediamine के 20 µ एल जोड़ने (TEMED) और २०० µ lfresh 20% ए पी एस और धीरे मिश्रण ।
नोट: उचित मात्रा (४० एमएल) जेल समाधान की एक मोटाई स्पेसर्स (30 cm × ८.५ cm × ०.१५ cm) के साथ दो प्लेटों की भीतरी मात्रा से गणना की गई थी । जेल बहुलकीकरण के लिए TEMED और एपीएस की राशि के लिए के रूप में, वहाँ संदर्भ के आधार पर TEMED और एपीएस के लिए जेल समाधान का एक मानक अनुपात है17. जेल समाधान ऊपर वर्णित 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है । यदि जेल समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जाता है, 20 µ एल के TEMED और १०० µ एल के 20% एपीएस का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । धीरे समाधान में हवा बुलबुले से बचने के लिए एक गिलास छड़ी के साथ जेल समाधान के मिश्रण हलचल । - तुरंत समाधान डालो और निशाना प्लेट के किनारे के साथ इकट्ठे हुए ग्लास प्लेटों में ध्यान से, शीर्ष करने के लिए लगभग अंतरिक्ष को भरने, और कंघी डालें । कंघी पर जेल समाधान की एक छोटी मात्रा में जोड़ें ।
नोट: जेल को लीक होने से रोकने के लिए कांच की प्लेटों को क्षैतिज रखें । यदि आवश्यक हो, एक बुलबुला हुक के साथ किसी भी बुलबुले निकालें । - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेट करने के लिए जेल की अनुमति दें ।
नोट: बहुलकीकरण के लिए समय जेल समाधान और पर्यावरण के तापमान के साथ बदल सकते हैं । - जेल पूरी तरह से बहुलकीकरण है के बाद, कास्टिंग clamps निकालें और पायदान प्लेट ऊपरी बफर जलाशय की ओर का सामना करना पड़ के साथ ट्रो टैंक इकाई में सेट की स्थिति, और टैंक इकाई के लिए सेट प्लेट संलग्न करने के लिए बड़े clamps का उपयोग करें ।
- एक ऊपरी और निचले मंडलों में से प्रत्येक में ०.५ × TBE बफर के 1 एल डालो । कंघी निकालें और एक पिपेट या सिरिंज का उपयोग कर बफर के साथ अच्छी तरह से सभी कुओं फ्लश ।
नोट: सुनिश्चित करें कि थाली के तल पर जेल सैंडविच पूरी तरह से किसी भी बुलबुले के बिना बफर में लथपथ है ।
4. चल जैल
- polyacrylamide जेल के प्रत्येक कुआं में पीसीआर उत्पाद के बारे में 1 µ एल लोड । पीसीआर उत्पादों के नमूनों के साथ साथ जेल के दोनों किनारों के लिए एक डीएनए आकार सीढ़ी लोड । ऊपरी बफ़र कक्ष के लिए सुरक्षा कवर को ठीक करें ।
- बिजली की आपूर्ति करने के लिए सुराग कनेक्ट, लाल और काले रंग के लिए काला करने के लिए लाल कोडित रेड मिलान. ११० वी की एक निरंतर वोल्टेज पर जेल भागो जब तक डाई एक परिभाषित स्थिति है, आम तौर पर ~ ७० मिनट के लिए पहुंचता है ।
नोट: वोल्टेज और रनिंग समय पीसीआर उत्पादों के आकार के अनुसार समायोजित किया जा सकता है ।
5. एक गैर Polyacrylamide जेल में एसएसआर मार्करों का पता लगाने के लिए चांदी धुंधला
- ट्रो के बाद, ऊपरी चैम्बर से वाल्व के माध्यम से एक बड़े चोंच में बफर नाली । पक्ष clamps अलग, उपकरण से प्लेटों को हटाने के लिए, ध्यान से एक रंग के साथ एक तरफ के साथ पायदान वाले कांच की थाली अलग, और यकीन है कि जेल अन्य गिलास बांध silane के साथ लेपित प्लेट से जुड़ा रहता है बनाते हैं ।
- भंग करके ताजा गर्भवती समाधान के 1 एल बनाओ १.५ के AgNO3 में से 1 एल में डीएच2ओ. के 1 l को भंग करके ताजा विकास समाधान के 10 ग्राम को डीएच2ओ के ९०० मिलीलीटर में डालकर तैयार करें, ३७% formaldehyde की 1 मिलीलीटर जोड़ें , और 1 एल के एक अंतिम खंड को समायोजित डीएच2O का उपयोग कर ।
नोट: दस्ताने पहनें और देखभाल के साथ ऊपर रसायनों और समाधान संभाल । यह समाधान और अंधेरे में समाधान के साथ इसी कदम रखने के लिए आवश्यक नहीं है । - ध्यान से ट्रो बफर को दूर करने के लिए पर्याप्त डीएच2O के साथ जेल और ग्लास प्लेट कुल्ला, तो एक प्लास्टिक की ट्रे पर का सामना करना पड़ जेल के साथ थाली जगह है और 1 में जेल को जलमग्न समाधान के एल । एक शेखर पर ट्रे रखो ।
- ६० आर/मिनट के लिए 3-4 मिनट में ट्रे धीरे शेक ।
नोट: मिलाते समय जेल की मोटाई और गर्भवती समाधान में चांदी नाइट्रेट की एकाग्रता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । - गर्भवती समाधान की थाली बाहर ले जाएं और एक और ट्रे पर डाल दिया । अवशिष्ट गर्भवती समाधान थाली की सतह से दूर और पर्याप्त डीएच2O 3-5 s प्रत्येक के लिए दो बार का उपयोग कर जेल कुल्ला ।
- एक और ट्रे पर का सामना करना पड़ जेल के साथ प्लेट प्लेस, विकास के समाधान के 1 एल में थाली जलमग्न, तो ५० आर में धीरे ट्रे हिला/~ 3 मिनट के लिए/डीएनए टुकड़े की उपस्थिति की निगरानी और विकास बंद करो जब डीएनए टुकड़े के संकेत के उच्चतम अनुपात पृष्ठभूमि के शोर करने के लिए मनाया जाता है (इस कदम ~ 3 मिनट लेता है).
- प्लेट कुल्ला और पर्याप्त डीएच के साथ जेल2हे दो बार, और एक ऊतक कागज के साथ जेल प्लेट सूखी ।
- एक उपयुक्त स्कैनर का उपयोग कर जेल स्कैन । ३०० dpi का एक समाधान डीएनए अंशों का एक स्पष्ट दृश्य देता है । जेल में भी कैमरे का इस्तेमाल कर फोटो ली जा सकती है ।
- एसएसआर मार्कर के बैंडिंग पैटर्न छवि में डीएनए टुकड़े के आधार पर बनाए जा सकते हैं ।
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Representative Results
पीसीआर amplicons फूल चीनी गोभी और तंबाकू में इसी एसएसआर प्राइमर जोड़े का उपयोग कर उत्पादित किया गया । ट्रो के बाद, polyacrylamide जैल ऊपर रजत दाग प्रोटोकॉल है, जो स्पष्ट रूप से एसएसआर मार्करों के बैंडिंग पैटर्न का पता लगाया (चित्रा 1) का उपयोग दाग रहे थे ।
अलग चांदी धुंधला प्रोटोकॉल का पता लगाने दक्षता की तुलना करने के लिए, पीसीआर तंबाकू और फूल चीनी गोभी में एसएसआर मार्करों के उत्पादों polyacrylamide जेल ट्रो और पांच प्रकाशित चांदी धुंधला का उपयोग कर visualized का उपयोग कर अलग किया गया प्रोटोकॉल9,11,12,13,14 और नए प्रोटोकॉल । सभी छह प्रोटोकॉल का पता लगाया एसएसआर बैंडिंग पैटर्न तंबाकू और फूल चीनी गोभी पादी के लिए (चित्रा 2), लेकिन वर्तमान प्रोटोकॉल सबसे कम पृष्ठभूमि शोर और डीएनए टुकड़े के उच्चतम विपरीत था, इस तरह कि यह उच्चतम चित्र का उत्पादन एसएसआर बहुरूपताओं की अस्पष्ट स्क्रीनिंग के लिए स्पष्टता । चल रहे समय और मुख्य कदम और चांदी धुंधला प्रक्रिया को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया एजेंट की संख्या में सूचीबद्ध है तालिका 1 प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए, नया प्रोटोकॉल कम समय लेता है और कम रासायनिक एजेंट और प्रक्रिया चरणों की आवश्यकता है ।
चित्रा 3 एक गैर denaturing polyacrylamide जेल पर 50-2000 बीपी डीएनए मार्कर द्वारा मापा के रूप में प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता से पता चलता है.
चित्रा 1: एसएसआर बैंडिंग पैटर्न का पता लगाने. फूल चीनी गोभी के पादी के लिए एसएसआर बैंडिंग पैटर्न का पता लगाने (क) और तंबाकू (ख) नई रजत दाग प्रोटोकॉल का उपयोग कर । पीसीआर प्रॉडक्ट्स को 6% नॉन-denaturing polyacrylamide जैल पर अलग किया गया और ऊपर दी गई सिल्वर सना प्रोटोकॉल की रिपोर्ट के अनुसार दाग लगा । लेन एम डीएनए आकार मार्कर है, फि ल्म 1 से ६२ "CX-१५७" के एसएसआर प्राइमरी पेयर्स द्वारा प्रवर्धित ६२ पादी के amplicons का प्रतिनिधित्व करते हैं (आगे और रिवर्स प्राइमरों के जुगाड़ 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' और 5'-GGACAGCTTCACACATTTGC-3'हैं, क्रमशः) फूल चीनी गोभी (चित्रा 1a) और "PT51333" (आगे और रिवर्स प्राइमरों के अनुक्रम 5'-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' और 5'-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', क्रमशः कर रहे हैं) तंबाकू में (चित्र 1b) । तीर लक्ष्य एसएसआर बैंड को इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: तंबाकू और फूल चीनी गोभी पादी में एसएसआर मार्करों के लिए पता लगाने की क्षमता की तुलना अलग चांदी के दाग प्रोटोकॉल का उपयोग कर । पीसीआर उत्पादों गैर denaturing polyacrylamide जैल के 6% में अलग किया गया था और पांच प्रकाशित चांदी दाग प्रोटोकॉल का उपयोग कर दाग9,11,12,13,14 और नई प्रोटोकॉल. लेन एम डीएनए आकार मार्कर है । गलियाँ १ से ४ "PT50903" के एसएसआर प्राइमरों के amplicons का प्रतिनिधित्व करती हैं (आगे और रिवर्स प्राइमरों के जुगाड़ 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 ' और 5 '-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ' हैं, क्रमशः) चार सैकेंड पादी में; फि ल्म 5 से 8 ' CX-४३ ' के एसएसआर प्राइमरों के amplicons का संकेत (आगे और रिवर्स प्राइमरों का जुगाड़ 5 '-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 ' और 5 '-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ' है, क्रमशः) चार फूल वाली चीनी गोभी पादी में । लक्ष्य एसएसआर बैंड तीर के साथ संकेत दिया जाता है । इस आंकड़े को लियू एट अलके फिगर 2 से संशोधित किया गया है । 8 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता के रूप में एक गैर denaturing polyacrylamide जेल पर 50-2000 बीपी डीएनए मार्कर द्वारा मापा. पहली लेन डीएनए मार्कर के 1 µ l के साथ ५०, १००, २००, ३००, ४००, ५००, ६००, ७००, १०००, १५०० और २००० बीपी, प्रत्येक पर 10 एनजी/µ एल के टुकड़े आकार के साथ लोड किया गया था । शेष नमूने पूर्ववर्ती गलियों में 1:2 सीरियल कमजोर पड़ने के साथ लोड किए गए थे । प्रोटोकॉल के लिए ंयूनतम पता लगाने की राशि 11वें लेन में ९.८ स्नातकोत्तर (२.२ स्नातकोत्तर/एक ४.५ mm 2 में अच्छी तरह से 2 मिमी) था । इस आंकड़े को लियू एट अल का आंकड़ा 1 से संशोधित किया गया है । 8. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| आइटम | Sanguinetti एट अल. 9 | Qu एट अल. 11 | एक एट अल । 12 | Byun एट अल. 13 | कुमार एट अल. 14 | नया प्रोटोकॉल |
| रनिंग टाइम (min) | 30 | १२ – २५ | ८-९ | ९ – ३१ | ४२ | ६-७ |
| चरणों की संख्या | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| रिएजेंटों की संख्या | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
तालिका 1: समय चल रहा है, महत्वपूर्ण कदम की संख्या और अलग चांदी धुंधला प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट ।
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Discussion
गर्भवती होने के बाद जेल की धुलाई एक महत्वपूर्ण कदम है । अपर्याप्त धोने समय और पानी की मात्रा थाली और जेल की सतह पर गर्भवती समाधान के अधूरा हटाने का कारण हो सकता है, और एक अंधेरे पृष्ठभूमि में परिणाम । उपयुक्त विकासशील समय एक और महत्वपूर्ण कदम है, पर विकास के डीएनए के टुकड़े की कम विपरीत छवि के साथ एक गहरे भूरे रंग की पृष्ठभूमि में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, गर्भवती कदम काफी डीएनए टुकड़े की क्षमता धुंधला को प्रभावित करता है । हालांकि 5 मिनट या गर्भवती समाधान में AgNO3 राशि में वृद्धि पर गर्भवती समय का विस्तार काफी धुंधला गुणवत्ता में सुधार नहीं है, एक गर्भवती समय कम करने के लिए 3 मिनट या AgNO की मात्रा को कम करने के लिए3 ( < 1 g) धूसर या उथले काले डीएनए अंशों में परिणाम कर सकते हैं ।
कुशल डीएनए का पता लगाने के लिए एक त्वरित और आसान आपरेशन एक चांदी धुंधला विधि के लिए वांछनीय है । इस अध्ययन में विकसित नए प्रोटोकॉल फिक्सिंग, रोक और अंय प्रोटोकॉल में वर्णित कई वाशिंग कदम6,9,10,11,12,13 , 14 धुंधला गुणवत्ता को प्रभावित किए बिना (चित्रा 1 & चित्रा 2), और केवल गर्भवती और विकास के दो सरल कदम है कि 7 मिनट ले की आवश्यकता है । इसलिए, नए प्रोटोकॉल तेजी से सभी अंय धुंधला प्रोटोकॉल वर्तमान उपलब्ध है6,7,9,10,11,12, 13,14. इसके अलावा, नए प्रोटोकॉल केवल तीन रसायनों की आवश्यकता है, यानी AgNO3, formaldehyde, और NaOH, समान मात्रा में अंय प्रोटोकॉल में प्रयुक्त के रूप में6,7,9,10,11,12, 13,14, इसलिए, नए प्रोटोकॉल और अधिक किफायती है और कम रासायनिक खतरों है, जो न केवल रासायनिक लागत कम कर देता है उत्पंन करता है, लेकिन यह भी में अतिरिक्त रसायनों की खतरनाक सामग्री हैंडलिंग प्रक्रिया को कम करती है प्रयोगशाला.
नए प्रोटोकॉल तंबाकू और फूल चीनी गोभी पादी में एसएसआर बैंडिंग पैटर्न के अस्पष्ट का पता लगाने के लिए कम पृष्ठभूमि शोर के साथ स्पष्ट छवियों का उत्पादन (चित्रा 1) । अन्य प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, नए प्रोटोकॉल सबसे कम पृष्ठभूमि शोर और उच्चतम चित्र कंट्रास्ट (चित्रा 2) के साथ सर्वश्रेष्ठ धुंधला प्रभाव का उत्पादन किया । 50-500 बीपी की सीमा पर, डीएनए डिटेक्शन के लिए नए प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता १९.५ pg/µ l (४.३ स्नातकोत्तर/mm2) की न्यूनतम एकाग्रता के साथ ९.८ pg/µ l (२.२ स्नातकोत्तर/एमएम2) (चित्रा 3), जो अंय प्रोटोकॉल में रिपोर्ट की तुलना में अधिक है 7 , 12 , 13.
हालांकि प्रतिदीप्ति-लेबलिंग प्रौद्योगिकियों के डीएनए amplicons के उच्च प्रवाह और संकल्प का पता लगाने प्रदान कर सकते हैं, वे विशेष उपकरणों और अधिक महंगी रिएजेंट है कि कई जैविक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है की आवश्यकता है, विशेष रूप से उन विकासशील देशों में । नई धुंधला प्रोटोकॉल सरल और तेजी से है कि स्क्रीन कर सकते है ~ ८०० प्रति व्यक्ति प्रति दिन डीएनए नमूने, इस प्रकार, इन प्रयोगशालाओं के लिए एक अच्छा विकल्प के लिए नियमित अनुसंधान प्रदर्शन है ।
अंत में, नए इस अध्ययन में विकसित प्रोटोकॉल जल्दी प्रक्रिया है, को लागू करने के लिए आसान है, सस्ता है, और केवल पता लगाने के प्रभाव या चित्र स्पष्टता से समझौता किए बिना-अंय सभी मौजूदा चांदी धुंधला तकनीक से तीन एजेंट का उपयोग करता है । नई चांदी धुंधला प्रोटोकॉल तंबाकू और फूल चीनी गोभी अनुसंधान में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है और अंय प्रजातियों में सफल एसएसआर genotyping के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
यह काम गुआंग्डोंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (2015A030313500) द्वारा वित्त पोषित किया गया, प्रांतीय प्रमुख अंतरराष्ट्रीय सहकारी अनुसंधान मंच और गुआंग्डोंग उच्चतर शिक्षा (2015KGJHZ015) के प्रमुख वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना, विज्ञान और गुआंग्डोंग तंबाकू एकाधिकार प्रशासन की प्रौद्योगिकी योजना (२०१४०३, २०१७०५), गुआंग्डोंग चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2016B020201001), स्नातक छात्रों के लिए राष्ट्रीय नवाचार प्रशिक्षण परियोजना (२०१७११०७८००१) । इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए है और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या बेचान का संकेत नहीं है । USDA एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
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