Summary
Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.
Abstract
Basit dizi tekrar (SSR) bitki ve hayvan genetik araştırma ve moleküler ıslah programlarında kullanılan en etkili işaretleri biridir. Gümüş boyama SSR işaretleri polyacrylamide jel içinde tespiti için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ancak, gümüş boyama için geleneksel teknik olarak zor ve zaman alıcı iletişim kurallarıdır. Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, iletişim kuralları boyama gümüş sürekli algılama verimliliği artırmak için optimize edilmiştir. Burada, önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve algılama çözünürlük ve görüntü netliğini artırır yöntem boyama basitleştirilmiş bir gümüş raporu. Yeni yöntem için sigara denaturing polyacrylamide jel iki önemli adım (emprenye ve geliştirme) ve üç reaktifler (Gümüş nitrat, sodyum hidroksit ve formaldehit) ve sadece 7 dakika işleme gerektirir. Daha önce raporlanmış iletişim kurallarına göre bu yeni yöntem daha hızlı, daha kolaydır ve daha az kimyasal reaktifler SSR algılama için kullanır. Bu nedenle, bu basit, düşük maliyetli ve verimli gümüş Protokolü boyama genetik haritalama ve marker-yardım etmek üreme SSR işaretçisi veri hızlı bir nesil tarafından yararlanacaktır.
Introduction
PCR tabanlı işaretleri gelişimi bilim üreme1ve bitki genetik devrim yarattı. Basit sıralı tekrar (SSR) işaretleri arasında en sık kullanılan ve en çok yönlü DNA işaretlerine vardır. Onların geniş genom kapsamı, bereket, genom özgüllük ve tekrarlanabilirlik heterozigoz genotip2tespiti için ek olarak kendi codominant devralma SSR işaretleri yararları bazılarıdır. Çeşitli çalışmalarda SSR işaretleri genetik çeşitlilik araştırmak, soy izlemek, genetik bağlantı haritalar oluşturmak ve ekonomik açıdan önemli özellikleri3,4için gen eşlemek için kullandık.
PCR ürünleri SSR işaretleri kullanarak özel veya polyacrylamide Jel Elektroforez ve etidyum bromür ile boyama sonra gümüş boyama ile veya UV ışığı altında görüntülenir yaygın olarak ayrılır. Polyacrylamide jeller DNA parçalarının gümüş boyama diğer boyama yöntemleri5,'6 dan daha duyarlı ve yaygın olarak DNA parçalarının SSR işaretleri7gibi algılamak için kullanılan.
Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, gümüş polyacrylamide jeller boyama giderek onun ilk bir parçası görselleştirme teknik 19798' olarak rapor ediliyor beri geliştirdi. Teknik DNA parçalarının tespiti için başlangıçta Bassam vd tarafından güncellenmiştir 6 1991 ve 1994 yılında Sanguinetti ve iş arkadaşlarınızla9 tarafından geliştirilmiş. Yöntem daha son birkaç on yıl6,7,9,10,11,12,13,14 ' te optimize , 15. ancak, iletişim kurallarının Güncellenme Zamanı bu sürümleri çoğu hala bu protokolleri7uygulama sınırı, yüksek teknik talep ve uzun süre fiksasyon için işleme ve6, montaj gibi bazı dezavantajları var 11. DNA parçası algılama yüksek verimlilik ile düşük maliyetli birleştiren bir en iyi Protokolü acilen biyolojik araştırmada boyama gümüş rutin uygulama için gereklidir.
Buna ek olarak, polyacrylamide jel denaturing ve sigara denaturing polyacrylamide jeller bölünmüş olabilir ve her ikisi de gümüş boyama yöntemi kullanarak SSR işaretleri tespiti için kullanılabilir. Etkisi ve kararlılık-in hangi önemli ölçüde farklı değildir, ama sigara denaturing polyacrylamide jeller süreci daha kolay ve daha az zaman16almak.
Önceki araştırma15temel alınarak, geçerli çalışmanın amacı ayrıntılı SSR işaretleri bir sigara denaturing polyacrylamide jel içinde hızlı, kolay ve düşük maliyetli algılanması için protokol boyama en iyi duruma getirilmiş bir gümüş tarif etmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SSR işaretleri PCR ürünlerinin hazırlanması
- Tüm kimyasallar ve Kimyasalları şablon DNA içeren PCR reaksiyonları için hazırlamak (30 ng/µL), 2 × PCR ana mix (2 × PCR arabellek, her dNTP, 3 mM MgCl2, 0.1 U/µL Taq DNA polimeraz ve boyalar 0.4 mM içeren), her 10 µM ileriye ve geriye doğru astar ve distile veya deiyonize su (dH2O).
Not: mevcut çalışmada kullanılan SSR işaretleri PT51333 idi (ileri astar sıra: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' ve ters astar Sıralaması: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ve PT50903 (ileri astar sıra: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ve ters astar sıra: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') tütün ve CX-43 (ileri astar sıra: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' ve ters astar sıra: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') ve CX-157 (ileri astar sıra: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' ve ters astar sıra: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') için çiçekli Çin lahanası. - 2 µL şablonunun DNA, 2 × PCR ana karışımı, her ileri astar ve ters astar 0.2 µL ve dH2O. 2.6 µL 5 µL ekleyerek amplifikasyon için 10 µL PCR karışımı hazırlayın
- PCR güçlendirme tepki thermocycler 94 ° C 5 min için bir ilk adım ile gerçekleştirmek, 45 38 döngüsü tarafından takip için denatürasyon, 45 94 ° C'de s s astar tavlama için 55 ° c ve 1 dk. uzantılı 72 ° C'de ve son uzantısı adım 10 dk 72 ° C; o zaman PCR ürünleri daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
2. Polyacrylamide için çözümler hazırlanması döküm jelleri
- 5 × TBE tampon 1 L 54 g Tris temel ve 27,5 g Borik asit dH2O içinde eriterek, 20 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) ekleme ve çözüm için 1, 000 mL dH2O. son hacmi ayarlama hazırlayın
Not: TBE tampon oda sıcaklığında ay depolanabilir. - 0,5 × TBE tampon 2 L 200 mL 5 × TBE tampon dH2O 2 L son hacmiyle ekleyerek hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın.
- 29 g moleküler biyoloji sınıf Akrilamid ve moleküler biyoloji sınıf N, N 1 g çözülerek % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm hazır olun '-0,5 × TBE tampon son hacmiyle 500 mL methylenebisacrylamide. Alüminyum folyo ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de mağaza ile çözüm şişe kapağı.
Dikkat: Akrilamid güçlü bir nörotoksin kabul edilir ve dikkatle ele alınmalıdır. Her zaman ne zaman toz ve o içermek işleme çözümleri tartı eldiven. - Bir % 20 amonyum persülfat (APS) çözüm APS 2 g dH2O son hacmiyle 10 mL ile çözülerek hazırlayın. -20 ° C'de ay depolanabilir.
Not: kolaylık sağlamak için 10 mL % 20 APS çözeltisi 1,5 mL veya santrifüj tüpleri için depolama-20 ° C'de 2 mL bölünmemeli olabilir Çözülme ve de kullanmadan önce karıştırın. - Seyreltilmiş bağlama-silane çözüm bağlama-silane %0,5 Asetik asit içeren % 95 etanol 0.997 ml 3 µL çözülerek hazırlayın. Bu hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
Dikkat: Bind-silane zehirlidir, çözüm işlerken eldiven giymek ve havalandırılmış Oda tutmak.
3. hazırlanması Polyacrylamide Jel Elektroforez için
- Musluk suyu, bir tam dH2ile O. hava kuru plakaları raf kurutma bir tabak içinde ayarlayarak durulama tarafından takip bir dizi cam plakanın ve çubukları deterjan ile yıkayın.
- 1 mL bağlama-silane çözeltisi bir dikdörtgen cam levha ve 5 min için Kuru iç yüzeyine dağıtmak.
Not: bind-silane çözüm plaka yüzeyinde düzgün yaymamak jel boyama sırasında ayrılmış olarak ve tatmin edici bir boyama etkisi sonucunda. - Çentikli cam levha bir bez ile iç yüzeyine püskürtmek-silane 1 mL dağıtmak, aşırı püskürtmek-silane kağıt mendil ile yok etmek ve 5 min için kurutma.
Not: repel-silane cam levha yüzeyine eşit şekilde kat değil, jel kısmen sıyırma tarafından zarar verebilir. - Çentikli plakalı Paspayı ile cam plakanın üzerine montajı ve montaj kelepçeleri döküm ile her iki kelepçe.
- Uygun miktarda (40 mL) 33 cm genişlik × 10 cm yükseklik ve spacer kalınlığı 1.5 mm plaka kümesi için bir ölçek için % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm dökün, tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 µL ve 200 µLfresh %20 eklemek APS ve karışımı yavaşça.
Not: Uygun miktarda jel çözüm (40 mL) iki tabak iç birimden çubukları (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) kalınlığı ile hesaplanır. Jel polimerizasyon için TEMED ve APS miktarı gelince jel eriyik-e doğru TEMED ve başvuru17tarihinde dayalı APS standart bir oran vardır. Yukarıda açıklanan jel çözüm 4 ° C'de depolanan Jel çözüm oda sıcaklığında, TEMED 20 µL ve APS kullanılması gereken % 20 100 µL depolanır. Jel çözüm çözüm içinde hava kabarcıkları önlemek için bir cam sopa ile karışımı hafifçe karıştırın. - Hemen solüsyonu dökün ve dikkatle çentikli tabak kenarı boyunca monte cam kalıplara neredeyse tepeye boşluğu doldurmak ve tarak ekleyin. Jel çözüm küçük hacmi tarak ekleyin.
Not: cam plakanın jel sızıntı gelen önlemek için yatay tutun. Herhangi bir kabarcıklar balonu kanca ile kaldırın. - Jel 30 dk için oda sıcaklığında ayarlamak izin verir.
Not: Jel çözüm ve ortam sıcaklıklarında polimerizasyon süre değişebilir. - Sonra jel tamamen polimerizasyonu, döküm kelepçeler kaldırmak ve üst arabellek rezervuar doğru bakan çentikli plakalı Elektroforez tankı biriminde tabak seti getirin ve büyük kelepçeler tank birimine ayarla plaka bağlamak için kullanın.
- 1 L 0,5 × TBE tampon her üst ve alt rampaları dökün. Tarak kaldırmak ve tüm wells bir pipet veya şırınga kullanarak arabellek ile kanül.
Not: jel sandviç alt plaka tamamen olmadan herhangi bir kabarcıklar arabellekte batırılmış olun.
4. koşma jelleri
- Yaklaşık 1 µL PCR ürününün polyacrylamide jel her kuyunun içine yükleyin. DNA boyutu merdivenle jel örnekleri PCR ürünlerinin yanı sıra her iki taraf için yükleyin. Emniyet kapak üst arabellek odasına düzeltmek.
- Müşteri adaylarını kırmızı-kırmızı ve siyah-siyah renk kodlu eşleşen güç kaynağına bağlayın. Jel boya normal ~ 70 dk için tanımlanmış bir konuma ulaşana kadar 110 V sabit bir gerilim çalıştırın.
Not: Gerilim ve çalışan zaman PCR ürünleri büyüklüğüne göre ayarlanabilir.
5. gümüş sigara-Polyacrylamide jel içinde SSR işaretleri algılamak için boyama
- Elektroforez sonra bir büyük kabı üzerinden kapak üst odası arabelleğinden drenaj. Yan kelepçeler ayırmak, tabakları cihazları kaldırmak, dikkatle çentikli cam levha bir kenarı boyunca bir spatula ile ayırmak ve diğer cam levha bağlı jel kalır bağlama silane ile kaplı olduğundan emin olun.
- AgNO3 ' te 1 litre dH2O. hazırlamak 1 L / taze geliştirme çözümü 1,5 g NaOH 10 g dH2O 900 ml çözülerek çözülerek taze emprenye çözüm 1 L yapmak, 1 mL % 37 formaldehit ekleyin ve 1 L dH2O. kullanarak son bir seviyesini ayarlamak
Not: eldiven giymek ve yukarıdaki kimyasallar ve çözümleri itina ile başa. Çözümler ve çözümleri ile ilgili adımlar bıraktığımız gerek yoktur. - Dikkatle jel ve cam plaka Elektroforez arabellek kaldırma sonra plaka jel plastik bir tepsi yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin ve emprenye çözüm 1 litre jel daldırın geniş dH2O ile yıkayın. Tepsiyi bir shaker koymak.
- Tepsiyi hafifçe 60 r/dk 3-4 dk için salla.
Not: Saat sallayarak jel kalınlığı ve emprenye çözümde gümüş nitrat yoğunluğuna göre ayarlanabilir. - Emprenye çözüm dışarı plaka taşımak ve başka bir tepsi koydu. Plaka ve geniş dH2O iki kez 3-5 s için her kullanarak jel yüzeyi kapalı kalan emprenye çözümden durulayın.
- Yukarı dönük olacak şekilde başka bir tepsi jel ile plaka koyun, geliştirme çözüm, 1 L plaka daldırın sonra tepsiyi hafifçe 50 r/dak ~ 3 dakika DNA görünümünü parçaları monitör süreyle sallamak. ve en yüksek oranı sinyal DNA parçaları geliştirme durdurur arka plan gürültü görülmektedir (Bu adım ~ 3 dakika sürer).
- Plaka ve jel ile geniş dH2O iki kez durulama ve jel tabak kağıt mendil ile kurulayın.
- Uygun bir tarayıcı kullanarak jel inceden inceye gözden geçirmek. 300 dpi çözünürlüğe DNA parçalarının açık bir görselleştirme verir. Jel de bir kamera ile fotoğrafı olabilir.
- SSR işaretleri bantlama deseni tabanlı görüntü DNA parçalarının üzerinde toplam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR amplicons çiçekli Çin lahanası ve tütün ilgili SSR astar çiftleri kullanılarak üretildi. Elektroforez sonra belirsizliğe yer bırakmadan SSR işaretleri (şekil 1) bantlama şekillerinin Algılandı iletişim kuralı boyama yukarıdaki gümüş kullanarak polyacrylamide jeller lekeli.
Farklı gümüş protokolleri boyama algılama verimliliğini karşılaştırmak için PCR ürünleri SSR işaretleri tütün ve çiçekli Çince lahana polyacrylamide Jel Elektroforez kullanarak ayrı kaldık ve beş yayımlanmış gümüş boyama kullanarak görüntülenir iletişim kuralları9,11,12,13,14 ve yeni iletişim kuralı. Tüm altı protokolleri tütün için desen bantlama ve Çin lahanası genotip (Resim 2), çiçekli SSR algılandı ama mevcut protokol düşük arka plan gürültü vardı ve DNA'ın en yüksek kontrast parçaları, öyle ki en yüksek resim üretilen berrak SSR polimorfizmleri net tarama için. Çalışma süresi ve ana adımları ve gümüş boyama işlemi tamamlamak için kullanılan reaktifler sayısı her protokol için Tablo 1 ' de listelenen, yeni protokol alır en azından zaman ve daha az kimyasal reaktifler gerektirir ve işlem adımları.
Şekil 3 50-2.000 bp tarafından DNA işaretleyicisi bir sigara denaturing polyacrylamide jel üzerinde ölçülen protokol duyarlılığını gösterir.
Şekil 1: desenler bantlama SSR tespiti. SSR bantlama algılama çiçekli Çin lahanası (A) genotip için desen ve tütün yeni gümüş boyama kullanarak (B) protokol. PCR ürünlerinin % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jeller üzerinde ayrılmış ve protokol boyama yukarıda bildirilen gümüş göre lekeli. Lane metredir DNA boyutu marker, 1-62 temsil amplicons 62 genotip güçlendirilmiş şerit SSR astar çift "CX-157" ile (5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' ve 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', ileriye ve geriye doğru astar dizileri vardır sırasıyla) olarak çiçekli Çince lahana (şekil 1A) ve "PT51333" (ileriye ve geriye doğru astar 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' ve 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 dizileridir', sırasıyla) Tütün (şekil 1B). Okları hedef SSR bantları için gelin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tütün ve çiçekli Çin lahanası genotip farklı gümüş boyama protokolleri kullanarak SSR işaretçileri için algılama verimliliği karşılaştırılması. PCR ürünleri sigara denaturing polyacrylamide jeller % 6 ayrı kaldık ve lekeli beş kullanarak yayımlanmış gümüş boyama protokolleri9,11,12,13,14 ve yeni iletişim kuralı. Lane M DNA boyutu belirtecidir. Dar sokak 1-4 temsil SSR astar "PT50903", amplicons (5 ileriye ve geriye doğru astar dizileridir'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 've 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', sırasıyla) içinde dört tütün genotip; Şerit 5-8 belirtmek SSR astar "CX-43" amplicons (ileriye ve geriye doğru astar 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 've 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3' dizileridir, sırasıyla) dört çiçekli Çin lahanası genotip içinde. Hedef SSR bantları oklarla gösterilir. Bu rakam Liu ve ark, Şekil 2 değiştirildi. 8 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: 50-2000 bp DNA işaretleyicisi bir sigara denaturing polyacrylamide jel üzerinde tarafından ölçülen Protokolü duyarlılığını. İlk lane ile DNA işareti 1µL 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, parçası boyutları ile dolu olduğunu 1500 ile 2000 bp, her biri 10 ng/µL. Kalan örnekleri 1:2 seri seyreltme önceki Lanes ile doluydu. İletişim kuralı için minimum algılanabilir tutar 9.8 pg 11inci şeritte (2,2 pg/mm2 ' bir 4,5 mm2 iyi) olduğunu. Bu rakam Liu vd. , şekil 1 değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Madde | Sanguinetti vd. 9 | Qu vd. 11 | Bir vd. 12 | Byun vd. 13 | Kumar vd. 14 | Yeni iletişim kuralı |
| Çalışma süresi (dk) | 30 | 12-25 | 8 – 9 | 9-31 | 42 | 6-7 |
| Adım sayısı | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Reaktifler sayısı | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tablo 1: Çalışma süresi, anahtar adımlar ve farklı gümüşleri protokolleri boyama kullanılan reaktifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jel yıkandıktan sonra emprenye kritik bir adımdır. Yetersiz yıkama zaman ve su hacmi plaka ve jel yüzeyi üzerinde emprenye çözüm eksik kaldırılmasına neden ve karanlık bir arka planda neden. Uygun gelişmekte olan zaman başka bir önemli adım, aşırı geliştirme koyu kahverengi arka plan DNA parçalarının düşük kontrast görüntü ile sonuçlanabilir. Buna ek olarak, emprenye adım DNA parçalarının boyama verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Her ne kadar boyama kalite emprenye süresi 5 dk genişletme veya AgNO3 toplamına emprenye çözümde artan değil önemli ölçüde geliştirmek, emprenye azaltarak vakti 3 dk veya AgNO3 (miktarını azaltarak daha az < 1 g) içinde gri veya sığ siyah DNA parçaları neden olabilir.
Verimli DNA tespiti için hızlı ve basit bir iş için bir gümüş boyama yöntemi tercih edilir. Bu çalışmada geliştirilen yeni protokol sabitleme, durdurma ve birkaç yıkama adımları diğer protokolleri6,9,10,11,12',13 açıklanan önler , (Resim 1 ve Şekil 2), boyama kalitesini etkilemeden 14 ve sadece 7 min iki basit adımlar emprenye ve geliştirme gerektirir. Bu nedenle, yeni iletişim kuralı tüm diğer boyama protokolleri geçerli kullanılabilir6,7,9,10,11,12daha hızlıdır, 13,14. Buna ek olarak, yeni protokol yalnızca üç kimyasallar, i.egerektirir. AgNO3, formaldehit ve diğer iletişim kuralları6,7,9,10,11,12'kullanılan benzer tutarlar, NaOH, 13,14, bu nedenle, yeni protokol daha ekonomik ve daha az kimyasal tehlikeler, sadece kimyasal maliyeti azaltır ama Ayrıca ilave kimyasalların tehlikeli malzeme taşıma sürecinin en aza indirir oluşturur Laboratuvar.
Yeni protokol net görüntü desenleri tütün bantlama ve Çin lahanası genotip (şekil 1) çiçeklenme SSR kesin tespiti için düşük arka plan gürültü ile üretilen. Diğer iletişim kuralları ile karşılaştırıldığında, yeni iletişim kuralı en iyi etkisi düşük arka plan gürültü ve en yüksek resim kontrast (Şekil 2) Boyama üretti. 50-500 bp mesafede, DNA tespiti için yeni iletişim kuralı duyarlılığını az 19.5 pg/µL yapıldı (4.3 pg / AA2) 9.8 pg/µL (2,2 pg/mm2) en az bir konsantrasyon ile (şekil 3), diğer iletişim kuralları'nda rapor daha yüksek olduğu 7 , 12 , 13.
Floresans etiketleme teknolojileri yüksek işlem hacmi ve DNA amplicons çözünürlük algılama sağlamasına karşın, bunlar özel ekipman ve birçok biyolojik laboratuvarlar için özellikle de erişilebilir olmayabilir daha pahalı reaktifler gerektirir gelişmekte olan ülkelerde. Yeni boyama Protokolü basit ve hızlı bu ~ 800 DNA örnekleri kişi başı günlük, böylece ekran edebilirsin, rutin araştırma gerçekleştirmek bu laboratuarlar için iyi bir seçenektir.
Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen yeni iletişim kuralı işlemi uygulamak daha kolay, daha ucuz, daha hızlı ve sadece üç reaktifler kullanır — algılama etkisi veya resim netliği ödün vermeden — boyama teknikleri diğer varolan gümüş daha. İletişim kuralı boyama yeni gümüş başarıyla tütün ve çiçekli Çin lahanası araştırma kullanılmıştır ve başarılı SSR Genotipleme diğer türler için değerli bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Guangdong doğal Bilim Vakfı Çin (2015A030313500), il anahtar uluslararası kooperatif araştırma platformu ve büyük bilimsel araştırma projesi, Guangdong Yükseköğretim (2015KGJHZ015), bilim tarafından finanse edildi ve Teknoloji planı Guangdong tütün tekel Yönetim (201403, 201705), bilim ve teknoloji planı Guangdong, Çin (2016B020201001), Ulusal İnovasyon eğitimi projesi için lisans öğrencileri (201711078001). Ticari adlar veya ticari ürünler bu yayındaki söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
