Summary
我们展示了一种新的方法来构建一个基于单细胞的3维 (3D) 装配体, 而无需人工脚手架。
Abstract
再生医学和组织工程为治疗顽固性疾病提供了几个优势, 一些研究表明了3维 (3D) 蜂窝组件在这些领域的重要性。人工脚手架通常用于构建3D 蜂窝组件。然而, 用于构造蜂窝组件的脚手架有时是有毒的, 可能会改变细胞的属性。因此, 建立一种促进细胞接触的无毒方法是有益的。本文介绍了一种利用葡聚糖光镊构建稳定蜂窝组件的新方法。这种方法的优点之一是它在几分钟内建立了稳定的细胞到细胞的接触。这种新方法允许在天然亲水性聚合物中构建3D 蜂窝组件, 预计将有助于在再生医学和组织工程领域构建下一代3D 单电池组件。
Introduction
虽然人类组织由几个细胞组成, 并且可以帮助保持身体的稳态, 单细胞本身也发挥重要作用通过细胞间的相互作用。因此, 重要的是要阐明如何通过外部信号刺激单个细胞, 以及它们如何将此类信号传输到其他贴壁细胞。为此, 建立了基于单细胞的3维 (3D) 组件1、2、3、4、5、6 的构建方法. ,7,8。但是, 用于构造蜂窝组件的材料仍然可以改进。例如, 合成凝胶和聚合物, 包括聚乙二醇 (PEG) 具有一定的化学物理化学性质, 并可能影响靶细胞 (例如,毒性)。
我们最近报道了一种新的系统, 可以通过建立稳定的细胞细胞接触9, 通过葡聚糖 (DEX) 生成单细胞3D 的细胞组装。我们认为, 这项技术可以在一些研究领域, 包括再生医学, 甚至癌症生物学中有用。在本报告中, 我们描述了我们如何操作单细胞和构建3维 (3D) 蜂窝组件的存在各种亲水性生物大分子包括 DEX 没有人工脚手架。
Protocol
1. 细胞的制备
- 维持 NAMRU 小鼠乳腺上皮细胞 (NMuMG 细胞) 与5毫升 d-MEM 包含 10% (v) 胎牛血清 (FBS) 和 1% (v) 青霉素-链霉素 (P/S) 在25厘米3烧瓶。移除杜尔贝科的改良老鹰培养基 (d-MEM), 内含 10% FBS 和 1% m/s。
- 添加3-5 毫升37摄氏度磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (-) 到烧瓶。请注意, PBS 的 pH 值为 7.1-7.3。
- 使用吸气器从烧瓶中取出所有 PBS。
- 将1.5 毫升的37摄氏度胰蛋白酶 (0.25%, w/v) 添加到烧瓶中。
- 在37摄氏度的共2孵化器中孵育烧瓶约1-2 分钟。
- 添加3.5 毫升 D-MEM 包含 10% FBS 和1% 个/秒到烧瓶。移液器混合。
- 将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中, 在室温下离心3分钟。请注意, 离心机的旋转半径和转速分别为 16.6 cm 和 1500 rpm。在这种情况下, 相对离心力为 417 x g。
- 在吸入培养基后, 将5毫升新鲜 d-MEM (10% FBS 和1% 个/秒) 添加到烧瓶中 (如有必要, 请按照制造商的指示早期细胞冷冻保存液)。
2. 葡聚糖 (DEX) 的制备
- 通过混合10毫升 d-MEM (10% FBS, 1%P/秒) 和0.8 克 dex, 准备80毫克/毫升的 dex 溶液。请注意, 在细胞培养足够的时间后, DEX 溶液可以用注射器过滤器 (0.22 µm) 进行过滤。
- 通过混合200µL 的 dex 溶液和200µL 在2.1 中制备的细胞悬浮液, 制备含有40毫克/毫升 dex 培养基的细胞悬浮液。请注意, 溶液中细胞的数量密度约为 2.3×105细胞/毫升。
3. 激光和显微术的制备
- 打开激光 (连续波, 1064 nm 波长) (图 1a)。请注意, 在红色到近红外区域中使用波长的激光光束最有效;这个波长区域被称为诊断和治疗窗口10 , 因为它是最小的吸收细胞。
- 双击 "软件" 图标。
- 双击①相机、②发光二极管 (LED)、③对焦调整和④移动舞台的图标。将显示对应于①④的显示器 (图 1b)。
4. 使用激光陷印系统进行细胞操作
- 放置20µL 的样品在步骤2.2 上的底部盖玻片 (0.17 毫米厚度, 尺寸 = 30 毫米 x 40 毫米), 并覆盖它与顶盖玻璃 (0.17 毫米厚度, 尺寸 = 18 毫米 x 18 毫米), 由两个间隔 (0.17 毫米厚度的分离提供, 尺寸 = 10 毫米 x 24 毫米), 如图 2所示。请注意, 这些眼镜不需要特殊涂层。
- 将在步骤4.1 中准备好的样品单元放置在较低物镜上 (水浸泡与钙10微升, 放大 = 60X, 工作距离 = 0.28 mm, 数值孔径 = 1.2))。
- 连接上物镜 (水浸泡与约10微升, 放大 = 60X, 工作距离 = 2 毫米, 数值孔径 = 1.0) 在样品单元的顶部。
- 单击图标 2 (图 1b) 打开 LED 指示灯。
- 通过单击面板 3 (图 1b) 上的图标, 直到对焦为止, 调整样本与较低物镜之间的距离。
- 通过单击图标 I、II 和 III (图 1B), 在样品的位置1和位置 2 (图 1B) 上照射激光光束。
- 通过在图标 IV (图 1b) 输入此值, 将每个激光光束的强度设置为 1500 mW。
- 通过单击图标4指示方向 (图 1b) 移动采样阶段, 直到单元格被困在位置 1 (图 1b)。
- 拖动光标, 指示位置 2 (图 1b), 直到另一个单元格被困在位置2。
5. 构建3维 (3D) 细胞结构
- 操作单个单元格, 使其与另一个单元格保持联系。保持300s 的条件;也就是说,每个细胞都暴露在激光300s 上。
- 记录图 1b中显示的 x-y 轴。
- 通过捕获并将另一个单元格传输到单元格来构造任意2D 单元格组件。
- 通过上下移动舞台来构建3D 蜂窝组件。
- 确认激光关闭后部件保持稳定。
Representative Results
图 1显示了本研究中使用的显微镜和软件。图 2是放置包含单元格的示例解决方案的过程的示意图。图 3展示了使用双光束光学镊子形成金字塔结构的方法。如果实验成功, 即使激光关闭, 这些蜂窝组件仍保持稳定。
图 1: (a)激光陷印系统的控制系统 (NanoTracker2 (11))。通过在①③的步骤后打开激光开关激活系统。(b)控制激光陷印系统的软件。通过分别单击图标①、②、③和④, 激活相机、LED 灯、对焦调整和移动舞台。显微镜图像显示在面板1中。LED 的开/关控制在面板2中。焦点控制在面板3中。激光光束在位置1和2照射, 通过单击图标 I 到 iv。此激光陷印系统的详细信息参见参考 (12)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 放置玻片的代表性示意图。20µL 的样品 (含有葡聚糖的细胞悬浮液) 被放置在幻灯片上, 用于激光操作。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: a)在具有 DEX (40 毫克/毫升) 的培养基中, 预期形状的上皮细胞 (NMuMG) 的组件: 金字塔显示为3D 簇的一个示例。b)还显示了金字塔形3D 蜂窝组件的示意图。请点击这里查看这个数字的更大版本.
Discussion
本研究展示了我们最近的报告9,11关于使用可溶性聚合物用于构建3D 单电池组件的具体应用。当细胞数量高达 10, 并且可以由单个激光束持有时, 此类组件在散装溶液中稳定形成。当有超过10细胞时, 装配体在玻璃表面沉淀。虽然实验仍处于原始阶段, 但我们预计新的方法可能是构建下一代3D 单细胞组件的强大工具, 这对于细胞生物学领域的进展是必不可少的,再生医学。
在不含聚合物的溶液中, 由于表面电荷、水化排斥力、糖萼排斥效应和膜起伏引起的静电排斥, 细胞相互排斥。我们以前的研究表明, 细胞对可以稳定很长时间, 当细胞用 PEG 处理。更重要的是, 成功地将一个细胞对传输到一个没有 peg 的区域, 在细胞接触了5分钟后, 在 peg 中, 表明蜂窝接触保持稳定的方式。这很好地解释了损耗效应11, 基本上相同的机制适用于使用 DEX9生成的蜂窝组件。我们目前的研究结果表明, 其他种类的天然大分子也可用于构建稳定的3D 蜂窝组件。
对于细胞的迅速输送, 聚合物的浓度是很重要的。通常, 当聚合物溶解在重叠浓度以上时, 溶液的粘度急剧增加。在这种情况下, 使用光学镊子很难操作细胞。因此, 实验应在重叠浓度以下进行。对于 DEX 解决方案, 重叠浓度为50毫克/毫升 (动力学粘度为5.5 毫米2/秒)。如参考文献9所示, 当 DEX 浓度为10毫克/毫升至40毫克/毫升时, 观察到稳定的细胞组装。这一结果表明, 即使 DEX 浓度低于重叠浓度, 损耗效应也足够大, 保持细胞细胞的稳定接触。已经表明, 添加 DEX 不影响细胞活性高达40毫克/毫升9。
建立3D 蜂窝组件的方法在再生医学领域很重要, 因为通过构建单细胞来模拟体内细胞微环境可能促进干细胞衍生组织形成。到目前为止, 我们已经使用了 Neuro2A 细胞9除了 NMuMG 细胞, 使用本协议来构造蜂窝组件。我们希望建立一个实验方法, 以构建大量不同形态细胞的3D 细胞组件。由市川等开发的光学镊子系统。13将适用于此目的, 因为细胞的方向可以控制。沿着这些路线进行的进一步试验应该是有希望的。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢蜀桥、葵吉田和妙子大田在同志社大学的慷慨帮助与实验设置。这项工作得到了 KAKENHI (15H02121、15K05400、25103012、50587441) 和私立大学战略研究基金会 MEXT 支持的项目的支持。这项研究还得到了来自知情 (领先国家研究中心) 科学联合会 "健康动物安全食品" 的波兰赠款的支持, 科学和高等教育部 05-1/KNOW2/2015 号决定。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
