Summary
단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리를 인공 비 계 없이 건설에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다.
Abstract
조직 공학과 재생 의학 다루기 힘든 질병의 치료에 대 한 몇 가지 장점을 제공 하 고 여러 학문은이 분야에서 3 차원 (3D) 셀룰러 어셈블리의 중요성을 설명 했다. 인공 건설 기계 자주 3D 셀룰러 어셈블리를 만드는 데 사용 되었습니다. 그러나, 셀룰러 어셈블리를 구성 하는 데 사용 하는 건설 기계는 때때로 유독한 그리고 셀의 속성을 변경할 수 있습니다. 따라서, 그것은 세포 세포 접촉을 촉진 하는 비 독성 방법을 설정 하 도움이 될 것 이다. 이 종이에서 dextran 광학 핀셋을 사용 하 여 안정적인 세포 어셈블리를 생성 하기 위한 새로운 방법을 소개 합니다. 이 방법의 장점 중 하나는 그것은 몇 분 이내에 안정적인 셀 연락처 설정입니다. 이 새로운 방법은 자연 친수성 폴리머에서 3D 셀룰러 어셈블리의 건설 있으며 재생 의학 및 조직 공학의 분야에서 다음-세대 3D 단일 셀 어셈블리를 생성 하는 데 도움이 될 것으로 예상 된다.
Introduction
인간의 조직 세포의 여러 어셈블리의 구성 동안 신체의 항상성 유지 하는 데 도움이, 스스로 단일 셀 또한 재생 중요 한 역할 셀 상호 작용을 통해 . 따라서, 단일 세포 외부 신호에 의해 자극 될 수 하는 방법 및 다른 부착 셀에 같은 신호를 전송 하는 방법을 명료 하 게 중요 하다. 이 위해 여러 가지 방법은 단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리1,2,3,,45,6의 건설에 대 한 설립 되었습니다. ,,78. 그러나, 세포질 어셈블리를 생성 하는 데 사용 되는 재료는 향상 여전히 수 있습니다. 예를 들어 합성 젤 및 고분자 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하 여 특정 화학 물리 화학적 특성을가지고 대상 셀 (예를 들어, 독성)에 영향을 미칠 수 있습니다.
우리는 최근 dextran (덱 스)를 사용 하 여 안정적인 셀 연락처9를 설정 하 여 셀의 단일 셀 기반 3D 어셈블리를 생성할 수 있는 새로운 시스템을 했다. 우리는이 기술을 재생 의학 및 심지어 암 생물학을 포함 하 여 여러 연구 분야에 도움이 될 수 있는 것으로 간주. 이 보고서에서 우리는 우리가 어떻게 단일 세포를 조작 하 고 인공 비 계 없이 덱 스를 포함 한 다양 한 친수성 biomacromolecules의 3 차원 (3D) 셀룰러 어셈블리 구성 설명.
Protocol
1입니다. 셀의 준비
- D-MEM 포함 10% (v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% (v) 25 cm3 플라스 크에서 페니실린-스 (P/S)의 5 mL와 함께 NAMRU 마우스 유선 상피 세포 (NMuMG)를 유지 합니다. 제거 Dulbecco의 수정이 글의 매체 (D-MEM), 10 %FBS 및 1% 포함 된 P/s.
- 플라스 크를 37 ° C 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (-)의 3-5 mL를 추가 합니다. 참고 PBS의 pH 7.1-7.3 이다.
- 흡 인기를 사용 하 여 플라스 크에서 모든 PBS를 제거 합니다.
- 플라스 크를 37 ° C의 트립 신 (0.25%, w/v)의 1.5 mL를 추가 합니다.
- CO2 배양 기에서 37 ° C에서 약 1-2 분 동안 플라스 크를 품 어.
- 추가 10 %FBS 및 1% 포함 된 D-MEM의 3.5 mL 플라스 크에 P/S. 혼합 피 펫입니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실내 온도에 3 분 동안 원심. Note는 회전 반경 및는 원심 분리기의 회전 속도 16.6 c m 및 1500 rpm, 각각. 이 조건 하에서 상대 원심력 417 x g 이다.
- 신선한 D-MEM의 5 mL을 추가 (10 %FBS 1 %P / S) 매체 발음 후 플라스 크를 (필요한 경우 cryopreserve cryopreservation 솔루션, 제조자의 방향 다음 셀).
2입니다. Dextran (덱 스)의 준비
- D-MEM의 10 mL를 혼합 하 여 80 mg/mL 덱 스 솔루션의 준비 (10 %FBS, 1%P/S)과 덱 스의 0.8 g. 덱 스 솔루션 주사기 필터 (0.22 μ m)으로 필터링 할 수 있습니다 참고 세포는 충분 한 시간 동안 배양 한 후.
- 덱 스 솔루션의 200 µ L 및 2.1에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 혼합 하 여 40 mg/mL DEX 매체를 포함 하는 셀 서 스 펜 션 준비. 솔루션에는 셀의 수 조밀도 약 2.3 × 105 셀/mL.
3입니다. 레이저 및 현미경 검사 법에 대비 하 여
- 레이저 (연속 웨이브, 1,064 nm 파장) 설정 (그림 1a). 근 적외선 영역에 빨간색에서 파장을 가진 레이저 광선의 사용은 가장 효과적인; 그것은 최소한 세포에 의해 흡수 이후이 파장 영역 진단 및 치료 창10 이라고 합니다.
- 소프트웨어 아이콘을 두 번 누릅니다.
- ① 카메라, ② 발광 다이오드 (LED), ③ 초점에 대 한 아이콘 조정, 두 번 클릭 하 고 ④ 단계 이동. ①-④에 해당 하는 표시 (그림 1b) 표시 됩니다.
4. 셀 조작 레이저 트랩 시스템을 사용 하 여
- 하단 커버 유리에 2.2 단계에서 준비 하는 샘플의 장소 20 µ L (0.17 m m 두께, 크기 = 30 m m × 40 m m), 상단 덮개 유리 커버 (0.17 m m 두께, 크기 18 × 18mm =), 두 명의 스페이서 (0.17 m m 두께에서 제공 하는 분리 크기 = 10 m m × 24 m m), 그림 2와 같이. 참고 이러한 안경 특별 한 코팅을 필요 하지 않습니다.
- 4.1 낮은 대물 렌즈에 단계에서 준비 된 샘플 셀 배치 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 0.28 m m, 조리개 수치 = = 1.2)).
- 위 대물 렌즈를 연결 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 2 m m, 조리개 수치 = = 1.0) 샘플 셀의 상단에.
- 설정 LED 조명 아이콘 2 (그림 1b)를 클릭 하 여.
- 패널 3 (그림 1b)에 있는 아이콘을 클릭 하 여 샘플 및 낮은 대물 렌즈 사이의 거리를 조정 초점에 때까지.
- I, II, 및 III (그림 1b) 아이콘을 클릭 하 여 위치 1과 샘플의 위치 2 (그림 1B)에서 레이저 광선을 비추는.
- 1500 각 레이저 광선의 강도 설정 아이콘 IV (그림 1b)에서이 값을 입력 하 여 mW.
- 셀까지 아이콘 4 나타내는 방향 (그림 1b)를 클릭 하 여 샘플 단계 위치 1 (그림 1b)에 갇혀 이동 합니다.
- 다른 셀까지 위치 2 (그림 1b)를 나타내는 커서 위치 2에 갇혀 드래그 합니다.
5. 건설의 3 차원 (3D) 셀 구조
- 단일 셀 다른 셀에 접촉 되도록 조작할 수 있습니다. 300이 상태 유지 s; 즉, 300 레이저에 노출 되는 각 셀 s.
- 그림 1b에 표시 된 X-Y 축을 기록 합니다.
- 트래핑 및 셀을 다른 셀을 운반 하 여 임의의 2D 셀 어셈블리를 생성 합니다.
- 무대를 아래로 이동 하 여 3 차원 세포 어셈블리를 생성 합니다.
- 어셈블리는 레이저 스위치 off 후 안정적인 유지 확인 합니다.
Representative Results
그림 1 에 현미경 및 소프트웨어를이 연구에 사용 된 보여 줍니다. 그림 2 샘플 솔루션을 포함 하는 셀을 삽입 하기 위한 절차의 도식 적인 표현입니다. 그림 3 에서는 더블 빔 광학 핀셋을 사용 하 여 피라미드 구조 형성을 보여 줍니다. 이러한 세포 어셈블리는 실험에 성공 하면 레이저 꺼질 후에 안정적으로 유지.
그림 1 : (a) 레이저 트랩 시스템에 대 한 제어 시스템 (NanoTracker2 (11)). 시스템 단계 ①-③ 레이저 스위치에 의해 활성화 됩니다. (b) 레이저 트랩 시스템을 제어 하기 위한 소프트웨어. 카메라, 조명, 초점 조정, LED 및 아이콘 ①, ②, ③, ④를 각각 클릭 하 여 활성화 단계를 이동. 미세한 이미지 패널 1에에서 표시 됩니다. LED에 대 한 온/오프 제어 패널 2입니다. 포커스 패널 3에서에서 제어 됩니다. 레이저 빔 위치 1과 2에서 아이콘을 클릭 하 여 반구는 I 4를. 이 레이저 트랩 Systemare의 세부 사항을 참고 (12)에 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 슬라이드 유리 배치에 대 한 대표적인 개략도. 샘플 (세포 현 탁 액 dextran을 포함)의 20 µ L 슬라이드에 배치 하 고 레이저 조작에 대 한 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 한) 덱 (40 mg/mL)와 매체에서 의도 된 모양의 상피 세포 (NMuMG)의 어셈블리: 피라미드 3D 클러스터의 예를 들어 표시 됩니다. b) 피라미드 모양의 3 차원 세포 어셈블리의 도식 적인 그림도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
현재 연구는 3D 단일 셀 어셈블리의 건설에 대 한 수용 성 고분자의 사용에 우리의 최근 보고서9,11 의 구체적인 응용을 보여 줍니다. 이러한 어셈블리 때 셀 수 최대 10 단일 레이저 빔에 의해 열릴 수 있다 대량 솔루션에 안정적으로 형성 된다. 10 개 이상의 셀이 때 어셈블리는 유리 표면에 침전. 실험은 아직 원시적인 단계에에서 있지만, 우리 소설 방법론 세포 생물학의 분야에서 진행을 위한 불가결 하지 않습니다 다음-세대 3D 단일 셀 어셈블리의 건설에 대 한 강력한 도구가 될 수 있는 기대와 재생 의학입니다.
아무 폴리머를 포함 하는 솔루션에 세포 표면 충전, 수 화 반발 힘, glycocalyx 반발 효과, 그리고 막 파동에서 발생 하는 정전기 반발 작용 때문에 서로 격퇴. 우리의 이전 연구가 보여주었다 셀 쌍 셀 말뚝으로 취급 됩니다 때 오랜 시간 동안 안정 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 못, 후 셀 말뚝에 5 분간 접촉에서 개최 했다 없이 지역에 셀 쌍의 성공적인 전송 셀룰러 접촉 안정적인 방식으로 유지 됩니다 나왔다. 이것은 잘 고갈 효과11의 점에서 설명 하 고 본질적으로 동일한 메커니즘 덱 스9를 사용 하 여 생성 하는 세포질 어셈블리에 적용 합니다. 우리의 현재 결과 천연 고분자의 다른 종류를 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 만드는 데 사용 될 수도 것이 좋습니다.
셀의 신속한 수송, 폴리머의 농도 중요 합니다. 일반적으로, 솔루션의 점도 폴리머 겹침 농도 위에 해산 대폭 증가 합니다. 이 조건 하에서 광학 핀셋을 사용 하 여 셀을 조작 하기가 어렵습니다. 따라서, 실험 겹침 농도 아래 수행 되어야 한다. 덱 스 솔루션에 대 한 중복 농도 ca. 50 mg/mL (운동 점도 5.5 m m2/s). 참고 9 같이 안정적인 세포 어셈블리 때 덱 스의 농도가 10 mg/mL 40 mg/mL에 관찰 되었다. 이 결과 고갈 효과 충분히 큰 덱 스 농도 겹침 농도 보다 낮은 경우에 안정적인 셀 접촉을 유지 하는 것을 제안 합니다. 그것은 덱 스의 추가 40 mg/mL 9까지 세포 생존 능력에는 영향을 미치지 않습니다 표시 되었습니다.
3D 세포 어셈블리의 건설에 대 한 방법의 설립에 중요 한 재생 의학 분야는 vivo에서 흉내 낸 이후 단일 셀을 구조화 함으로써 세포 microenvironment 수 있습니다 촉진 줄기 세포 파생 조직 형성입니다. 지금까지, NMuMG 세포에 뿐만 아니라 Neuro2A 셀9 를 사용 하 여 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 현재 프로토콜을 사용 했습니다. 다양 한 형태학의 세포의 많은 수의 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하기 위한 실험적인 방법론을 확립 하겠습니다. 이치카와 연구진이 개발한 광학 족집게 체계 13 것 적용이 목적 때문에 셀의 방향을 제어할 수 있습니다. 이 라인을 따라 더 재판 약속 해야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 슈 모토, 아오이 요시다 타 에코 오타 도시샤 대학에서 실험 설치와 함께 그들의 관대 한 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 사립대학 전략적 연구 재단에 대 한 KAKENHI (15 H 02121, 15 K 05400, 25103012, 50587441)와 MEXT-Supported 프로그램에 의해 지원 되었다. 이 연구도 사역의 과학 및 고 등 교육 제 05-1/KNOW2/2015의 결정 알고 (선도 국가 연구 센터) 과학 컨소시엄 "건강 한 동물-안전 식품"에서 폴란드 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
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