Summary
Мы продемонстрировать новый метод для построения одной cell-based 3-мерные (3D) Ассамблея без искусственных лесов.
Abstract
Регенеративной медицины и тканевая инженерия предлагают несколько преимуществ для лечения сложных заболеваний, и несколько исследований продемонстрировали важность 3-мерной сотовых сборках (3D) в этих областях. Искусственные леса часто используются для создания 3D сотовых сборках. Однако строительные леса, используемые для построения клеточных сборки иногда токсичны и могут изменять свойства клеток. Таким образом было бы полезно разработать метод не токсичен для облегчения контактов ячеек. В этой статье мы представляем новый метод для построения стабильных клеточных сборок с помощью Оптический пинцет с декстрана. Одним из преимуществ данного метода является, что он устанавливает стабильный контакт к ячейке в течение нескольких минут. Этот новый метод позволяет строительство 3D сотовых сборках в естественной гидрофильного полимера и, как ожидается, будет полезным для построения нового поколения 3D одноклеточных сборок в области регенеративной медицины и тканевой инженерии.
Introduction
В то время как ткани человека состоит из нескольких сборок клеток и может помочь сохранить гомеостаз организма, отдельные клетки сами по себе важную роль играют также через взаимодействие к ячейке. Таким образом важно выяснить, как отдельные клетки могут стимулироваться внешних сигналов и как они передают такие сигналы других адэрентных клеток. Для этой цели были созданы несколько методов для строительства одно cell-based 3-мерные (3D) сборки1,2,3,4,5,6 ,,78. Однако материалы, которые используются для построения клеточных сборки все еще может быть улучшено. Например синтетические гели и полимеров, включая полиэтиленгликоля (PEG) обладают некоторые химические физико-химических свойств и могут влиять на клетки-мишени (например, токсичность).
Недавно мы сообщили Роман системы, которая может генерировать один cell-based 3D Ассамблеи клеток с помощью декстрана (DEX) путем создания стабильных ячеек контакт9. Мы считали, что эта технология может быть полезным в нескольких областях исследований, включая регенеративной медицины и даже биологии рака. В настоящем докладе мы описываем, как мы манипулировать единичных клеток и построить 3-мерной сотовой сборки (3D) в присутствии различных гидрофильные биомакромолекулах, включая DEX без искусственных лесов.
Protocol
1. Подготовка клеток
- Поддерживать NAMRU мыши молочной железы эпителиальных клеток (NMuMG) с 5 мл D-MEM содержащие 10% (v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v) пенициллин-стрептомицином (P/S) в колбе3 25 см. Удаление Дульбекко изменение средних орла (D-MEM), содержащие 10% FBS и 1% P/S.
- Добавьте 3-5 мл физиологического раствора фосфатного буфера 37 ° C (PBS) (-) в колбу. Обратите внимание, что рН PBS является 7.1-7.3.
- Удалите все PBS из колбы, используя отсос.
- Добавьте 1,5 мл трипсина 37 ° C (0,25%, w/v) в колбу.
- Инкубируйте Фляга для примерно 1-2 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 .
- Добавить 3,5 мл D-MEM, содержащие 10% FBS и 1% P/S в колбу. Пипетка для смешивания.
- Передать пластиковых пробирок 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 3 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что радиус вращения и скорость вращения центрифуги, 16,6 см и 1500 об/мин, соответственно. При этом условии относительная центробежная сила — 417 x g.
- Добавьте 5 мл свежего D-MEM (10% FBS и 1% P/S) на колбу после аспирационных носитель (если требуется, криоконсервации клеток с криоконсервирования решения, следуя инструкциям производителя).
2. Подготовка декстрана (DEX)
- Подготовка 80 мг/мл раствора DEX путем смешивания 10 мл D-MEM (10% FBS, 1%P/S) и 0,8 г DEX. Обратите внимание, что решение DEX могут быть отфильтрованы с помощью шприца фильтра (0.22 мкм) после того, как клетки культивировали в течение достаточного времени.
- Готовят суспензию клеток, содержащих 40 мг/мл DEX среднего, смешивая 200 мкл раствора DEX и 200 мкл суспензии клеток, подготовленный в 2.1. Обратите внимание, что количество плотность клеток в решении приблизительно 2.3 × 105 кл/мл.
3. подготовка для лазерных и микроскопия
- Включите лазер (непрерывная волна, волны 1064 нм)(рисунок 1). Обратите внимание, что использование лазерный луч с длиной волны в красном в ближней ИК-области регион является наиболее эффективным; Этот регион волны называют диагностического и терапевтического окна10 , так как она минимально поглощается клетками.
- Дважды щелкните значок программного обеспечения.
- Дважды щелкните Изменить значки для камеры ① ② светоизлучающих диодов (СИД), ③ фокус и ④ перемещение стадии. Отображает соответствующий ①-④ покажет вверх (рис. 1б).
4. Сотовый манипуляции с использованием лазерной системы улавливания
- Место 20 мкл образца, подготовленный на шаге 2.2 на нижней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 30 × 40 мм) и покрыть ее с верхней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 18 × 18 мм), с разделением, предоставляемые две распорки (0,17 мм толщина Размер = 10 × 24 мм), как показано на рисунке 2. Обратите внимание, что эти очки не требуют специального покрытия.
- Поместите образец клеток, подготовленный на этапе 4.1 на нижнем объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 0,28 мм, числовая апертура = 1.2)).
- Прикрепите верхнюю объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 2 мм, числовая апертура = 1,0) в верхней части ячейки выборки.
- Включите светодиод свет, нажав значок 2 (рис. 1б).
- Отрегулируйте расстояние между образцом и нижней объектива, нажав значки на панели 3 (рис. 1б) до тех пор, пока он находится в фокусе.
- Облучить лазерных лучей на позиции 1 и 2 (рис. 1Б) позицию выборки, нажав значки I, II и III (рис. 1б).
- Установите необходимую интенсивность каждого лазерного пучка до 1500 МВт, введя значение в значок IV (рис. 1б).
- Перемещение образцов этап, нажав значок 4 указанием направления (рис. 1б) до ячейки удерживается на позиции 1 (рис. 1б).
- Перетащите курсор, указывающий положение 2 (рис. 1б) до другой ячейки в ловушке в позиции 2.
5. строительство 3-мерные (3D) клеточной структуры
- Манипулировать одну ячейку, так что это контакт с другой ячейки. Сохранить это состояние для 300 s; то есть, каждая клетка подвергается воздействию лазера для 300 s.
- Запишите оси X-Y, показано на рисунке 1b.
- Постройте сборку произвольных 2D клеток путем улавливания и транспортировки другую ячейку в клетки.
- Постройте сборку 3D сотовой, перемещая вверх и вниз на стадии.
- Подтвердите, что Ассамблея остается стабильным после выключения лазера.
Representative Results
Рисунок 1 показывает микроскоп и программное обеспечение, используемое в настоящем исследовании. На рисунке 2 это схематическое представление процедуры для установки примера решения, содержащие клетки. На рисунке 3 показано формирование структуры пирамиды, с использованием двойной луч оптический пинцет. Если эксперимент выполнен успешно, эти сотовой сборки остаются стабильными, даже после выключения лазера.
Рисунок 1 : (a) система управления для лазерной системы улавливания (NanoTracker2 (11)). Система активируется, повернув переключатель лазера, следующие шаги ①-③. (b) программного обеспечения для управления системой улавливания лазера. Камеры, свет, отрегулировать фокус, и перемещение стадии активируются нажатием иконки ① ②, ③ и ④, соответственно. Микроскопические изображение отображается в панели 1. Управления вкл/выкл для индикатор находится в панели 2. Основное внимание контролируется в группе 3. Лазерные лучи облученных в позиции 1 и 2, нажав значки I – IV. Этот лазер Systemare захвата подробно в ссылка (12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель схемы для размещения слайд стекла. 20 мкл пример (суспензии клеток, содержащих декстрана) размещена на слайде и используется для лазерных манипуляций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 :) сборки эпителиальных клеток (NMuMG) предназначен формы в среде с DEX (40 мг/мл): пирамиды показано в качестве примера 3D кластера. b) Схематический рисунок пирамидальная 3D сотовой Ассамблеи также показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Настоящее исследование показывает конкретное применение наших недавних докладах9,11 на использование растворимых полимеров для строительства 3D одноклеточных сборок. Такие сборки стабильно образуются в основной раствор когда количество клеток до 10 и может нести один лазерный луч. Сборки осадок на поверхности стекла, когда есть более чем 10 клеток. Хотя эксперименты в примитивные стадии, мы ожидаем, что новая методология может быть мощным инструментом для строительства нового поколения 3D одноклеточных сборок, которые являются необходимым условием для прогресса в области клеточной биологии и регенеративной медицины.
В раствор, содержащий не полимера клетки отталкивать друг друга за счет электростатического отталкивания, вытекающих из поверхности заряд, сила отталкивания гидратации, Гликокаликс отталкивания эффект и волнистость мембраны. Наши предыдущие исследования показали, что пар клеток может быть стабильным долгое время когда клетки лечат PEG. Что еще более важно успешной перевозки пару клеток в регион без ПЭГ, после того, как клетки были проведены в контакте на 5 минут в КОЛЫШЕК, свидетельствует о том, что сотовой контакты в стабильно. Это хорошо объяснить с точки зрения истощения эффект11, и по сути тот же механизм применяется к сотовой сборок, созданных с помощью DEX9. Наши текущие результаты показывают, что другие виды естественных макромолекул также может использоваться для построения стабильной 3D сотовых сборках.
Для быстрого транспорта клеток концентрации полимера имеет важное значение. Как правило вязкость раствора резко возрастает, когда полимер растворяется выше концентрация перекрытия. При этом условии трудно манипулировать клеток с использованием Оптический пинцет. Таким образом ниже концентрации перекрытие должно выполняться эксперимент. Для решения DEX, перекрытие концентрация составляет ОК. 50 мг/мл (кинетическая вязкость — 5,5 мм2/s). Как показано в ссылка 9, стабильной сотовой Ассамблеи было отмечено, когда концентрация DEX было 10 мг/мл, 40 мг/мл. Этот результат свидетельствует о том, что эффект истощения является достаточно большим, чтобы поддерживать стабильный ячеек контакт даже тогда, когда концентрация DEX находится ниже, чем концентрация перекрытия. Было показано, что добавление DEX не влияет на жизнеспособность клеток до 40 мг/мл 9.
Создание метода для строительства 3D сотовой сборок имеет важное значение в области регенеративной медицины, поскольку передразнивать в естественных условиях сотовой микроокружения путем структурирования единичных клеток может облегчить стволовых клеток ткани формирование. Пока мы использовали настоящий протокол для построения клеточных сборок с помощью Neuro2A клетки9 дополнение к NMuMG клеток. Мы надеемся создать экспериментальную методологию для построения 3D сотовых сборках большего числа клеток различных морфологии. Оптический пинцет система, разработанная Ichikawa и др. 13 будет применяться для этой цели после ориентации клетки можно управлять. Дальнейшие испытания вдоль этих линий должны быть перспективными.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят за их щедрую помощь с экспериментальной установки Шу Хасимото, Aoi Yoshida и Taeko Охта в Дошиша университете. Эта работа было поддержано KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) и программой MEXT-Supported Фонд стратегических исследований в частных университетах. Это исследование было также поддержано польского грант от знать (ведущий Национальный научно-исследовательский центр) научного консорциума «Здорового животного – безопасные продукты», решение министерства науки и высшего образования № 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
