Summary
Vi visar en ny metod för att konstruera en single-cell-baserad 3-dimensionell (3D) församling utan en konstgjord byggnadsställning.
Abstract
Regenerativ medicin och vävnadsteknik erbjuder flera fördelar för behandling av svårbehandlade sjukdomar, och flera studier har visat vikten av 3-dimensionell (3D) cellulär församlingar inom dessa områden. Konstgjorda byggnadsställningar har ofta använts för att konstruera 3D cellulära församlingar. Dock de ställningar som används för att konstruera cellulära församlingar är ibland giftiga och kan ändra egenskaperna för cellerna. Således skulle det vara fördelaktigt att upprätta en giftfri metod för att underlätta cell cell kontakt. I detta papper introducerar vi en ny metod för att bygga stabila cellulära sammansättningar med optisk pincett med dextran. En av fördelarna med denna metod är att det fastställer stabil cell till cell kontakt inom några minuter. Denna nya metod tillåter byggandet av 3D cellulära församlingar i en naturligt hydrofil polymer och förväntas vara användbar för att bygga nästa generations 3D encelliga församlingar inom regenerativ medicin och tissue engineering.
Introduction
Medan mänskliga vävnader består av flera aggregat av celler och kan bidra till att upprätthålla homeostas i kroppen, spela enstaka celler själva också viktiga roller via cell-till-cell interaktioner. Det är därför viktigt att belysa hur enstaka celler kan stimuleras av yttre signaler och hur de överföra sådana signaler till andra fastsittande celler. För detta ändamål, har flera metoder fastställts för byggandet av single-cell-baserad 3-dimensionell (3D)-sammansättningar1,2,3,4,5,6 ,7,8. De material som används för att konstruera cellulära församlingar kan dock fortfarande förbättras. Till exempel syntetiska geler och polymerer inklusive polyetylenglykol (PEG) besitter vissa kemiska fysikalisk-kemiska egenskaper och kan påverka målcellerna (t.ex. toxicitet).
Vi rapporterade nyligen ett nytt system som kan generera en single-cell-baserat 3D montering av celler använder dextran (DEX) genom att upprätta stabila cell-cell kontakt9. Vi ansåg att denna teknik kan vara användbar inom flera forskningsområden, bland annat regenerativ medicin och även cancerbiologi. I den här rapporten beskriver vi hur vi manipulera enstaka celler och konstruera 3-dimensionell (3D) cellulär församlingar i närvaro av olika hydrofil biomakromolekyler inklusive DEX utan en konstgjord byggnadsställning.
Protocol
1. beredning av celler
- Upprätthålla NAMRU mus bröstkörteln epitelceller (NMuMG celler) med 5 mL av D-MEM innehållande 10% (v) fetalt bovint serum (FBS) och 1 procent (v) Penicillin-Streptomycin (P/S) i en 25 cm3 kolv. Ta bort Dulbecco's modified örnens medium (D-MEM), som innehåller 10% FBS och 1% P/S.
- Lägga till 3-5 mL 37 ° C fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (-) i kolven. Observera att pH-värdet i PBS är 7.1-7.3.
- Ta bort alla PBS från kolven med en insugningsventil.
- Tillsätt 1,5 mL 37 ° C trypsin (0,25%, w/v) till kolven.
- Inkubera kolven i cirka 1-2 minuter vid 37 ° C i en CO2 inkubator.
- Tillsätt 3,5 mL D-MEM som innehåller 10% FBS och 1% P/S till kolven. Pipetten att blanda.
- Överföra cellsuspensionen till en 15 mL centrifugrör och centrifugera det i 3 min i rumstemperatur. Observera att rotation radien och rotationshastigheten i centrifugen är 16,6 cm 1500 rpm, respektive. Under detta tillstånd är den relativ centrifugalkraften 417 x g.
- Tillsätt 5 mL färsk D-MEM (10% FBS och 1% P/S) till kolven efter aspirera medium (om så krävs, frysa cellerna med frysförvaring lösning, efter tillverkarens anvisningar).
2. beredning av Dextran (DEX)
- Bereda 80 mg/mL DEX lösning genom att blanda 10 mL av D-MEM (10% FBS, 1%P/S) och 0,8 g DEX. Observera att DEX lösningen kan filtreras med en spruta filter (0,22 µm) efter cellerna har odlade för tillräckligt lång tid.
- Förbered en cellsuspension som innehåller 40 mg/mL DEX medium genom att blanda 200 µL DEX lösning och 200 µL cellsuspension beredd i 2.1. Observera att den numrera tätheten av celler i lösningen är cirka 2,3 × 105 celler/mL.
3. förberedelser för Laser och mikroskopi
- Slå på lasern (kontinuerlig våg, 1 064 nm våglängd) (figur 1en). Observera att användning av en laserstråle med en våglängd i röd till infrarött region är mest effektiva; denna våglängd kallas de diagnostiska och terapeutiska fönster10 eftersom det absorberas minimalt av celler.
- Dubbelklicka på ikonen för programvaran.
- Dubbelklicka på ikonerna för ① kamera, ② lysdiod (LED), ③ fokus justera och ④ flyttar scenen. Motsvarar ①-④ displayen visar upp (figur 1b).
4. cell Manipulation med hjälp av svällning
- Placera 20 µL av de prov som bereddes i steg 2.2 på botten täckglaset (0.17 mm tjocklek, storlek = 30 mm × 40 mm), och täck den med översta täckglaset (0.17 mm tjocklek, storlek = 18 mm × 18 mm), med separation som tillhandahålls av två distanser (0.17 mm tjocklek storlek = 10 mm × 24 mm), som visas i figur 2. Observera att dessa glasögon inte kräver en speciell beläggning.
- Placera provet cellen bereddes i steg 4.1 på det lägre objektivet (vatten nedsänkning med ca. 10 μl, förstoring = 60 X, arbetsavstånd = 0,28 mm, numerisk bländare = 1,2)).
- Fäst det övre objektivet (vatten nedsänkning med ca. 10 μl, förstoring = 60 X, arbetsavstånd = 2 mm, numerisk bländare = 1,0) överst i cellen provet.
- Slå på LED ljus genom att klicka på ikonen 2 (figur 1b).
- Justera avståndet mellan provet och det lägre objektivet genom att klicka på ikonerna på panelen 3 (figur 1b) tills den är i fokus.
- Bestråla laserstrålar på läge 1 och läge 2 (figur 1B) av provet genom att klicka på ikoner I, II och III (figur 1b).
- Ange intensiteten i varje laserstrålen till 1 500 mW genom att ange detta värde på ikonen IV (figur 1b).
- Flytta provet scenen genom att klicka på ikonen 4 indikerande riktningar (figur 1b) tills en cell är fångade på Position 1 (figur 1b).
- Dra markören som anger Position 2 (figur 1b) till en annan cell är fångade på Position 2.
5. byggande av en 3-dimensionell (3D) cellstruktur
- Manipulera en cell så att den är i kontakt med en annan cell. Upprätthålla detta villkor för 300 s; dvs varje cell utsätts för en laser för 300 s.
- Spela in X-Y-axeln visas i figur 1b.
- Konstruera en godtycklig 2D cell församling genom svällning och transportera en annan cell till cellerna.
- Konstruera en 3D cellulära församling genom att flytta scenen upp och ner.
- Bekräfta att församlingen förblir stabilt efter lasern är avstängd.
Representative Results
Figur 1 visar den Mikroskop och programvara som används i denna studie. Figur 2 är en schematisk representation av förfarandet för att placera provlösningen som innehåller celler. Figur 3 visar bildandet av en pyramidstruktur med dubbel-beam optisk pincett. Om försöket lyckas förblir dessa cellulära församlingar stabila även efter lasern är avstängd.
Figur 1 : (a) kontrollsystemet för Lasersystemet och svällning (NanoTracker2 (11)). Systemet aktiveras genom att vrida på växeln laser följande steg ①-③. (b) programvaran för att styra Lasersystemet och svällning. Kameran, LED ljus, fokus justera och flytta scenen aktiveras genom att klicka på ikoner ① ②, ③ och ④, respektive. Mikroskopiska bilden visas i panelen 1. På/av kontroll för att lampan är i panelen 2. Fokus är kontrollerad i panelen 3. Laserstrålar bestrålas på positioner 1 och 2 genom att klicka på ikoner I-IV. Detaljerna i denna Laser svällning Systemare föreskrivs i Ref. (12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa Principschema för att placera bilden glaset. 20 µL av provet (cellsuspension innehållande dextran) placeras i bilden och används för laser manipulation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : en) sammansättningar av epitelceller (NMuMG) avsedda formen i ett medium med DEX (40 mg/mL): en pyramid visas som ett exempel på ett 3D-kluster. b) en schematisk figur pyramid-formad 3D cellulära församlingens visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den aktuella studien visar en konkret tillämpning av våra senaste rapporter9,11 på användning av vattenlösliga polymerer för byggandet av 3D encelliga församlingar. Sådana sammansättningar bildas stabilt i bulk lösningen när antalet celler är upp till 10 och kan hållas av en enda laserstråle. Församlingar fällningen på glasytan när det finns mer än 10 celler. Även om experimenten är fortfarande i en primitiv fas, vi förväntar oss att den nya metoden kan vara ett kraftfullt verktyg för konstruktion av nästa generations 3D encelliga församlingar, som är oundgängliga för framsteg i fälten cellbiologi och regenerativ medicin.
En lösning innehållande någon polymer, celler stöter ifrån varandra på grund av den elektrostatisk repulsion uppkommer ytladdning, återfuktning repulsion kraft, glykokalyx repulsion effekt och membran vågformigheten. Vår tidigare studie visade att cellen par kan vara stabila under en lång tid när cellerna behandlas med PEG. Viktigare, antyder framgångsrika transport av en cell par till en region utan PEG, efter cellerna hade hållits i kontakt i 5 minuter i PEG, att cellulära kontakt upprätthålls på ett stabilt sätt. Detta är väl förklaras i termer av utarmning effekt11, och i huvudsak samma mekanism gäller de cellulära församlingarna som genererats med DEX9. Vår nuvarande resultaten tyder på att andra typer av naturliga makromolekyler också kunde användas att bygga stabila 3D cellulära församlingar.
För snabb transport av celler är koncentrationen av polymer viktigt. Generellt ökar viskositeten hos lösningen drastiskt när polymeren löses koncentration på överlappningen. Under detta tillstånd är det svårt att manipulera celler med hjälp av optisk pincett. Experimentet bör därför utföras under den överlappning koncentrationen. En DEX lösning, överlappning koncentrationen är ca. 50 mg/mL (kinetic viskositeten är 5,5 mm2/s). Som visas i Ref. 9, observerades en stabil cellulära församling när koncentrationen av DEX var 10 mg/mL till 40 mg/mL. Detta resultat tyder på att Uttunningen är tillräckligt stor för att upprätthålla stabila cell-cell kontakt även när DEX koncentrationen är lägre än den överlappning. Det har visats att tillägg av DEX inte påverkar cellernas viabilitet upp till 40 mg/mL 9.
Inrättandet av en metod för byggande av 3D cellulära församlingar är viktigt inom regenerativ medicin, sedan härma en i vivo cellulära närmiljön genom att strukturera enstaka celler kan underlätta stamceller-derived vävnad bildning. Hittills har vi använt detta protokoll för att konstruera cellulära sammansättningar med Neuro2A celler9 förutom NMuMG celler. Vi hoppas att etablera en experimentell metod för att konstruera 3D cellulära sammansättningar av ett större antal celler av olika morfologier. Optisk pincett systemet har utvecklats av Ichikawa o.a. 13 skulle vara tillämplig för detta ändamål eftersom inriktningen av cellerna kan styras. Ytterligare prövningar längs dessa linjer bör vara lovande.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Shu Hashimoto, Aoi Yoshida och Taeko Ohta vid Doshisha universitet för deras generösa hjälp med experimentella setup. Detta arbete stöddes av KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) och av programmet MEXT-Supported för Stiftelsen för strategisk forskning vid privata universitet. Denna studie stöddes också av en polsk bidrag från KNOW (ledande nationella forskningscentret) vetenskapliga konsortiet ”friska djur – säker mat”, beslut av ministeriet för vetenskap och högre utbildning nr 05-1-KNOW2-2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
