Summary
Vi viser en roman metode for å konstruere en enkelt-cellebasert 3-dimensjonale (3D) samling uten en kunstig stillaset.
Abstract
Regenerativ medisin og vev engineering tilbyr flere fordeler for behandling av problematiske sykdommer, og flere studier har vist betydningen av 3-dimensjonale (3D) mobilnettet samlinger i disse feltene. Kunstig stillaser har ofte blitt brukt til å lage 3D cellular samlinger. Men stillasene brukes til å konstruere mobilnettet samlinger er giftig og kan endre egenskapene til cellene. Således, det ville være fordelaktig å etablere en giftig metode for å tilrettelegge celle-celle kontakt. I dette papiret introdusere vi en ny metode for å konstruere stabile cellular samlinger ved hjelp av optisk pinsett med dekstran. En av fordelene med denne metoden er at den identifiserer stabil celle til celle kontakt innen få minutter. Denne nye metoden tillater bygging av 3D cellular samlinger i en naturlig hydrofile polymer og forventes å være nyttig for å bygge neste generasjon 3D encellede samlinger i regenerativ medisin og vev engineering.
Introduction
Mens menneskelig vev består av flere samlinger av celler og kan bidra til å opprettholde homeostase av kroppen, spille enkeltceller selv også viktige roller via celle til celle interaksjon. Derfor er det viktig å belyse hvordan enkeltceller stimuleret av eksterne signaler og hvordan de overføre slike signaler til andre tilhenger celler. For dette formålet, er flere metoder etablert for bygging av enkelt-cellebasert 3-dimensjonale (3D) samlinger1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imidlertid kan fortsatt materialene som brukes til å konstruere mobilnettet samlinger forbedres. For eksempel syntetiske gels og polymerer inkludert polyetylenglykol (PEG) har visse kjemiske mekanisk-egenskaper og kan påvirke målcellene (f.eks toksisitet).
Vi har nylig rapportert en roman system som kunne generere en enkelt-cellen-basert 3D-sammenstilling av celler ved hjelp av dekstran (DEX) ved å etablere stabil celle-celle kontakt9. Vi vurderte at denne teknologien kan være nyttig i flere forskningsfelt, inkludert regenerativ medisin og selv kreft biologi. I denne rapporten beskriver vi hvordan vi manipulere enkeltceller og lage 3-dimensjonale (3D) mobilnettet samlinger i nærvær av ulike hydrofile biomacromolecules inkludert DEX uten en kunstig stillaset.
Protocol
1. forberedelse av celler
- Opprettholde NAMRU musen melkekjertlene epitelceller (NMuMG celler) med 5 mL av D-MEM inneholder 10% (v) fetal bovin serum (FBS) og 1% (v) Penicillin-Streptomycin (P/S) i en 25 cm3 kolbe. Fjern Dulbecco endret Eagle's medium (D-MEM), som inneholder 10% FBS og 1% P/S.
- Legge til 3-5 mL 37 ° C fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (-) kolbe. Merk at pH i PBS 7.1-7.3.
- Fjern alle PBS fra flasken med en aspirator.
- Legge til 1,5 mL av 37 ° C trypsin (0,25%, w/v) kolbe.
- Inkuber kolbe for ca 1-2 minutter på 37 ° C i en CO2 inkubator.
- Legge til 3,5 mL av D-MEM inneholder 10% FBS og 1% P/S til kolbe. Pipetter å blande.
- Overføre celle suspensjon slik 15 mL sentrifuge og sentrifuge det i 3 minutter ved romtemperatur. Merk at rotasjon radiusen og rotasjonshastighet på sentrifugen 16,6 cm og 1500 rpm, henholdsvis. Under denne tilstanden er relativ sentrifugalkraften 417 x g.
- Legge til 5 mL av fersk D-MEM (10% FBS og 1% P/S) til kolbe etter aspirating mediet (eventuelt cryopreserve cellene med kryonisk bevaring løsning, følge retningslinjene fra produsenten).
2. forberedelse av dekstran (DEX)
- Forberede 80 mg/mL DEX løsning ved å blande 10 mL av D-MEM (10% FBS, 1%P/S) og 0,8 g av DEX. Merk at DEX løsningen kan filtreres med en sprøyte filter (0.22 µm) når cellene har kultivert lenge nok.
- Forberede en celle suspensjon som inneholder 40 mg/mL DEX medium ved å blande 200 µL DEX løsning og 200 µL av cellen suspensjon i 2.1. Antall tettheten av celler i løsningen er ca 2,3 × 105 celler/mL.
3. forberedelse til Laser og mikroskopi
- Slå på laser (kontinuerlig bølge, 1,064 nm wavelength) (figur 1en). Merk at bruk av en laserstråle med en bølgelengde på red til nær-infrarøde området er mest effektiv; Denne bølgelengdeområdet kalles diagnostiske og terapeutiske vinduet10 siden det er minimal absorbert av celler.
- Dobbeltklikk ikonet programvare.
- Dobbeltklikke ikonene for ① kameraet, ② lysdiode (LED), ③ fokus justere og ④ flytte scenen. Viser tilsvarer ①-④ vises (figur 1b).
4. celle manipulasjon ved hjelp av Laser overlapping systemet
- Sted 20 µL av utvalget utarbeidet i trinn 2.2 på bunnen dekket glasset (0,17 mm tykkelse, størrelse = 30 mm × 40 mm), og dekke det med topp cover glass (0,17 mm tykkelse, størrelse = 18 mm × 18 mm), med separasjon av to avstandsstykkene (0,17 mm tykkelse størrelse = 10 mm × 24 mm), som vist i figur 2. Merk at disse brillene ikke krever spesielt belegg.
- Plasser prøven cellen i trinn 4.1 på den nedre linsen (vann nedsenking med ca. 10 μl, forstørrelse = 60 X, arbeidsavstand = 0,28 mm, numerisk blenderåpning = 1.2)).
- Fest den øvre linsen (vann nedsenking med ca. 10 μl, forstørrelse = 60 X, arbeidsavstand = 2 mm, numerisk blenderåpning = 1.0) på toppen av prøven cellen.
- Slå på LED lys ved å klikke ikonet 2 (figur 1b).
- Justere avstanden mellom prøven og den lavere linsen ved å klikke ikonene på panelet 3 (figur 1b) til det er i fokus.
- Irradiate laserstråler posisjon 1 og posisjon 2 (figur 1B) av prøven ved å klikke ikoner I, II og III (figur 1b).
- Angi intensiteten på hvert laserstrålen til 1,500 mW ved å angi denne verdien på ikonet IV (figur 1b).
- Flytt utvalg scenen ved å klikke ikonet 4 angir retninger (figur 1b) til en celle er fanget på posisjon 1 (figur 1b).
- Dra markøren indikerer posisjon 2 (figur 1b) til en annen celle er fanget på posisjon 2.
5. bygging av en 3-dimensjonale (3D) cellestruktur
- Manipulere én celle slik at den er i kontakt med en annen celle. Opprettholde denne standarden for 300 s; dvs. hver celle er utsatt for en laser for 300 s.
- Registrere XY aksen vises i figur 1b.
- Konstruere en vilkårlig 2D celle samling av fangst og transport en annen celle til cellene.
- Konstruere et 3D cellular montering ved å flytte scenen opp og ned.
- Kontroller at samlingen forblir stabil etter Laseren slås av.
Representative Results
Figur 1 viser mikroskop og programvare som brukes i denne studien. Figur 2 er en skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for å plassere prøve løsningen inneholder celler. Figur 3 viser dannelsen av en pyramide struktur ved hjelp av dobbel-beam optisk pinsett. Hvis forsøket er vellykket, forbli disse mobilnettet samlinger stabile selv etter at Laseren slås av.
Figur 1 : (a) styresystem for Laser overlapping systemet (NanoTracker2 (11)). Systemet aktiveres ved å vri på bryteren laser følgende ①-③. (b) programvare for å kontrollere overlapping Lasersystemet. Kameraet, ledet lys fokus justere og flytte scenen er aktivert ved å klikke ikoner ①, ②, ③ og ④, henholdsvis. Mikroskopiske bildet vises i panelet 1. På/av-kontrollen til lampen er i panelet 2. Fokus er kontrollert i panelet 3. Laserstråler er bestrålt posisjoner 1 og 2 ved ikoner jeg IV. Detaljer om denne Laser fangst Systemare gitt i Ref. (12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant skjematisk for å plassere lysbildet glasset. 20 µL av prøven (celle suspensjon som inneholder dekstran) er plassert på lysbildet og brukt laser manipulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : en) samlinger av epitelceller (NMuMG) for en beregnet figur i et medium med DEX (40 mg/mL): en pyramide vises som et eksempel på en 3D-klynge. b) en skjematisk figur av pyramideformede 3D cellular vises også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Studien viser en konkrete søknaden vår siste rapporter9,11 på bruk av løselig polymerer for bygging av 3D encellede samlinger. Slike samlinger dannes stabilt i bulk løsningen når antall celler er opptil 10, og kan holdes av en enkelt laserstråle. Samlinger utløse på glassplaten når det er mer enn 10 celler. Selv om forsøkene er fortsatt i et primitivt Stadium, vi forventer at romanen metodikken kan være et kraftig verktøy for bygging av neste generasjon 3D encellede samlinger, som er uunnværlig for fremgang innen cellebiologi og regenerativ medisin.
I en løsning som inneholder ingen polymer, frastøte celler hverandre på grunn av den elektrostatisk frastøting fremkommer fra overflaten tillegget, hydration frastøting styrken, glycocalyx frastøting effekt og membran undulation. Vår forrige studie viste at cellen parene kan være stabil lenge når cellene behandles med PEG. Enda viktigere, antyder vellykket transport av noen celle til et område uten pinne, når cellene hadde blitt holdt i kontakt i 5 minutter i PEG, at mobilnettet kontakt blir opprettholdt i en stabil måte. Dette er godt forklart i uttømming effekt11, og i hovedsak den samme mekanismen gjelder mobilnettet samlingene generert bruker DEX9. Vår nåværende resultatene tyder på at andre typer naturlig makromolekyler kan også brukes til å konstruere stabil 3D cellular samlinger.
For rask transport av celler er konsentrasjonen av polymer viktig. Generelt, viskositeten av løsningen drastisk øker når polymer er oppløst over overlapping konsentrasjonen. Under denne tilstanden er det vanskelig å manipulere celler ved hjelp av optisk pinsett. Derfor bør eksperimentet utføres under overlapping konsentrasjonen. For en DEX løsning, overlapping konsentrasjonen er ca. 50 mg/mL (den kinetiske viskositeten er 5,52/s). Som vist i Ref. 9, ble en stabile cellular forsamling observert når konsentrasjonen av DEX var 10 mg/mL til 40 mg/mL. Dette resultatet antyder at uttømming effekten er stor nok til å opprettholde stabil celle-celle kontakt selv når DEX konsentrasjonen er lavere enn overlapping konsentrasjonen. Det har vist at tillegg av DEX ikke påvirker cellen levedyktigheten til 40 mg/mL 9.
Etablering av en metode for bygging av 3D cellular samlinger er viktig innen regenerativ medisin, siden etterligne en i vivo mobilnettet microenvironment ved å strukturere enkeltceller kan lette Stamcelle-avledet vev formasjon. Så langt har vi brukt den nåværende protokollen for å konstruere mobilnettet samlinger med Neuro2A celler9 i tillegg til NMuMG celler. Vi håper å etablere en eksperimentell metodikk for å konstruere 3D cellular samlinger av et større antall celler i ulike morphologies. Optisk pinsett systemet utviklet av Ichikawa et al. 13 ville være aktuelt for dette formålet siden retningen til cellene kan kontrolleres. Videre studier langs disse linjene skal lovende.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Shu Hashimoto, Aoi Yoshida og Taeko Ohta ved Doshisha University for deres generøse hjelp med eksperimentelle oppsett. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) og MEXT-Supported programmet for strategisk Research Foundation ved Private universiteter. Denne studien ble også støttet av polske stipend fra vet (ledende National Research Centre) vitenskapelige konsortiet "Sunt dyr - trygg mat", beslutning av departementet for vitenskap og høyere utdanning nr 05-1/KNOW2/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
