Summary
Wir zeigen eine neuartige Methode für das Konstruieren einer Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Montage ohne eine künstliche Gerüst.
Abstract
Regenerative Medizin und Tissue Engineering bieten mehrere Vorteile für die Behandlung von hartnäckigen Krankheiten, und mehrere Studien haben gezeigt, wie wichtig es ist, 3-dimensionale (3D) zellulären Baugruppen in diesen Bereichen. Künstliche Gerüste wurden oft zur zelluläre 3D-Baugruppen zu konstruieren. Allerdings verwendet, um zellulare Baugruppen erstellen Gerüste sind manchmal giftig und können ändern Sie die Eigenschaften der Zellen. Daher wäre es vorteilhaft, eine ungiftige Methode zur Erleichterung der Zell-Zell-Kontakt zu etablieren. In diesem Beitrag stellen wir Ihnen eine neue Methode für den Bau von stabiler zellulärer Baugruppen durch optische Pinzette mit Dextran. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es innerhalb weniger Minuten stabil Zell-Zell-Kontakt herstellt. Diese neue Methode ermöglicht den Bau von zellulären 3D-Baugruppen in ein natürliches hydrophiles Polymer und wird voraussichtlich für den Bau der nächsten Generation einzellige 3D-Baugruppen in den Bereichen der regenerativen Medizin und Gewebetechnik nützlich sein.
Introduction
Während menschliche Gewebe aus mehreren Baugruppen von Zellen bestehen und dazu beitragen können, die Homöostase des Körpers, einzelne Zellen selbst auch eine wichtige Rolle über Zell-Zell-Interaktion. Daher ist es wichtig, aufzuklären, wie einzelne Zellen durch externe Signale stimuliert werden können und wie sie solche Signale auf andere adhärenten Zellen übertragen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Methoden für den Bau von Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Baugruppen1,2,3,4,5,6 eingerichtet ,7,8. Die Materialien, die verwendet werden, um zelluläre Baugruppen konstruieren können jedoch noch verbessert werden. Zum Beispiel Polymere einschließlich Polyethylenglykol (PEG) und synthetischen Gele besitzen bestimmte chemische, physikalisch-chemischen Eigenschaften und Zielzellen (z. B. Toxizität) beeinträchtigen.
Wir berichteten vor kurzem ein neuartiges System, das eine Einzel-Zell-basierte 3D-Baugruppe mit Dextran (DEX) durch die Schaffung stabiler Zellezelle Kontakt9Zellen erzeugen könnte. Wir hielten diese Technologie in mehreren Forschungsbereichen, einschließlich der regenerativen Medizin und sogar Krebsbiologie nützlich sein könnte. In diesem Bericht beschreiben wir, wie wir einzelne Zellen zu manipulieren und 3-dimensionale (3D) zelluläre Baugruppen in Anwesenheit von verschiedenen hydrophilen Biomakromoleküle einschließlich DEX ohne eine künstliche Gerüst zu bauen.
Protocol
1. Vorbereitung der Zellen
- Pflegen Sie NAMRU Maus Brustdrüse epitheliale Zellen (NMuMG) mit 5 mL von D-MEM mit 10 % (V) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (V) Penicillin-Streptomycin (P/S) in einem 25 cm3 Kolben. Entfernen Sie Dulbecco geändert Adlers Medium (D-MEM) mit 10 % FBS und 1 % P/S.
- Fügen Sie 3-5 mL von 37 ° C Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (-) in den Kolben. Beachten Sie, dass der pH-Wert des PBS 7.1-7.3.
- Entfernen Sie alle PBS aus der Flasche mit einer Absauganlage.
- 1,5 mL 37 ° C Trypsin (0,25 %, w/V) in den Kolben hinzugeben.
- Ca. 1 bis 2 Minuten bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren Sie die Küvette.
- Fügen Sie 3,5 mL D-MEM mit 10 % FBS und 1 % P/S in den Kolben. Pipette zum Mischen.
- Die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beachten Sie, dass die Drehungsradius und die Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge 16,6 cm bzw. 1500 u/min, betragen. Unter dieser Bedingung ist die relative Zentrifugalkraft 417 X g.
- Fügen Sie 5 mL frisch D-MEM (10 % FBS und 1 % P/S) in den Kolben nach dem Absaugen des Mediums (ggf. Tiefgefrieren der Zellen mit Kryokonservierung Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers).
2. Vorbereitung von Dextran (DEX)
- Bereiten Sie 80 mg/mL DEX Lösung durch Mischen 10 mL von D-MEM (10 % FBS, 1%P/S) und 0,8 g Dex. Beachten Sie, dass die DEX-Lösung mit einer Spritze Filter (0,22 µm) gefiltert werden kann nach der Zellen für eine ausreichende Zeit kultiviert haben.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension mit 40 mg/mL DEX Medium durch Mischen von DEX Lösung 200 µL und 200 µL Zellsuspension in 2.1 vorbereitet. Beachten Sie, dass die Dichte der Zellen in die Lösung etwa 2,3 × 105 Zellen/mL.
3. Vorbereitung für Laser- und Mikroskopie
- Schalten Sie den Laser (kontinuierliche Welle, 1.064 nm Wellenlänge) (Abbildung 1(ein). Beachten Sie, dass die Verwendung von einem Laserstrahl mit einer Wellenlänge im roten Nahinfrarot-Region am effektivsten ist; dieser Wellenlängenbereich wird die diagnostische und therapeutische Fenster10 genannt, da es minimal von den Zellen aufgenommen wird.
- Doppelklicken Sie auf Software.
- Doppelklicken Sie auf die Symbole für Kamera ①, ② Light Emitting Diode (LED), ③ Fokus einstellen und ④ Bühne bewegen. Die Displays entsprechend ① ④ werden (Abbildung 1b) angezeigt.
(4) Zelle Manipulation mit dem Laser-Trapping-System
- Platz 20 µL der Probe vorbereitet in Schritt 2.2 auf der unteren Abdeckung Glas (0,17 mm Stärke, Größe = 30 mm × 40 mm), und mit dem oberen Deckglas abdecken (0,17 mm Stärke, Größe = 18 mm × 18 mm), mit Trennung von zwei Abstandshalter (0,17 mm Dicke zur Verfügung gestellt Größe = 10 mm × 24 mm), wie in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie, dass diese Gläser keine spezielle Beschichtung benötigen.
- Legen Sie die Sample-Zelle im Schritt 4.1 auf den unteren Objektiv vorbereitet (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 0,28 mm, numerische Apertur = 1,2)).
- Befestigen Sie die oberen Objektivlinse (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 2 mm, numerische Apertur = 1.0) am oberen Rand der Sample-Zelle.
- Schalten Sie die LED Licht durch Anklicken 2 (Abbildung 1b).
- Stellen Sie den Abstand zwischen der Probe und der unteren Objektiv durch Klicken auf die Symbole auf Platte 3 (Abbildung 1b) bis es im Fokus ist.
- Die Laserstrahlen auf Position 1 und Position 2 (Abbildung 1B) der Probe durch Klicken auf Symbole I, II und III (Abbildung 1b) zu bestrahlen.
- Stellen Sie die Intensität der einzelnen Laserstrahl auf 1.500 mW durch Eingabe dieser Value-at-Symbol IV (Abbildung 1b).
- Umzug der Probentisch, indem Sie auf Symbol 4 zeigt Richtungen (Abbildung 1b) bis eine Zelle an Position 1 (Abbildung 1b) gefangen ist.
- Ziehen Sie der Cursor auf Position 2 (Abbildung 1b) bis zu einer anderen Zelle an Position 2 gefangen ist.
(5) Bau einer 3-dimensionalen (3D) Zelle Struktur
- Eine einzelne Zelle zu manipulieren, so dass es in Kontakt mit einer anderen Zelle. Dieser Zustand für 300 s; d. h., jede Zelle einem Laser für 300 unterliegt, s.
- Notieren Sie die X-Y-Achse gezeigt in der Abbildung 1b.
- Konstruieren Sie eine beliebige 2D Cell Assembly durch Überfüllung und einer anderen Zelle, die Zellen zu transportieren.
- Konstruieren Sie eine zelluläre 3D-Baugruppe von der Bühne auf und ab bewegt.
- Bestätigen Sie, dass die Versammlung stabil bleibt, nachdem der Laser abgeschaltet ist.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt das Mikroskop und die Software, die in dieser Studie verwendet. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens für die Platzierung der Probenlösung, die Zellen enthält. Abbildung 3 zeigt die Bildung einer Pyramidenstruktur optische Pinzette Doppel-Strahl. Wenn das Experiment gelingt, bleiben diese zellulären Assemblys stabil, auch nachdem der Laser abgeschaltet wird.
Abbildung 1 : (a) das Kontrollsystem für das Trapping-Lasersystem (NanoTracker2 (11)). Das System wird aktiviert, indem Sie folgende Schritte ① ③ Laser-Schalter einschalten. (b) die Software für die Steuerung der Trapping-Lasersystem. Kamera, Licht, Scharfstellen und bewegliche Bühne durch Klicken auf Symbole ①, ② und ③ ④, bzw. aktiviert werden. Das mikroskopische Bild wird im Bedienfeld "1" angezeigt. An/aus-Steuerung für die LED ist im Bedienfeld "2". Der Fokus wird im Bedienfeld "3" gesteuert. Die Laserstrahlen werden an den Positionen 1 und 2 durch Klicken auf Symbole bestrahlt I bis IV. Dieser Laser Trapping Systemare Angaben im Ref (12). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Schaltplan für die Platzierung der Folie Glas. 20 µL der Probe (Zellsuspension mit Dextran) ist auf der Folie platziert und für Laser Manipulation verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : ein) Baugruppen der Epithelzellen (NMuMG) von einer Form in einem Medium mit DEX (40 mg/mL): eine Pyramide ist als ein Beispiel für ein 3D Cluster dargestellt. b) eine schematische Abbildung der pyramidenförmigen 3D zellulären Versammlung wird ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die vorliegende Studie zeigt eine konkrete Anwendung von unseren jüngsten Berichte9,11 auf die Verwendung von wasserlöslichen Polymeren für den Bau von einzelligen 3D-Baugruppen. Solche Baugruppen sind stabil in der Bulk-Lösung gebildet, wenn die Anzahl der Zellen bis zu 10 ist und mit einem einzigen Laserstrahl gehalten werden kann. Assemblys Niederschlag auf der Glasoberfläche, wann gibt es mehr als 10 Zellen. Obwohl die Experimente noch in einem primitiven Stadium sind, erwarten wir, dass die neuartige Methodik ein leistungsfähiges Werkzeug für den Bau der nächsten Generation 3D-Baugruppen einzellige sein könnte, die unerlässlich für den Fortschritt auf dem Gebiet der Zellbiologie sind und regenerative Medizin.
In einer Lösung enthalten kein Polymer abstoßen Zellen gegenseitig aufgrund der elektrostatischen Abstoßung der Oberflächenladung, die Hydratation Abstoßung Kraft der Glycocalyx Abstoßung Effekt und Membran Wellenbewegung aus. Unsere früheren Studie zeigte, dass Zelle Paare für eine lange Zeit stabil sein können wenn die Zellen mit PEG behandelt werden. Noch wichtiger ist, zufolge der erfolgreichen Transport eines Paares der Zelle zu einer Region ohne PEG, nachdem die Zellen in Kontakt für 5 Minuten in PEG, stattgefunden hatte zellulärer Kontakt stabil aufrechterhalten wird. Dies ist auch im Hinblick auf die Erschöpfung Effekt11, und im Wesentlichen der gleiche Mechanismus gilt für die zelluläre Assemblys generiert mit DEX9. Unsere aktuellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass andere Arten von natürlichen Makromolekülen auch verwendet werden, konnte um stabile zelluläre 3D-Baugruppen zu konstruieren.
Für den schnellen Transport von Zellen ist die Konzentration des Polymers wichtig. In der Regel erhöht die Viskosität der Lösung drastisch, wenn das Polymer über die Überlappung Konzentration gelöst ist. Unter diesen Bedingungen ist es schwierig, Zellen, die optische Pinzette zu manipulieren. Daher sollte das Experiment unter der Überlappung Konzentration durchgeführt werden. Für eine DEX-Lösung, die Überlappung Konzentration beträgt ca. 50 mg/mL (kinetische Viskosität ist 5,5 mm2/s). Wie in Nr. 9, wurde eine stabile zelluläre Versammlung beobachtet, wenn die Konzentration von DEX 10 mg/mL bis 40 mg/mL war. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Erschöpfung Wirkung ausreichend große, stabile Zellezelle Kontakt zu halten, auch wenn die DEX-Konzentration niedriger als die Überlappung-Konzentration ist. Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von DEX Zellviabilität bis zu 40 mg/mL 9nicht beeinträchtigt.
Die Festlegung einer Methode für den Bau von zellulären 3D-Baugruppen ist wichtig im Bereich der regenerativen Medizin, kann seit imitiert eine in Vivo zellulären Mikroumgebung von Einzelzellen Strukturierung Stammzellen gewonnenem Gewebe erleichtern Bildung. Bisher haben wir dieses Protokolls verwendet, zelluläre Baugruppen mit Neuro2A Zellen9 neben NMuMG Zellen zu konstruieren. Wir hoffen, eine experimentelle Methodik für den Bau von zellulärer 3D-Baugruppen einer größeren Anzahl von Zellen der verschiedenen Morphologien herzustellen. Das optische Pinzetten-System entwickelt von Ichikawa Et al. 13 wäre für diesen Zweck anwendbar sein, da die Ausrichtung der Zellen gesteuert werden kann. Weitere Versuche in dieser Richtung sollten vielversprechend sein.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Shu Hashimoto, Aoi Yoshida und Taeko Ohta an der Doshisha Universität für ihre großzügige Unterstützung mit dem Versuchsaufbau. Diese Arbeit wurde durch KAKENHI (15 H 02121, 15 K 05400, 25103012, 50587441) und das MEXT-Supported-Programm für die strategische Forschungsgemeinschaft an privaten Hochschulen unterstützt. Diese Studie wurde auch unterstützt durch einen polnischen Zuschuss aus dem Wissen (führende National Research Centre) wissenschaftlichen Konsortium "Gesunde Tiere – sichere Lebensmittel" Entscheidung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulwesen Nr. 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
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