Summary
والهدف من هذا الأسلوب إعداد ثقافة موتونيورونس الأولية (MNs) من الحبل الشوكي مورين التخصيب. لتقييم آثار الطفرات التي تسبب الأمراض مينيسوتا، يصف لنا هنا معزولة عزل هذه MNs وما تعداء من ماجنيتوفيكشن.
Abstract
نيوروديجينيريشن موتونيورونس العمود الفقري (MNs) المتورطة في طائفة واسعة من اضطرابات عصبية، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي ومرض شاركو-ماري الأسنان وضمور العضلات الشوكي، التي ترتبط كلها بضمور العضلات. الثقافات الأولية للعمود الفقري MNs استخدمت على نطاق واسع لإثبات تورط جينات محددة في مثل هذه الأمراض، وتميز بالآثار المترتبة على الطفرات الخلوية. هذا البروتوكول نماذج مينيسوتا أساسي الثقافة المستمدة من العمل المنوي هندرسون والزملاء منذ أكثر من عشرين عاماً. أولاً، أننا بالتفصيل طريقة تشريح قرون الأمامي من الحبل الشوكي من جنينا ماوس وعزل MNs من الخلايا باستخدام تدرج كثافة المجاورة. ثم، فإننا نقدم طريقة جديدة لكفاءة ترانسفيكتينج MNs مع البلازميدات التعبير باستخدام ماجنيتوفيكشن. أخيرا، نحن لتوضيح كيفية إصلاح وإيمونوستين الابتدائي MNs. استخدام الطفرات نيوروفيلامينت التي تسبب-شاركو ماري الأسنان المرض نوع 2، هذا البروتوكول يوضح نهجاً نوعيا للتعبير عن البروتينات للفائدة وتدرس مشاركتها في النمو MN، والصيانة، والبقاء على قيد الحياة.
Introduction
الأمراض العصبية العضلية تشمل مجموعة متنوعة من الأمراض سريرياً ووراثيا المتميزة التي تتميز بها تحوير العضلات و/أو الجهاز العصبي. وقد حددت مئات جينات المسؤولة عن هذه الاضطرابات النادرة بسبب التقدم في تكنولوجيا التسلسل، خلال العقد الماضي (قائمة متوفرة في مركز الأمراض نيوروموسكولار، http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). مجموعة متنوعة الطفرات التي تم تحديدها ويشير إلى أن الطفرات المختلفة في جين واحد يمكن أن يسبب تعمل المختلفة والأمراض1،،من23 والتي يمكن أن تنتج الطفرات في جينات مختلفة تعمل مماثلة 4 , 5-وفي هذا السياق، هناك جهود تبذل لتطوير نماذج الخلوية التي يمكن أن تصبح أدوات قوية لتحليل آثار الطفرة والآليات المرضية.
MNs العمود الفقري لديها اتفاقات كبيرة تقع في قرون البطني الحبل الشوكي، شكل محاور عصبية طويلة لاستهداف ألياف العضلات الهيكلية، وتسمح بالانتقال الطوعي من خلال إطلاق سراح أستيل في الوصلات العصبية العضلية. ولما MNs تتأثر بأمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض (CMT)، وضمور العضلات الشوكي، والدكتور هندرسون والزملاء وضع البروتوكول الأول6 يسمح بزراعة في المختبر MNs العمود الفقري واكتشاف نيوروتروفيك عامل جدنف7 (الخلية الدبقية مشتقة من نيوروتروفيك عامل). مكنت التحسينات التقنية منذ ذلك الحين لتنقية أكثر دقة MNs العمود الفقري والأنواع الفرعية الخاصة بها باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية8، ولكن يظل الإثراء بالتدرج كثافة قوية والمستخدمة على نطاق واسع في المختبرات التي تعمل حاليا مع MNs العمود الفقري الأولية 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وفي وقت لاحق، من الممكن أيضا الحصول على أعلى درجة تنقية مينيسوتا عن طريق إيمونوبانينج بالاستفادة من السطح علامة p75(NTR)15،،من1617.
الحبل الشوكي يحتوي على أنواع فرعية مختلفة من MNs عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر، فضلا عن الأعمدة موتور الوسطية والجانبية التي تختلف باختلاف مواقعها في القرن الأمامي على محور دورسو البطني ومن بين الأهداف التي يعصب8، 18-"مينيسوتا الأساسي" الثقافات يمكن استرداد كافة هذه الأنواع الفرعية مينيسوتا في نسب الفسيولوجية. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو انخفاض عدد MNs تم الحصول عليها في نهاية الإجراء؛ في الواقع، فإنه يمكن توقع الحصول على حوالي 105 MNs من الأجنة الستة، ومناسبة للفحص المجهري ولكن الحد لتجارب الكيمياء الحيوية. للقيام بتجارب مع أكثر فرعية موحدة ووفرة MNs (> 106 خلايا)، الجنينية المستمدة من الخلايا الجذعية MNs ينبغي النظر في18.
تعداء المتسلسلات البرية-نوع/المسخ أو الجينات الذاتية ضربة قاضية إلى MNs الرئيسي أداة سريعة ومفيدة لفك رموز مسارات فيسيوباثولوجيكال، لا سيما عندما لا تتوفر نماذج الماوس. ماجنيتوفيكشن أسلوب واحد للعصبية الأولية ترانسفيكتينج، شبيه ليبوفيكشن دون السمية العصبية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تعداء على الخلايا العصبية الناضجة بعد عدة أيام في المختبر، خلافا لتقنيات استناداً إلى انهانسر9. ومع ذلك، عيب واحد من هذه التقنية أن الخرز ربط الأحماض النووية في الثقافة، تسبب الضوضاء في وسم DAPI. العدوى الفيروسية المرجح هو الأسلوب الأكثر كفاءة ل MNs ترانسفيكتينج؛ ومع ذلك، لا يتطلب ماجنيتوفيكتيون بعض إجراءات السلامة اللازمة لإنتاج الفيروسية والعدوى الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقبلت اللجنة الأخلاقية التابعة للمؤسسة كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات.
1-حل إعداد
- إعداد 10 مل من 4% دياليزيد جيش صرب البوسنة في المتوسط L-15.
- حل مسحوق ألبومين المصل البقري في 4% (w/v) في 10 مل من L-15 المتوسطة.
- إضافة الحل إلى كاسيت الغسيل الكلوي 20 مل مع وقف كاتشين 20. دياليزي ضد 500 مل متوسطة L-15 لمدة 3 أيام تحت التحريض في 4 درجات مئوية. تغيير L-15 المتوسط كل يوم.
- تصفية الحل من خلال 0.22 ميكرومتر الغشاء وقاسمه في أنابيب 15 مل. تخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على المراجع التالية: غير معدلة المتوسطة L-15 الخام = L-15 المتوسطة، حمضية L-15 المتوسطة = pH L-15 والأساسية L-15 المتوسطة = L-15 بيكربونات.
- إعداد 200 مل من الأس الهيدروجيني L-15.
- ضبط الأس الهيدروجيني للوسط L-15: أولاً، ملء زجاجة المياه والصرف الصحي مع بعض قطع من الثلج الجاف. حقن الغاز (CO2) في المتوسط L-15 حتى يتحول اللون البرتقالي (~ الضغوط pH 6.4 و ~ 40). ويمكن تعديل درجة الحموضة أيضا مع مقياس الأس الهيدروجيني قياسي.
- تصفية المتوسطة من خلال 0.22 ميكرومتر الغشاء ومخزن في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
- تحضير 100 مل L-15 بيكربونات.
- إضافة 2.5 مل بيكربونات الصوديوم 7% لمل 97.5 من المتوسطة L-15 وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد الملاحق IPCS (الأنسولين بوتريسسين كونالبومين سيلينيت).
- حل 2.5 ملغم للأنسولين في 0.5 مل من 0.1 M HCl. إضافة 4.5 مل من الماء المقطر مزدوجة.
- حل 8 ملغ بوتريسسيني في 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
- حل 100 مغ كونالبومين في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- حل 1 مغ سيلينيت الصوديوم في 19.3 مل من الماء، وضبط ال pH إلى 7.4، وتمييع الحل 10 إضعاف.
- الجمع بين 0.1 مل من حل سيلينيت الصوديوم للحصول على 3.1 مل من محلول الملحق IPCS، 1 مل من كونالبومين، 1 مل من محلول الأنسولين و 1 مل من محلول بوتريسسيني. مخزن الحل عند-20 درجة مئوية.
- تعد حلاً البروجسترون 0.02 مم.
- حل 1 مغ البروجسترون في 1.6 مل إيثانول 80%.
- تمييع إيثانول 100% في 100-fold الحل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- تحضير 100 مل من إكمال L-15 المتوسطة.
- إضافة 1.8 مل من محلول د-الجلوكوز (200 مغ/مل) لمل 92 من الأس الهيدروجيني L-15 للحصول على تركيز نهائي 3.5 ملغ/مل جلوكوز.
- الجمع بين 1 مل 100 × البنسلين والستربتوميسين (10,000 U/mL)، 2 مل مصل الحصان إبطال الحرارة ومل 3.1 من مزيج IPCS 0.1 مل من محلول البروجسترون (2 × 10-5 م).
- تصفية المتوسطة في غشاء 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 5 مل من محلول (تركيز الأخير من 5.5 في المائة) من كثافة متدرجة كل تجربة.
- إضافة ميليلتر 476 المتوسطة الكثافة 60% التدرج التجارية إلى 4524 ميليلتر من L-15 (إذا كان ذلك ممكناً، دون الفينول الأحمر لزيادة التباين المرئي في الطور البيني؛ نسبة التخفيف من 1:10. 5).
- تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع أو تجميدها عند-20 درجة مئوية.
- إعداد 10 مل وسائط الثقافة.
- إضافة 200 ميليلتر من الملحق المتوسطة إلى 9.6 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
- إضافة 200 ميليلتر من مصل الحصان إبطال الحرارة (الذي يميل إلى التمييز بين السلائف الخلية الدبقية ويعمل ضد الانتشار) إلى 25 ميليلتر من الجلوتامين و 10 ميليلتر من 2-mercaptoethanol.
- تصفية وسائل الإعلام من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- إضافة نيوروتروفيك العوامل التالية: عامل نيوروتروفيك الهدبية (كنتف) بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل، والدماغ نيوروتروفيك المشتقة عامل (BDNF) والخلايا الدبقية نيوروتروفيك المشتقة (جدنف) بتركيزات النهائي من 1 نانوغرام/مليلتر.
- تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
- إعداد 50 مل من تشريح وسائط الإعلام.
- إضافة مل 2.25 الجلوكوز (200 مغ/مل) لمل 47.05 من حبس. إضافة ميليلتر 700 1 م حبيس مع درجة الحموضة 7.4. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل منهاج عمل 4%.
- حل 20 غراما من منهاج عمل بيجين في 500 مل من برنامج تلفزيوني.
- تحت غطاء كيميائية، الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم م 1 حتى يصبح الحل واضح.
- تصفية الحل عن طريق ورقة تصفية وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. تخزينها في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، حلول منهاج عمل تجارية أخرى يمكن استخدامها والمخفف بنسبة 4 في المائة في برنامج تلفزيوني.
- تنظيف أدوات التشريح بما في ذلك الملقط، والمقص، وأطباق سيليكون مع الإيثانول 70% قبل الاستخدام، ومع الصابون ومسح الماء بعد الاستخدام.
2-بولي-أورنيثيني/لامينين (ص. ب/لتر) طبق الطلاء
ملاحظة: وحدات التخزين يتم تكييفها لمعطف صفيحة 24-جيدا.
- إذا لزم الأمر، ضع ساترة عقيمة 12 مم في البئر.
- معطف الآبار مع 500 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل بولي-L-Ornithine الحل المذابة في الماء.
- واسمحوا الآبار التي تستقر عند درجة حرارة الغرفة ح 1.
- إزالة الحل بولي-L-Ornithine وأيردري لمدة 30 دقيقة.
- معطف الآبار بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 500 ميليلتر من 3 ميكروغرام/مل لامينين في بيكربونات L-15.
ملاحظة: يمكن تخزين آبار في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام في الحاضنة. إينكوبيشنز طويلة، مشيراً إلى برنامج تلفزيوني العقيمة بين الآبار يمكن أن يساعد على تجنب التبخر متوسطة.
3-تشريح
- التضحية بماوس حوامل عند الأجنة في المرحلة الجنينية E12.5. تنظيف البطن مع الإيثانول 70%.
- إزالة الرحم بقطع أوفيدوكتس اثنين والمهبل ووضعه في طبق بتري مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة (دون Ca2 + Mg2 +).
- جمع جميع الأجنة ونقلها إلى الطازجة، برنامج تلفزيوني الباردة (دون Ca2 + Mg2 +) في طبق بتري.
- وضع الجنين واحد في صحن المغلفة بالسيليكون ومليئة بالإعلام تشريح (مع هبس والجلوكوز 4.5 غرام/لتر، ومم 7 هيبيس الأس الهيدروجيني 7.4).
ملاحظة: يتم إجراء تشريح الجنين تحت مجهر باستخدام الملقط غرامة نظيفة ومقص. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام طبق بيتري عادية دون سيليكون للتشريح. - إزالة الرأس والذيل، والأحشاء، باستخدام الملقط كالمقص.
- الحفاظ على الجنين بالبطن ضد السيليكون بالملقط.
- مع زوج ثاني من الملقط، أدخل واحدة من النصائح في القناة المركزية للحبل الشوكي روسترال.
- إغلاق الملقط تمزق الأنسجة الظهرية بضعة ملليمترات.
- كرر هذه العملية نحو الجانب والذيلية حتى النخاع الشوكي كامل مفتوح (الشكل 1B).
- فصل الجزء روسترال من النخاع الشوكي (جذع المخ) من الجسم.
- دورة الجنين إلى الحفاظ على الحبل الشوكي مفتوحة ضد السيليكون.
- قرصه الجزء روسترال من الحبل الشوكي وسحب الجنين بالرأس لاستخراج النخاع الشوكي.
ملاحظة: السحايا والعقد الجذرية الظهرية (باﻷسعار) ينبغي أن تظل متمسكة بالجنين. وبخلاف ذلك، بعناية سحب بعيداً أي باﻷسعار لا تزال تعلق على الحبل الشوكي والسحايا المتبقية. في هذه الخطوة، يمكن أيضا جمع باﻷسعار لثقافة العصبية الحساسة (انظر المناقشة). - شد الحبل الشوكي على السيليكون وإزالة نصف الظهرية الحبل بالقطع على طول الوسط من كل جانب باستخدام مشرط. قص الجزء الأوسط إلى 10 أجزاء باستخدام مشرط، ونقل القطع إلى أنبوب جديد.
4-الحبل الشوكي تعليق خلية
- كرر هذا الإجراء تشريح للحبال الشوكي 6 إلى 8.
- واسمحوا الحبل الشوكي القطع جمع في الجزء السفلي من الأنبوب واستبدالها هبس 1 مل من لحم الخنزير-F10 المتوسطة.
- إضافة 10 ميليلتر من التربسين (2.5% w/v؛ تركيز نهائي 0.025%). احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- لإيقاف عملية الهضم الأنزيمي، نقل الأجزاء إلى أنبوب 15 مل جديد يحتوي على 800 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
- تريتوراتي مرتين من قبل يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. الشظايا تسوية لجمع الحد الأدنى 2 المادة طافية في أنبوب جديد 15 مل.
- للشظايا، إضافة 900 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة و 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
- تريتوراتي 6 مرات من يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. واسمحوا الشظايا تسوية للحد الأدنى 2 إضافة المادة طافية إلى أنبوب 15 مل التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5.
- للشظايا، إضافة 900 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة و 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
- تريتوراتي 10 مرات من يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. واسمحوا الشظايا تسوية للحد الأدنى 2 إضافة المادة طافية إلى أنبوب 15 مل التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5. المضي قدما مع المادة طافية.
- بلطف باستخدام بيبيت P1000، ضع وسادة 4% (w/v) جيش صرب البوسنة 2 مل في الجزء السفلي من أنبوب طافية. الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 2 مل من إكمال L-15 المتوسطة.
5-مينيسوتا الإثراء بكثافة التدرج
- تقسيم تعليق خلية في أنبوبين 15 مل (1 مل في كل). ثم أضف 2 مل من إكمال L-15 المتوسطة. إذا بدءاً من 6 أجنة، استخدم ما يعادل 3 أجنة كل أنبوب في 3 مل متوسطة.
- إضافة 2 مل من محلول التدرج كثافة بإضافة الحل ببطء إلى الجزء السفلي من كل أنبوبة للحصول على واجهة حادة.
- الطرد المركزي في 830 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة، يجب أن تكون خلايا صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، بينما يجب أن تكون الخلايا الكبيرة مثل MNs في واجهة الحل المتدرجة والمتوسطة الكثافة.
- جمع الخلايا في الواجهة يسفط 1 أو 2 مل وتحويلها إلى أنبوب جديد 15 مل. ضبط حجم الصوت إلى 10 مل مع L-15 الأس الهيدروجيني المتوسطة.
- إضافة 2 مل وسادة جيش صرب البوسنة 4% إلى القيعان من أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 3 مل من إكمال L-15 المتوسطة.
- كرر الخطوة 5، 5.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من إكمال الثقافة المتوسطة. حساب عدد الخلايا والبقاء تحت مجهر تباين المرحلة مع هيموسيتوميتير.
ملاحظة: للحبال الشوكي 6، عدد الخلايا من المتوقع أن يكون حوالي 1 × 105 MNs.
6-مينيسوتا الثقافة
- تمييع MNs للكثافة المناسبة، عادة ما 5,000 إلى 10,000 الخلايا في 500 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا.
ملاحظة: بذر الكثافة حول الخلايا 30,000 و 1500 6-96 جيدا ولوحات، على التوالي. - إزالة الحل لامينين مع P1000.
- نقل على الفور MNs المخفف في الثقافة المتوسطة إلى لوحات طلاء لتجنب التجفيف.
- احتضان الثقافة لمدة يومين في 37 درجة مئوية.
7-ماجنيتوفيكشن MNs
ملاحظة: في الخطوات التالية، تختص بالكميات المستخدمة تعداء بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا. الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة على البروتوكول المتعلق بتنسيق آخر.
- لإعداد الحمض النووي، ريسوسبيند 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميليلتر من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة ودوامه ل 5 ق.
- لإعداد أنبوب حبة، ريسوسبيند ميليلتر 1.5 من الخرز في 50 ميليلتر من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
- إضافة حل حبة 50 ميليلتر للحل الحمض النووي 50 ميليلتر واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الحجم الإجمالي = 100 ميليلتر).
- خلال هذه الحضانة، سحب 100 ميليلتر من مستنبت من البئر التي سوف تكون ترانسفيكتيد.
ملاحظة: وضع لوحة مغناطيسية في الحاضنة الدافئة إلى 37 درجة مئوية. - نقل 100 ميليلتر من مزيج الحمض النووي/حبة للبئر، واحتضان اللوحة 20 – 30 دقيقة على لوحة مغناطيسية عند 37 درجة مئوية.
- انتظر 24 ساعة على الأقل قبل الكشف عن التعبير كدنا.
8-تثبيت وتلطيخ
- أغسل ثقافة 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان ثقافة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 4% PFA/برنامج تلفزيوني.
- أغسل ثقافة 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الثقافة في 500 ميليلتر من حظر المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 4%، 2% طبيعية مصل، 0.3% X-100 تريتون، جليكاين م 0.1) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ينبغي أن تستمد المصل العادي من نفس النوع كجسم الثانوية (مثلاً، مصل الماعز العادي). - احتضان ثقافة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع جسم الابتدائي المخفف في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر.
ملاحظة: على سبيل المثال، يستخدم TUJ1 في 1/1000، SMI32 يتم استخدام مبلغ 000 1/1، ويستخدم Lc3b في 1/200. - أغسل ثقافة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الثقافة مع الأضداد الثانوي مترافق fluorophore المخفف في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة.
- أغسل ثقافة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام المتوسط المتصاعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد 24 ساعة في الثقافة، إبداء موتونيورونس (MNs) الفعل النمو محواري كبيرة (على الأقل 6 مرات أطول من حجم سوما). وفي الأيام التالية، محاور عصبية وينبغي أن تواصل نموها وعرض التفريع (الشكل 2). سوف يكون هناك مورفولوجيس مختلفة نظراً لخصوصيات النوع الفرعي. على سبيل المثال، يكون العمود الوسيط MNs يعصب العضلات المحورية محاور عصبية أقصر وتشعبت أكثر مما MNs عمود المحرك الأفقي الذي يعصب العضلات أطرافهم18.
مؤخرا، قد استخدمت هذه العزلة وتثقيف التقنيات الموضحة أعلاه تميز طفرة جديدة في الجين نيوروفيلامينت نيفة يؤدي نموذج محواري مهيمنة جسمية CMT13. في هذه الحالة، يومين بعد الطلاء، المنقي MNs تم transfected مع البلازميدات ترميز نموذج متحولة من نيفة تنصهر فيها اجفب أو البرية من نوع النموذج تنصهر فيها اجفب. يومين في وقت لاحق، متحولة نيفة-اجفب تشكيل المجاميع على طول شبكة cytoskeletal. أربعة أيام بعد ماجنيتوفيكشن، تطورت هذه المجاميع في أجريسومي بيرينوكلير بارزة التي تحتوي على علامة أوتوفاجيك LC3b (الشكل 3). وهذا النهج سمح لنا بإثبات أن النموذج المسخ من نيفة الناجمين عن تشكيل المجاميع المرتبطة بمسارات أوتوفاجيك في MNs الرئيسي.
رقم 1: نظرة عامة على خطوات الإجراء الرئيسي- يتم تشريح الأجنة الماوس (A) E12.5 لاستخراج القرن البطني للحبل الشوكي. ثم يتم فصل الخلايا العصبية من الخلايا القرن البطني وهي تنقية MNs بكثافة التدرج قبل الطلاء. وأخيراً، MNs transfected من ماجنيتوفيكشن وتحليلها بعد بضعة أيام. (ب) الخطوة الأولى في تشريح النخاع الشوكي عندما يتم فتح لوحة سقف من الحبل الشوكي على طول المحور rostro والذيلية مع الملقط. بعد ذلك، يتم فصل النخاع الشوكي من الجسم عن طريق سحب الجذع الدماغي. عند هذه النقطة، لا يزال على الجسم الجنينية السحايا والعقد الجذرية الظهرية (DRG). يتم قطع الجزء الظهري للحبل الشوكي طوليا مع مشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ثقافة الممثل MN. (أ) مورفولوجيا MNs بعد 4 أيام ثقافة التي كشفت عنها تلطيخ السلسلة الثقيلة نيوروفيلامينت الذاتية غير فوسفوريلاتيد (SMI32). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) MNs مورفولوجيا بعد 4 أيام في المختبر و transfected للتحوير اجفب من ماجنيتوفيكشن في اليوم الثاني. وقد كونتيرستينيد MNs مع علامة SMI32 أو علامة عموم العصبية Tuj1. تظهر الأسهم اتفاقات للخلايا العصبية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: [كنفوكل] صور ماجنيتوفيكتيد MNs معربا عن نيفة اجفب البرية من نوع أو متحولة بنيات (باللون الأخضر) والملون لعلامة أوتوفاجيك LC3b (باللون الأحمر). تظهر الأسهم نيفة اجفب متحولة المجاميع البروتين التي هي أيضا من LC3b إيجابية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الصور تم تعديلها من جاككوير et al. عام 2017، Acta نيوروباثولوجيكا الاتصالات13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واحدة من النقاط الحرجة في هذا البروتوكول أن يتم تشريح الأجنة الماوس في إطار زمني دقيق خلال التنمية (E12.5) لتحسين مقدار MNs تم الحصول عليها في النهاية. وبالإضافة إلى ذلك، للعائد الأمثل، ينبغي إجراء التشريح في الصباح أو بعد الظهر. قبل E12.5 (مثلاً، في E11.5)، تشريح الصعبة، لا سيما فيما يتعلق بالقضاء السحايا. بعد E12.5، يسقط عدد MNs تم الحصول عليها إلى حد كبير. للتحكم في مراحل تطور الجنين، من الإناث والذكور أولاً توضع معا في نهاية اليوم. في صباح اليوم التالي، يتم فصل الكبار، والإناث يتم التحقق من وجود أحد المكونات المهبلية. في حالة وجود أحد المكونات، عند هذه النقطة تعتبر الأجنة في اليوم E0.5 للتنمية. لهذه التجارب، ونحن عادة استخدام خط ماوس نشطة ومنتجة. استخدمت المتكفل مصدرها مستعمرة ولدت في ولاية ميسوري في هذا البروتوكول، وكان اسمه السلالة CF1 (مزارع كاروورث سلالة 1). وقدم هذه السلالة في "فرنسا مختبرات نهر تشارلز" في عام 1967، وأنها اكتسبت اسم OF1 (فرنسا أونسينس 1).
نقطة الحرجة ثانية هي الخطوات الطرد المركزي التي تؤثر إلى حد كبير على نقاء الثقافة. MNs تمثل نسبة منخفضة من خلايا النخاع الشوكي (حوالي 1 في المائة)، والهدف الحصول على ثقافة تتضمن MNs 40 إلى 50 في المائة فيما بين الخلايا العصبية الأخرى العمود الفقري وأقل من 5% الخلية الدبقية موروث. لرصد مدى فعالية سينتريفوجيشنز، الخلية عينات تعليق المكتسبة من قبل وبعد كل خطوة يمكن أن يكون مطلي في المتوسط MNs لمدة 24 ساعة، متبوعة بتحديد وتلطيخ للتعبير عن علامات العصبون Hb9 (81.5C10، دشب) أو جزيرة ليلى-1/جزيرة ليلى-2 (ISL1/ 40.2D6 2،/39.4D5، دشب)، تحديد تركيبات الذي يتدنى MNs مختلفة19. في MNs أكثر نضجاً، علامات أخرى مثل ترانسفيراز أسيتيل الكولين (المحادثة، Ab144P) أو ح نيوروفيلامينت غير فوسفوريلاتيد (SMI 32 ف) يمكن استخدامها لتقدير نوعية الثقافة. هو بديل جيد لرصد فعالية تنقية بسرعة استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن الأخضر الفلورسنت البروتين التجارة والنقل على وجه التحديد في MNs. على سبيل المثال، ويتشتيرلي والزملاء سبق أن وضعت الفئران المعدلة وراثيا معربا عن التجارة والنقل الخاضعة لسيطرة الماوس مروج Hb9 (يسمى أيضا Hlxb9 أو Mnx1)18. الفئران المعدلة وراثيا Hb9::GFP عرض التعبير مميزة للتجارة والنقل في dendrites، ومحاور عصبية، واتفاقات MNs العمود الفقري من يوم الجنينية 9.5 إلى 10 يوم بعد الولادة.
MNs يتطلب النمو على الركازة متساهلة التي حصل عليها بولي-L-Ornithine وطلاء لامينين. اعتماداً على الظروف التجريبية، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من البلاستيك والبوليمر، وحاويات المستندة إلى الزجاج (مثلاً 6-، 24-، لوحات 96-جيدا، والزجاج كوفيرسليبس، أو الدائرة الشرائح). ومن بين هذه الخيارات، قد تكون أجهزة موائع جزيئية من الاهتمام لمعالجة مسائل محددة تتعلق بتشكيل المشبك أو التوجيه والنقل محواري20. من المعروف أن حساسية للتغيرات في المكروية تلك التي تنطوي على أنماط، عوامل التركز، التغييرات الميكانيكية في الركازة (مثلاً، صلابة) والضغط الهائل، والعظة التدرج الزمانية المكانية (مثل الطبوغرافية MNs ميزات، والزخرفة من الأسطح بمواد من مختلف الانتماءات الخلوية). منصات موائع جزيئية هي النظم التي يمكن أن تدمج الشروط المتعددة العوامل، مما يسمح لتحديد ميكرونفيرونمينتس الخلوية الأمثل.
منذ اكتشاف جدنف لبقاء آثار7، يتزايد عدد نيوروتروفيك العوامل الداخلة في MN الأولية النمو والبقاء على قيد الحياة، والتوجيه وتطوير محاور عصبية، ويحفز من اللدونة متشابك. من المثير للاهتمام، كل عامل يعمل يتدنى محددة MNs8. على سبيل المثال، قد وصف كنتف لحماية العمود الوسيط السيارات (MMC) التي إينيرفاتيس العضلات المحورية، بينما هجف الأفعال على عمود المحرك الأفقي (LMC) التي إينيرفاتيس العضلات أطرافهم. من ناحية أخرى، تظهر جدنف وبدنف النشاط المؤيد بقاء الأقوى على شعوب بأكملها من MNs. وأخيراً، الجمع بين جدنف وبدنف وكنتف كافية لحماية أكثر من 70 في المائة من عدد سكانها المليون ويستخدم عادة في المختبرات.
في الظروف القياسية الثقافة، MNs يمكن الاحتفاظ المختبر في إلى 14 يوما بالاستعاضة عن نصف وسائل الإعلام الثقافة مع وسائط جديدة مرة كل 3 أيام، بدءاً من اليوم الخامس للثقافة. أثناء نضج في المختبر ، يمكن أن تكون transfected MNs ماجنيتوفيكشن في أي وقت باستخدام هذا البروتوكول. قد التضمين الكفاءة والسمية لهذا الأسلوب بطبيعة والبلازميدات وإدراج. وفي حالتنا، عندما أجرى ماجنيتوفيكشن على الثقافة مينيسوتا بعد يومين في المختبر باستخدام بلازميد 9 كيلو بايت مع مروج كاجس (بكاجين21) مراقبة كدنا نيوروفيلامينت، لاحظنا متوسط ± 31.48% 9.94 (الانحراف المعياري) ترانسفيكتيد MNs تعداء بعد 48 ساعة. ومع ذلك، لثوابت أخرى، ينبغي اختبار نسبة مختلفة من الحمض النووي/الخرز كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. معلمة أخرى التي قد تؤثر على كفاءة مستوى تعداء هو نضوج MNs مع مرور الوقت. وفي الواقع، خلال أول 3 أيام من الثقافة، نمو محاور عصبية وتوسيع اتفاقات سيحدث، مما يزيد من مساحة السطح حيث سيتم اختراق الخرز. هذه المعلمة يمكن زيادة الكفاءة تعداء مينيسوتا مع مرور الوقت أثناء النضج.
أخيرا، بالمقارنة مع الثقافات MN، سيكون من المثير للاهتمام أن زراعة الخلايا العصبية الحسية22،،من2324. على وجه الخصوص، هو مرض شاركو-ماري الأسنان اعتلال أعصاب الحركية حسية تتميز بضمور العضلات البعيدة المتصلة بانحطاط MNs العمود الفقري على حد سواء، والخلايا العصبية الحسية من باﻷسعار. من المثير للاهتمام، باﻷسعار الموجودة على جانبي الحبل الشوكي ويمكن أن تكون التي تم جمعها أثناء إجراء تشريح نفسها المستخدمة للحصول على MNs. وفي هذا الصدد، من الممكن مقارنة الآليات الفيزيولوجية المرضية في العمل في هذه الخلية ذات الصلة نوعين، موتونيورونس والرسم من الخلايا العصبية الحساسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر "الرابطة من أجل le neurogénétique de la التنمية" للدكتور جاككوير للزمالات وفؤاد-الحفل الخيري لدعمها من خلال الخطة الاستراتيجية ميونيورالب. كما نود أن نشكر الدكتور كريس هندرسون، الدكتور وليام Camu والدكتور بريجيت بيتمان، الدكتور سيدريك راؤول والدكتور جورج هاس، الذين شاركوا في تطوير وتحسين هذه التقنية ونشر هذه المعرفة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
