Summary
Målet med denna teknik är att förbereda en höganrikat kultur av primära motoneurons (MNs) från murina ryggmärgen. För att utvärdera konsekvenserna av mutationer som orsakar MN sjukdomar, vi beskriver här isoleringen av dessa isolerade MNs och deras transfection av magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration av spinal motoneurons (MNs) är inblandad i ett stort spektrum av neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Charcot-Marie-Tooth sjukdom och spinal muskelatrofi, som är alla associerade med muskelatrofi. Primära kulturer av spinal MNs har använts allmänt att demonstrera medverkan av specifika gener i sådana sjukdomar och karakterisera cellulära konsekvenserna av deras mutationer. Detta protokoll modeller en primär MN kultur härstammar från Henderson och kollegor nyskapande arbete mer än tjugo år sedan. Det första detalj vi en metod att dissekera de främre hornsna av ryggmärgen från en mus embryo och isolera MNs från angränsande celler med hjälp av en täthetlutning. Sedan, vi presenterar ett nytt sätt att effektivt transfecting MNs med uttrycket plasmider använder magnetofection. Slutligen, vi illustrera hur fixar och immunostain primära MNs. använda neurofilament mutationer som orsakar Charcot-Marie-Tooth sjukdom typ 2, detta protokoll visar en kvalitativ metod att uttrycka proteiner av intresse och studera deras deltagande i MN tillväxt, underhåll och överlevnad.
Introduction
Neuromuskulära sjukdomar omfattar en mängd kliniskt och genetiskt distinkta patologier som kännetecknas av förändringen av muskler och/eller nervsystemet. På grund av framsteg inom sekvensering teknik, hundratals gener ansvariga för dessa sällsynta sjukdomar har identifierats under det senaste decenniet (lista finns på det Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Olika identifierade mutationer indikerar att olika mutationer i en gen kan orsaka olika fenotyper och sjukdomar1,2,3 och att mutationer i olika gener kan producera liknande fenotyper 4 , 5. i detta sammanhang finns det insatser för att utveckla cellular-modeller som kan bli kraftfulla verktyg för att analysera mutation konsekvenser och patologiska mekanismer.
Spinal MNs har stora somas ligger i ventrala hornsna av ryggmärgen, bildar långa axoner inrikta skeletala muskelfibrer och möjliggöra frivilliga rörelser genom frisättning av acetylkolin i neuromuskulära korsningar. Eftersom MNs påverkas av neuromuskulära sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros, utvecklat Charcot-Marie-Tooth sjukdom (CMT), och spinal muskelatrofi, Dr Henderson och kollegor det första protokoll6 som tillåtna för odling av in vitro- spinal MNs och upptäckten av neurotrofa faktor GDNF7 (glial cell härledd neurotrofisk faktor). Tekniska förbättringar sedan dess har tillåtit för exaktare rening av spinal MNs och deras undertyper som använder FACS8, men anrikning av täthetlutningen förblir kraftfulla och används i laboratorier som arbetar med primära spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. därefter är det också möjligt att erhålla betyget högre MN rening genom immunopanning genom att utnyttja ytan markör p75(NTR)15,16,17.
Ryggmärgen innehåller olika subtyper av cervix, bröstkorg och ryggradens MNs, liksom median och laterala motor kolumner som skiljer sig åt mellan deras läge i främre horn på en dorso-ventrala axel och bland målen innerverar de8, 18. primära MN kulturer kan återställa alla dessa MN undertyper i fysiologiska proportioner. Den största begränsningen av denna teknik är det låga antalet MNs erhålls vid slutet av förfarandet. i själva verket kan det förväntas få cirka 105 MNs från sex embryon, som passar för mikroskopi men begränsande för biokemi experiment. Att utföra experiment med mer standardiserade subtyper och riklig MNs (> 106 celler), embryonala stamceller-derived MNs övervägas18.
Transfection wild-type/mutant transgener eller knockdown endogena gener till primära MNs är ett snabbt och användbart verktyg för att dechiffrera physiopathological vägar, särskilt när musmodeller är inte tillgängliga. Magnetofection är en teknik för transfecting primära nervceller, liknar lipofection utan den relaterade neurotoxicitet. Transfection kan dessutom utföras på mogna nervceller efter flera dagar i vitro, till skillnad från tekniker som bygger på elektroporation9. En nackdel med denna teknik är dock att pärlorna binder nukleinsyror i kultur, orsakar buller i DAPI märkning. Virusinfektioner är sannolikt den mest effektiva tekniken för transfecting MNs; magnetofection kräver dock inte vissa säkerhetsrutiner som krävs för viral produktion och cellulära infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur godkändes av den etiska kommittén till institutionen.
1. lösningen förberedelse
- Förbereda 10 mL 4% BSA dialyseras i l-15 medium.
- Lös bovint serumalbumin pulver 4% (w/v) i 10 mL av l-15 medium.
- Lägga till lösningen i en 20 mL dialys kassett med en 20 kDa cut-off. Dialyze mot 500 mL l-15 medium i 3 dagar under agitation vid 4 ° C. Ändra det l-15-mediet varje dag.
- Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm membran och delprov i 15 mL rör. Förvara rören vid-20 ° C.
Obs: Detta protokoll använder följande referenser: omodifierade raw l-15-medium = l-15 medium, surt l-15-medium = pH l-15 och l-15 bassubstratet = bikarbonat l-15.
- Förbereda 200 mL pH l-15.
- Justera pH-värdet i det l-15-mediet: först fylla en tvättflaska med några bitar av torr-is. Injicera gas (CO2) i l-15 medlet tills färgen blir orange (~ pH 6,4 och ~ 40 trycket). PH-värdet kan också justeras med standard pH-mätare.
- Filtrera mediet genom ett 0,22 µm membran och förvaras vid 4 ° C för en månad.
- Bereda 100 mL bikarbonat l-15.
- Tillsätt 2,5 mL 7% natriumbikarbonat till 97,5 mL l-15 medium och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda de IPCS (Insulin Putrescin Conalbumin selenit) kosttillskott.
- Lös upp 2,5 mg insulin i 0,5 mL av 0,1 M HCl. Add 4,5 mL dubbeldestillerat vatten.
- Lös 8 mg dimetylsulfat i 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Lös 100 mg conalbumin i 10 mL PBS.
- Lös 1 mg natrium selenit i 19,3 mL vatten, justera pH till 7,4 och späd lösningen 10-faldigt.
- Kombinera insulin lösning 1 mL, 1 mL dimetylsulfat lösning, 1 mL conalbumin och 0.1 mL natrium selenit lösning att erhålla 3,1 mL IPCS komplement lösning. Förvara lösningen vid-20 ° C.
- Bered en 0,02 mM progesteron.
- Lös 1 mg progesteron i 1,6 mL 80-procentig etanol.
- Späd lösningen 100 gånger i 100% etanol och lagra den på-20 ° C.
- Bereda 100 mL komplett l-15-medium.
- Lägga till 1,8 mL av D-glukos lösning (200 mg/mL) 92 mL pH l-15 att erhålla en slutlig koncentration på 3,5 mg/mL glukos.
- Kombinera 1 mL 100 x Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 2 mL Värmeinaktiverade häst serum, 3,1 mL IPCS mix och 0,1 mL av progesteron lösning (2 x 10-5 M).
- Filtrera på medellång på 0,22 µm membran och förvara den vid 4 ° C.
- Förbereda 5 mL täthet lutning lösning (slutlig koncentration på 5,5%) per experiment.
- Lägga till 476 µL av kommersiella 60% täthet lutning medium 4524 µL av l-15 (om möjligt, utan röd fenol öka visuell kontrasten på interphasen; utspädningsfaktor på 1:10. 5).
- Förvara lösningen vid 4 ° C i 2 veckor eller frysa den vid-20 ° C.
- Förbereda 10 mL odlingssubstrat.
- Tillsätt 200 µL av tillägg medium till 9,6 mL neuron cellodlingsmedium.
- Tillsätt 200 µL Värmeinaktiverade häst serum (som tenderar att skilja glial cell prekursorer och arbetar mot spridning) i 25 µL av glutamin och 10 µL av 2-merkaptoetanol.
- Filtrera media genom ett 0,22 µm filter.
- Lägg till följande neurotrofa faktorer: ciliär neurotrofisk faktor (CNTF) med en slutlig koncentration på 10 ng/mL, och hjärnan härledd neurotrofisk faktor (BDNF) och glial cell härledd neurotrofisk faktor (GDNF) i slutliga koncentrationer på 1 ng/mL.
- Förvara materialet vid 4 ° C.
- Förbereda 50 mL dissektion media.
- Tillsätt 2,25 mL glukos (200 mg/mL) till 47.05 mL HBSS. Tillsätt 700 µL av 1 M HEPES med pH 7,4. Förvara materialet vid 4 ° C.
- Förbered en lösning med 4% i PFA.
- Lös 20 g PFA i 500 mL PBS.
- Under en kemisk huva, värm lösningen till 60 ° C och tillsätt några droppar av 1 M NaOH tills lösningen blir klar.
- Filtrera lösningen genom filterpapper och justera pH-värdet till 7,2. Förvara den vid-20 ° C.
Obs: Alternativt andra kommersiella PFA-lösningar kan användas och efter utspädning 4% i PBS.
- Rengör verktygen dissektion inklusive peang, sax och silikon rätter med 70% etanol innan användning, och med tvål och rent vatten efter användning.
2. poly-ornitin/Laminin (Po/L) maträtt beläggning
Obs: Volymer är anpassade till pälsen en 24-bra platta.
- Om det behövs, lägga ett sterilt 12 mm täckglas i brunnen.
- Coat brunnarna med 500 µL 10 µg/mL Poly-L-Ornithine lösning upplöst i vatten.
- Låt brunnarna nöja 1 tim i rumstemperatur.
- Ta bort Poly-L-Ornithine lösningen och lufttorka i 30 min.
- Coat brunnarna över natten vid 37 ° C med 500 µL 3 µg/mL laminin i bikarbonat l-15.
Obs: Brunnar kan lagras vid 37 ° C i 7 dagar i inkubatorn. För lång inkubationer, kan lägga sterila PBS mellan brunnarna hjälpa för att undvika medium avdunstning.
3. dissektion
- Offra en gravid mus när embryona är på embryostadiet E12.5. Ren magen med 70% etanol.
- Ta bort livmodern genom att skära de två oviducts och vagina och lägga den i en petriskål fylld med kall PBS (utan Ca2 + Mg2 +).
- Samla alla embryon och överföra dem till färsk, kall PBS (utan Ca2 + Mg2 +) i en petriskål.
- Sätt ett embryo i en skål överdragna med silikon och full av dissektion media (med HBSS, 4,5 g/L glukos och 7 mM HEPES pH 7,4).
Obs: Embryo dissektion utförs under ett Mikroskop med rena fina pincett och sax. En regelbunden petriskål utan silikon kan alternativt användas för dissektion. - Ta bort huvud, svans, och inälvor, använda pincett som sax.
- Upprätthålla embryot med magen mot silikon med pincett.
- Med ett par pincett, infoga ett av tipsen i den centrala kanalen i rostralt ryggmärgen.
- Stäng tången för att riva den dorsala vävnaden några millimeter.
- Upprepa åtgärden mot den kaudala sidan tills hela ryggmärgen är öppen (figur 1B).
- Lossa rostralt delen av ryggmärgen (cerebral stam) från kroppen.
- Slå ett embryo för att upprätthålla öppna ryggmärgen mot silikon.
- Nypa rostralt delen av ryggmärgen och dra embryot av huvudet för att extrahera ryggmärgen.
Obs: Hjärnhinnor och dorsala rotganglier (DRGs) bör förbli kopplade till embryot. Annars, dra försiktigt bort eventuella återstående hjärnhinnor och DRGs fortfarande kopplad till ryggmärgen. I detta steg, kan DRGs också samlas för känsliga neuron kultur (se diskussion). - Platta till ryggmärgen på silikon och ta bort den dorsala halvan av sladden genom att skära längs mitten av varje sida med en skalpell. Skär den mellersta delen i 10 bitar med en skalpell och överföra bitar till en ny tub.
4. ryggmärgen cellsuspension
- Upprepa proceduren dissektion för 6 till 8 ryggmärg.
- Låt ryggmärgen bitar samla på botten av röret och ersätta HBSS med 1 mL av Ham-F10 medium.
- Tillsätt 10 µL av trypsin (2,5% w/v; slutliga koncentrationen 0,025%). Inkubera röret under 10 minuter vid 37 ° C.
- För att stoppa enzymatisk nedbrytning, överföra fragment till en ny 15 mL tub som innehåller 800 µL av komplett l-15-medium, 100 µL av 4% (w/v) BSA och 100 µL av DNAS (1 mg/mL i l-15 medium).
- Hackad två gånger av aspirering 1 mL med pipett P1000. Låt fragment nöja sig med 2 min. samla supernatanten i en färsk 15 mL tub.
- Fragment, lägga till 900 µL av komplett l-15-medium, 100 µL av 4% (w/v) BSA och 100 µL av DNAS (1 mg/mL i l-15 medium).
- Pulverisera 6 gånger av aspirering 1 mL med pipett P1000. Låt fragment nöja sig med 2 min. Lägg supernatanten till 15 mL röret erhölls i steg 4,5.
- Fragment, lägga till 900 µL av komplett l-15-medium, 100 µL av 4% (w/v) BSA och 100 µL av DNAS (1 mg/mL i l-15 medium).
- Pulverisera 10 gånger av aspirering 1 mL med pipett P1000. Låt fragment nöja sig med 2 min. Lägg supernatanten till 15 mL röret erhölls i steg 4,5. Fortsätt med supernatanten.
- Använder en P1000 Pipettera, Placera försiktigt en 2 mL BSA 4% (w/v) kudde på botten av supernatanten tube. Centrifugera vid 470 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 2 mL av komplett l-15-medium.
5. MN anrikning av Gradient densitet
- Dela cellsuspensionen i två 15 mL rör (1 mL). Sedan, tillsätt 2 mL av komplett l-15-medium. Om du börjar med 6 embryon, använder du motsvarande 3 embryon per rör 3 ml medium.
- Tillsätt 2 mL av täthet lutning lösning genom att långsamt lösningen till botten av varje rör att få en skarp gränssnitt.
- Centrifugera vid 830 x g i 15 min i rumstemperatur. Efter detta steg, bör små celler vara på botten av röret, stora celler såsom MNs bör vara på gränssnittet täthet lutning lösning/medium.
- Samla in cellerna på gränssnittet genom att aspirera 1 eller 2 mL och överföra dem till en färsk 15 mL tub. Justera volymen till 10 mL med l-15 pH medium.
- Tillsätt 2 mL av 4% BSA dynan till botten av röret och centrifugera vid 470 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 mL komplett l-15-medium.
- Upprepa steg 5,5.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 mL komplett odlingsmedium. Räkna antalet celler och lönsamhet under en fas kontrast Mikroskop med en hemocytometer.
Obs: För 6 ryggmärg, antalet cell beräknas vara runt 1 x 105 MNs.
6. MN kultur
- Späd MNs till den lämpliga djurtäthet, oftast 5.000 till 10.000 celler i 500 µL av odlingsmedium per brunn i en 24-bra platta.
Obs: Sådd densitet är runt 30 000 och 1 500 celler för 6 - och 96-bra plattor, respektive. - Ta bort laminin lösningen med en P1000.
- Omedelbart överföra de MNs utspätt i odlingsmedium plattorna beläggning för att undvika uttorkning.
- Inkubera kulturen i 2 dagar vid 37 ° C.
7. Magnetofection av MNs
Obs: I följande steg, de kvantiteter som används är avsedda för transfection av ett väl 24-bra platta. Hänvisas till tillverkarens protokollet för ett annat format.
- För DNA beredning, Omsuspendera 1 µg av DNA i 50 µL av neuronala odlingsmedium och virvel för 5 s.
- För bead tube förberedelse, Återsuspendera 1,5 µL av pärlor i 50 µL av neuronala odlingsmedium.
- Tillsätt 50 µL pärla lösningen till 50 µL DNA lösningen och Inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur (total volym = 100 µL).
- Under denna inkubation, att frånträda den brunn som kommer vara transfekterade 100 µL av odlingsmedium.
Obs: Satte magnetiska plattan i inkubatorn att värma det till 37 ° C. - Överför 100 µL av DNA/pärla mix till brunnen och inkubera plattan 20 – 30 min på den magnetiska tallriken vid 37 ° C.
- Vänta minst 24 h innan upptäckt av cDNA uttryck.
8. fixering och färgning
- Tvätta kulturen 2 gånger med PBS.
- Inkubera kulturen i 20 min vid rumstemperatur i 4% PFA/PBS.
- Tvätta kulturen 2 gånger med PBS.
- Inkubera kulturen i 500 µL blockerande buffert (PBS, 4% BSA, 2% normala serum, 0.3% Triton x-100, 0.1 M glycin) för 1 h i rumstemperatur.
Obs: Normalt serum bör härledas från samma art som den sekundära antikroppen (t.ex. Normal get Serum). - Inkubera kulturen över natten vid 4 ° C med primär antikropp utspädd i 250 µL blockerande buffert.
Obs: till exempel TUJ1 används på 1/1000, SMI32 används vid 1/1 000, och Lc3b används vid 1/200. - Tvätta kulturen 3 gånger med PBS.
- Inkubera kulturen med fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar utspädd i 250 µL blockerande buffert i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta kulturen 3 gånger med PBS.
- Montera på glasskivor med monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 24 timmar i kulturen, bör motoneurons (MNs) visar redan betydande axonal tillväxt (minst 6 gånger längre än soma storlek). I de följande dagarna, bör axoner fortsätta att växa och Visa förgrening (figur 2). Det kommer att finnas olika morfologier på grund av subtyp särdrag. Exempelvis har medianvärdet kolumn MNs som innerverar axial musklerna kortare och mer förgrenade axoner än laterala motor kolumn MNs som innerverar lem muskler18.
Dessa isolering och odlingsskålar tekniker som beskrivs ovan har nyligen använts för att karakterisera en ny mutation i genen neurofilament NEFH som orsakar en autosomal dominerande axonal form av CMT13. I det här fallet var två dagar efter plätering, renat MNs transfekterade med plasmider kodning antingen en muterad form av NEFH till andra eller formuläret vildtyp smält till andra. Två dagar senare, mutant NEFH-andra bildade aggregat längs cytoskeletal nätverket. Fyra dagar efter magnetofection, dessa aggregat utvecklats i en framstående perinukleära aggresome innehållande LC3b autophagic markören (figur 3). Detta tillvägagångssätt tillät oss att visa att den muterade formen av NEFH inducerad bildandet av aggregat som är associerade med autophagic vägar i primära MNs.
Figur 1: översikt över procedur huvudsteg. (A), E12.5 musembryon är dissekeras för att extrahera den ventrala hornen av ryggmärgen. Sedan nervceller från ventrala horn cellerna dissocieras och MNs renas av täthetlutningen före plätering. Slutligen, MNs transfekterade av magnetofection och analyseras efter några dagar. (B) det första steget i ryggmärgen dissektion är när taket plattan av ryggmärgen öppnas längs rostro-kaudala axeln med pincett. Sedan, ryggmärgen är fristående från kroppen genom att dra den cerebrala stammen. Vid denna punkt, kvar hjärnhinnor och dorsala rotganglier (DRG) på embryonala kroppen. Den dorsala delen av ryggmärgen skärs longitudinellt med en skalpell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa MN kultur. (A) MNs morfologi efter 4 dagars kultur avslöjas genom färgning av endogena icke-fosforyleras neurofilament tung kedja (SMI32). Skalstapeln = 100 µm. (B) MNs morfologi efter 4 dagar i vitro och transfekterade för andra transgenens av magnetofection på dag 2. MNs var counterstained med markören SMI32 eller pan-neuronala markören Tuj1. Pilarna visar somas av nervceller. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Confocal bilder av magnetofected MNs uttrycker vildtyp eller muterade andra-NEFH konstruerar (i grönt) och målat för autophagic markören LC3b (i rött). Pilarna visar mutant andra-NEFH protein aggregat som också LC3b positiva. Skalstapeln = 10 µm. bilder ändras från Jacquier et al. 2017, Acta Neuropathologica kommunikation13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de kritiska punkterna i detta protokoll är att musembryon är dissekeras på en exakt tidsfönster under utveckling (E12.5) för att optimera mängden MNs erhålls vid slutet. Dessutom för optimal avkastning, bör dissektion utföras på morgonen eller tidigt på eftermiddagen. Innan E12.5 (t.ex. på E11.5) är dissektion svårt, särskilt när det gäller eliminering av hjärnhinnorna. Efter E12.5 sjunker antalet erhållna MNs. För att styra det embryo utvecklingsstadiet, är vuxna honor och hanar först placerade tillsammans i slutet av dagen. Nästa morgon, vuxna avgränsas och honor kontrolleras för förekomsten av en vaginal plugg. Om en kontakt är närvarande, anses embryon på denna punkt i E0.5 dagen i utveckling. För dessa experiment använder vi oftast en mus linje som är kraftfull och produktiv. Föräldraparets med ursprung från en koloni uppvuxna i Missouri användes i detta protokoll, och stammen hette CF1 (Carworth gårdar stam 1). Denna stam infördes vid Charles River Laboratories Frankrike 1967, och det fick namnet 1 (Oncins Frankrike 1).
En andra kritisk punkt är de centrifugering steg som kraftigt påverkar renheten av kulturen. MNs utgör en låg andel av ryggmärgen celler (omkring 1%), och målet är att få en kultur som innehåller 40 till 50% MNs bland andra spinal neuronala celler och mindre än 5% glial cell stamfäder. Att övervaka effekten av centrifugations, cell suspension prover förvärvade före och efter varje steg kan beläggas i MNs medium för 24 timmar, följt av fastställande och färgning av uttryck för motorneuronen markörer Hb9 (81.5C10, DSHB) eller holme-1/holme-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), vars kombinationer definiera olika MNs subpopulation19. På mer mogna MNs, kan andra markörer såsom kolin acetyltransferas (chatt, Ab144P) eller Neurofilament H icke-fosforyleras (SMI - 32 P) användas för att uppskatta kvaliteten på kulturen. Ett bra alternativ för att snabbt övervaka effekten av rening är att använda transgena möss som uttrycker det grönt fluorescerande Protein (GFP) specifikt i MNs. Till exempel utvecklat Wichterle och kollegor tidigare transgena möss uttrycker GFP kontrolleras av musen Hb9 (även kallad Hlxb9 eller Mnx1) arrangören18. Hb9::GFP transgena möss visar distinkt uttryck av GFP i dendriter, axoner och somas av spinal MNs från embryonala dag 9,5 till postnatal dag 10.
MNs kräver tillväxt på ett tillåtande substrat som erhålls genom Poly-L-Ornithine och laminin beläggningen. Beroende på försöksbetingelser, en mängd plast-, polymer- och glas-baserade behållare kan användas (t.ex. 6-, 24-, 96 brunnar tallrikar, glas coverslips eller kammare diabilder). Bland dessa alternativ, kan ultrakalla enheter vara av intresse att ta itu med specifika frågor angående synaps bildandet eller axonal vägledning och transport20. MNs är kända för att vara känslig för förändringar i sin mikromiljö där mönster, koncentration faktorer, mekaniska förändringar i substratet (t.ex. stelhet), ren stress och spatiotemporal gradient cues (t.ex. topografiska funktioner, mallning av ytor med ämnen av olika cellulära tillhörighet). Mikroflödessystem plattformar finns system som kan integrera multifaktoriell förhållanden, vilket möjliggör bestämning av optimala cellulära mikromiljö.
Sedan upptäckten av GDNFS överlevnad effekter7växer antalet neurotrofa faktorer inblandade i MN initial tillväxt och överlevnad, vägledning och utveckling av axoner och inducerande av synaptisk plasticitet. Varje faktor verkar intressant, på en specifik subpopulation av MNs8. Till exempel har CNTF beskrivits för att skydda median motor kolumnen (MMC) som innerverar axial muskler, medan HGF agerar på den laterala motor kolumnen (LMC) som innerverar lem muskler. Däremot, visar både GDNF och BDNF den starkaste Pro överlevnad aktiviteten på hela populationer av MNs. Slutligen, kombinationen av GDNF, BDNF och CNTF är tillräcklig för att skydda mer än 70% av en MN befolkning och används ofta i laboratorier.
I standard odlingsbetingelser, kan MNs hållas in vitro upp till 14 dagar genom att ersätta hälften av kultur media med färska media en gång var 3 dagar, start från den femte dagen av kultur. Under i vitro mognad, kan MNs vara transfekterade av magnetofection när som helst med detta protokoll. Effektivitet och toxicitet av denna teknik kan moduleras av arten av de plasmider och skär. I vårt fall, när magnetofection utfördes på MN kultur efter 2 dagar i vitro som använder en 9 kb plasmid med en CAGGS promotor (pCAGEN21) styra neurofilament cDNA, vi observerade ett genomsnitt av 31,48% ± 9,94 (standardavvikelse) av transfekterade MNs 48 timmar efter transfection. Ändå, för andra konstruktioner, DNA/pärlor olika förhållandet bör testas som beskrivs i tillverkarens protokollet. En annan parameter som kan påverka transfection nivå effektivitet är mognaden av MNs över tid. Faktiskt under de första 3 dagarna av kultur, kommer att tillväxt av axoner och utvidgningen av somas uppstå, som ökar ytan där pärlor kommer att penetrera. Denna parameter kan öka MN transfection effektivitet över tiden under mognad.
Slutligen, i jämförelse med MN kulturer, det skulle vara intressant att odla sensoriska nervceller22,23,24. Charcot-Marie-Tooth sjukdom är särskilt en sensorisk motorisk neuropati kännetecknas av distala muskelatrofi relaterade till degeneration av både spinal MNs och sensoriska nervceller i DRGs. intressant, DRGs ligger på båda sidor av ryggmärgen och kan vara som samlats in under förfarandet för samma dissektion som används för att erhålla MNs. I detta avseende är det möjligt att jämföra de patofysiologiska mekanismerna vid arbete i dessa två relevanta celltyper, motoneurons och DRG känsliga nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka de ”Association pour le développement de la neurogénétique” för Dr. Jacquier's fellowship och AFM-Telethon för dess stöd genom MyoNeurAlp strategisk plan. Vi vill också tacka Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul och Dr Georg Haase, som deltog i utveckla och förbättra tekniken och sprida sin kunskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
