Summary
Цель этой методики – подготовить высокообогащенного культуры первичной мотонейронов (MNs) из мышиных спинного мозга. Чтобы оценить последствия мутации, вызывая заболевания MN, мы опишем здесь изоляции эти изолированные MNs и их transfection magnetofection.
Abstract
Нейродегенеративные мотонейронов спинного мозга (MNs) причастны широкого спектра неврологических расстройств, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб и спинальной мышечной атрофии, которые все связаны с мышечной атрофии. Основной культуры позвоночника МНБ использовали широко продемонстрировать участие конкретных генов в таких заболеваний и характеризуют сотовой последствия их мутаций. Эта культура модели первичной MN протокол производным от семенных работы Хендерсон и коллег более двадцати лет назад. Во-первых мы подробно метод рассечения передней рогах спинного мозга от зародыша мыши и изолировать MNs из соседних клеток, с использованием градиента плотности. Затем мы представляем новый способ эффективно transfecting MNs с плазмид выражение, с помощью magnetofection. Наконец мы показываем, как исправить и имунноконтраст первичной MNs. Использование neurofilament мутации, которые вызывают болезнь Шарко-Мари-зуб типа 2, этот протокол свидетельствует качественный подход к выражением протеинов интереса и изучение их участие в MN роста, техническое обслуживание и выживания.
Introduction
Нервно-мышечные заболевания охватывают разнообразные клинически и генетически различных патологий, которые характеризуются изменения мышц и нервной системы. Из-за достижения в области технологий виртуализации, сотни генов, ответственных за эти редкие заболевания были выявлены в ходе последнего десятилетия (список доступных в центре нейромышечные болезнь, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Разнообразие выявленных мутаций указывает, что различные мутации одного гена может привести к разному фенотипы и болезней1,2,3 и что мутации в различных генов может производить аналогичные фенотипов 4 , 5. в этом контексте, являются усилия по развитию сотовой модели, которые могут стать мощные инструменты для анализа последствий мутации и патологических механизмов.
Позвоночника MNs имеют большие СОСМ, расположенный в вентральной рогов спинного мозга, длинные аксоны форме скелетных мышечных волокон, и позволяют добровольных движений через освобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Так как MNs страдают от нервно-мышечных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб (CMT), и спинальной мышечной атрофии, д-р Хендерсон и коллеги разработали первый протокол6 , что позволило для выращивания в пробирке позвоночника MNs и открытие нейротрофических факторов GDNF7 (глиальных клеток производных нейротрофических факторов). Технические усовершенствования тех пор позволило для более точной очистки позвоночника MNs и их подтипы, использование СУИМ8, но обогащения градиент плотности остается мощным и широко используется в лабораториях, в настоящее время работает с основной позвоночника МНБ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Впоследствии, это также возможно для получения более высокого класса очистки MN через immunopanning, воспользовавшись поверхности маркер p75(НТР)15,16,17.
Спинной мозг содержит различные подтипы шейного, грудного и поясничного отдела МНБ, а также средний и боковые мотор столбцы, которые отличаются среди их расположение в передней рога на оси dorso вентральной и среди целей они иннервируют8, 18. основной MN культур можно восстановить все эти подтипы MN в физиологических пропорциях. Основным ограничением этой методики является низкое количество МНБ, полученные в конце процедуры; в самом деле можно ожидать, чтобы получить около 105 MNs из шести эмбрионов, которая подходит для микроскопии, но ограничения для биохимии экспериментов. Для выполнения экспериментов с более стандартизированной подтипы и обильные MNs (> 106 клеток), эмбриональных стволовых клеток, полученных MNs следует рассматривать18.
Трансфекция диких тип/мутант трансгенов или эндогенных генов нокдаун в первичной MNs является быстрый и полезный инструмент для расшифровки выкидышей пути, особенно когда мышь модели недоступны. Magnetofection является методика transfecting первичной нейронов, похож на липофекция без соответствующих нейротоксичности. Кроме того transfection может выполняться на зрелых нейронов после нескольких дней в пробирке, в отличие от методов, основанных на электропорации9. Однако один из недостатков этого метода является бисер привязать нуклеиновых кислот в культуре, вызывая шум в маркировке DAPI. Вирусная инфекция, вероятно, наиболее эффективным методом для transfecting МНС; Однако magnetofection не требует определенных процедур обеспечения безопасности, необходимые для вирусных производства и клеточных инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных были приняты этического комитета учреждения.
1. решение подготовка
- Подготовка 10 мл 4% BSA dialyzed в L-15 среде.
- Альбумина bovine сыворотки порошок на 4% (w/v) растворяют в 10 мл L-15 среды.
- Добавьте решение в 20 мл диализа кассету с 20 кДа отсечения. Dialyze против 500 мл L-15 среды для 3 дней при агитации на 4 ° C. Изменение среднего L-15 каждый день.
- Фильтр решение через 0,22 мкм мембраны и Алиготе в 15 мл пробирок. Хранить трубы при-20 ° C.
Примечание: Этот протокол использует следующие ссылки: неизмененном сырья среднего L-15 = Средний L-15, кислой среде L-15 = pH L-15 и основные L-15 Средний = бикарбоната L-15.
- Подготовка 200 мл рН L-15.
- Отрегулируйте рН среды L-15: во-первых, заполнить мыть бутылку с некоторыми частями сухого льда. Придать L-15 среднего газа (CO2), до тех пор, пока цвет превращает оранжевый (~ давления pH 6.4 и ~ 40). PH можно также отрегулировать с стандартный pH метр.
- Фильтр средних 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C на один месяц.
- Подготовка 100 мл L-15 бикарбоната.
- Добавьте 2.5 мл 7% бикарбоната натрия 97,5 мл L-15 среды и хранить при 4 ° C.
- Подготовьте МПХБ (инсулин Putrescin Conalbumin селенит) добавки.
- Растворите 2,5 мг инсулина в 0,5 мл 0,1 М HCl. добавить 4,5 мл двойной дистиллированной воды.
- Растворите 8 мг путресцин в 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
- Растворите 100 мг conalbumin в 10 мл ФСБ.
- Растворить 1 мг натрия селенит в 19,3 мл воды, скорректировать рН 7,4 и разбавить раствор 10 раз.
- 1 мл раствора инсулина, 1 мл раствора путресцин, 1 мл conalbumin и 0,1 мл раствора натрия селенит для получения 3.1 мл раствора дополнение МПХБ объединяйте. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
- Приготовляют раствор прогестерона 0,02 мм.
- Растворите 1 мг прогестерона в 1,6 мл 80% этанола.
- Разбавить раствор 100-кратного в 100% этанола и хранить его при-20 ° C.
- Подготовка 100 мл полного среднего L-15.
- Добавьте 1.8 мл раствора D-глюкозы (200 мг/мл) 92 мл рН L-15 для получения окончательного концентрация составляет 3,5 мг/мл глюкозы.
- Объединить 1 мл 100 x пенициллин-стрептомицином (10000 ед/мл), 2 мл сыворотки тепла инактивированная лошадь, 3.1 мл смеси МПХБ и 0,1 мл раствора прогестерона (2 x 10-5 М).
- Фильтр средство на 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C.
- Подготовьте 5 мл раствора (конечная концентрация 5,5%) плотность градиента в эксперимент.
- 476 мкл коммерческой среды градиента 60% плотность 4524 мкл L-15 (если это возможно, без красных фенола увеличить визуальный контраст в интерфазе; коэффициент разрежения 1:10. 5).
- Хранят раствор при температуре 4 ° C на 2 недели или заморозить его при-20 ° C.
- Подготовка 10 мл культуры средств массовой информации.
- Добавьте 200 мкл дополнения средних 9,6 мл среды культуры клетки нейрона.
- Добавьте 200 мкл тепла инактивированная лошадь сыворотки (которая стремится дифференцировать глиальных клеток прекурсоров и работает против распространения) 25 мкл глутамина и 10 мкл 2-меркаптоэтанол.
- Фильтр СМИ через фильтр 0,22 мкм.
- Добавьте следующие нейротрофических факторов: цилиарной нейротрофических факторов (CNTF) в конечной концентрации 10 нг/мл и мозг производных нейротрофических фактора (BDNF) и фактор производных нейротрофических глиальных клеток (GDNF) на окончательный концентрации 1 нг/мл.
- Хранить при 4 ° C.
- Подготовка 50 мл рассечение средств массовой информации.
- Добавление 47.05 мл HBSS 2,25 мл глюкозы (200 мг/мл). 700 мкл 1 м HEPES с рН 7,4. Хранить при 4 ° C.
- Приготовляют раствор 4% PFA.
- Растворяют 20 g ПФА в 500 мл ФСБ.
- Под капотом химического тепло раствора до 60 ° C и добавить несколько капель 1 M NaOH до тех пор, пока решение становится ясно.
- Фильтр решение через фильтровальную бумагу и скорректировать рН 7,2. Хранить при температуре от-20 ° C.
Примечание: в качестве альтернативы, другие коммерческие решения PFA может использоваться и разбавляют до 4% в PBS.
- Очистите инструменты рассечение, включая щипцы, ножницы и силиконовые блюда с 70% этанол перед использованием и с мылом и чистой водой после использования.
2. поли орнитина/Ламинин (Po/Л) блюдо покрытие
Примечание: Объемы адаптированы к Пальто плиты 24-хорошо.
- При необходимости, положите стерильные 12 мм coverslip в скважине.
- Герб скважин с 500 мкл раствора 10 мкг/мл поли-L-орнитин, растворенных в воде.
- Пусть скважин довольствуйтесь 1 ч при комнатной температуре.
- Удаление решения поли-L-орнитин и просушите на 30 мин.
- Герб скважин на ночь при 37 ° C с 500 мкл 3 мкг/мл Ламинин в бикарбонат L-15.
Примечание: Скважины может храниться при 37 ° C в течение 7 дней в инкубаторе. Для длительного использования инкубаторов добавив стерильные PBS между скважин может помочь избежать средних испарения.
3. рассечение
- Жертву беременной мыши, когда эмбрионы находятся на начальной стадии E12.5. Очистите живот с 70% этиловом спирте.
- Удаление матки путем разрезания два яйцеводов и влагалище и положить его в чашку Петри, наполненный холодной PBS (без Ca2 + Mg2 +).
- Собрать все эмбрионы и передавать их на свежий, холодный PBS в чашке Петри (без Ca2 + Mg2 +).
- Положите одного эмбриона в блюдо, покрытая силиконом и полон рассечение СМИ (HBSS, 4,5 г/Л глюкозы и 7 мм HEPES рН 7,4).
Примечание: Рассечение эмбрионов выполняется под микроскопом, с использованием чистой тонкой щипцами и ножницы. Кроме того регулярные Петри блюдо без силикона может использоваться для рассечения. - Удалите головы, хвоста и внутренностей, используя пинцет как ножницы.
- Поддерживать эмбриона с животом против силикона с щипцами.
- Вторая пара щипцами вставьте один из советов в Центральный канал спинного мозга Ростральных.
- Закройте щипцы рвать спинной ткани в несколько миллиметров.
- Повторите эту операцию хвостового сторону до тех пор, пока весь спинной открыт (рис. 1B).
- Отсоедините ростральной части спинного мозга (церебральный хобот) от тела.
- Поверните эмбриона для поддержания открытых спинного против силикона.
- Щепотка ростральной части спинного мозга и потяните эмбриона руководителем для извлечения спинного мозга.
Примечание: Мозговых оболочек и спинной корень ганглиев (ДРГ) должна оставаться прикрепленной к эмбриона. В противном случае тщательно тронуться оставшиеся мозговых оболочек и ДРГ еще привязаны к спинного мозга. На этом шаге, ГДК также могут быть собраны для чувствительных нейрон культуры (см. обсуждение). - Придавить спинном на силиконовой и удалять спинной части шнур, разрезания вдоль середины каждой стороны с помощью скальпеля. Нарезать средней части 10 с помощью скальпеля и передача части к новой пробке.
4. суспензию клеток спинного мозга
- Повторите эту процедуру диссекции для 6-8 спинного шнуры.
- Пусть спинного куски собирать в нижней части трубы и заменить HBSS 1 мл среды Хэм-F10.
- 10 мкл трипсина (2,5% w/v; конечная концентрация 0,025%). Инкубировать трубки для 10 минут при 37 ° C.
- Чтобы остановить ферментативного пищеварения, передачи фрагментов новых 15 мл трубки, содержащий 800 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
- Нарезанных дважды по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин сбор супернатант в свежий 15 мл.
- Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
- Нарезанных 6 раз по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5.
- Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
- Нарезанных 10 раз , аспирационных 1 мл с помощью пипетки P1000. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5. Продолжите супернатант.
- С помощью пипетки P1000, осторожно поместите подушку 4% (w/v) 2 мл BSA в нижней части супернатанта трубки. Центрифуга на 470 x g за 5 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 2 мл полного среднего L-15.
5. MN обогащение градиента плотности
- Суспензию клеток разделен на две трубы 15 мл (1 мл). Затем добавьте 2 мл полного среднего L-15. Если начиная с 6 эмбрионов, используйте эквивалент 3 эмбрионов в метро в 3 мл среды.
- Добавьте 2 мл раствора градиент плотности, медленно добавляя решение в нижней части каждой трубы для получения резкого интерфейса.
- Центрифуга на 830 x g 15 мин при комнатной температуре. После этого шага небольшие клетки должно быть в нижней части трубки, тогда как большие клетки, такие как MNs должно быть в интерфейсе градиентного раствора/средняя плотность.
- Собрать клетки на стыке аспирационных 1 или 2 мл и передавать их на свежий 15 мл. Отрегулируйте громкость до 10 мл с L-15 рН среды.
- Добавьте 2 мл 4% BSA подушки в дно трубки и центрифуги на 470 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 3 мл полного среднего L-15.
- Повторите шаг 5.5.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной питательной среды. Подсчет количества клеток и жизнеспособности под микроскопом фазы контраст с Горяева.
Примечание: Для 6 спинного шнуры, номер ячейки ожидается около 1 х 105 MNs.
6. MN культура
- Разбавьте MNs соответствующей плотности, обычно 5000 до 10000 клетки в 500 мкл питательной среды на хорошо в пластине 24-хорошо.
Примечание: Заполнение плотность составляет около 30000 и 1500 клеток для 6 - и 96-луночных планшетов, соответственно. - Удаление решения Ламинин с P1000.
- Сразу передача МНБ, разводят в культурной среде в покрытие плит во избежание высыхания.
- Инкубировать культуры для 2 дней при температуре 37 ° C.
7. Magnetofection МНБ
Примечание: В следующих шагах, использованных количествах предназначены для transfection одной скважиной 24-ну плиты. Пожалуйста, обратитесь к производителя протокол на другой формат.
- Для подготовки ДНК, Ресуспензируйте 1 мкг ДНК в 50 мкл нейрональных питательной среды и вихревые для 5 s.
- Для подготовки труб из бисера Ресуспензируйте 1.5 мкл бисера в 50 мкл нейрональных питательной среды.
- Добавьте 50 мкл шарик решение решение ДНК 50 мкл и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (суммарный объем = 100 мкл).
- Во время этой инкубации снять 100 мкл питательной среды из колодца, который будет transfected.
Примечание: Положите магнитные пластины в инкубатор, чтобы нагреть его до 37 ° C. - Передачи 100 мкл ДНК/шарик смесь хорошо и инкубировать пластины 20 – 30 мин на магнитные пластины при 37 ° C.
- Подождите, по крайней мере за 24 часа до обнаружения выражения cDNA.
8. фиксации и окраски
- Вымойте культуры 2 раза с PBS.
- Инкубировать культуру для 20 мин при комнатной температуре в 4% PFA/PBS.
- Вымойте культуры 2 раза с PBS.
- Инкубируйте культуры в 500 мкл блокировки буфера (PBS, BSA 4%, 2% нормальной сыворотки, 0,3% Тритон X-100, 0,1 М глицин) за 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Нормальной сыворотке должен быть производным от того же вида, как вторичное антитело (например, обычный козьего сыворотки). - Проинкубируйте культуры на ночь при 4 ° C с основного антитела, разводят в 250 мкл блокировки буфера.
Примечание: К примеру, TUJ1 используется в 1/1000, SMI32 используется в 1/1000, и Lc3b используется на 1/200. - Вымойте культуры 3 раза с PBS.
- Проинкубируйте культуры с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела, разводят в 250 мкл блокирующий буфер за 1 час при комнатной температуре.
- Вымойте культуры 3 раза с PBS.
- Смонтировать на стеклянных вставках, с помощью установки среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После 24 часов в культуре мотонейронов (MNs) следует уже показывают значительный рост аксональное (по крайней мере 6 раз больше, чем размер сома). В последующие дни аксоны следует продолжать расти и отображения ветвления (рис. 2). Будут существовать различные морфологии из-за специфики подтип. Например средний столбец МНБ, которые иннервируют осевой мускулатуры были короче и более разветвленной аксоны чем боковой колонке мотор МНБ, которые иннервируют мышцы конечностей18.
Охарактеризовать новые мутации в гене neurofilament NEFH, который вызывает аутосомно-доминирующей формой аксональное CMT13недавно использовались эти изоляции и культивирования методов, описанных выше. В этом случае через два дня после покрытия, очищенный MNs были transfected с кодирования мутантные формы NEFH сливается с eGFP или одичал тип формы сливается с eGFP плазмид. Два дня спустя, мутант NEFH-eGFP сформированы агрегаты вдоль цитоскелета сети. Через четыре дня после magnetofection, эти агрегаты превратилась в известный perinuclear aggresome, содержащие маркер autophagic LC3b (рис. 3). Этот подход позволил нам продемонстрировать, что мутантные формы NEFH индуцированных формирование агрегатов, которые связаны с autophagic путей в первичной MNs.
Рисунок 1: обзор основных шагов процедуры. (A) E12.5 эмбрионов мыши разделяются для извлечения вентральной Рог спинного мозга. Затем отделить нейроны от брюшной рога клеток и МНБ оказываются очищенными, градиент плотности до покрытия. Наконец MNs transfected в magnetofection и проанализированы через несколько дней. (B) первый шаг в спинном рассечение — когда плиты крыши спинного открыт rostro хвостового оси с щипцами. Затем спинного отделяется от тела, потянув мозгового ствола. На данный момент мозговые оболочки и спинной корень ганглиев (DRG) остаются на эмбриональных тела. Спинной части спинного разрезанные продольно с помощью скальпеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель MN культуры. (A) MNs морфология после 4 дней культуры выявлены путем пятнать эндогенного neurofilament фосфорилированных тяжелой цепи (SMI32). Шкалы бар = 100 мкм. (B) к МНБ морфология после 4 дней в пробирке и transfected для eGFP трансген, magnetofection на день 2. МНБ были counterstained с маркером SMI32 или Пан нейронов маркер Tuj1. Стрелки показывают СОСМ нейронов. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Конфокальный образы magnetofected MNs, выражая одичал тип или мутант eGFP-NEFH конструкции (в зеленом) и окрашенных autophagic маркера LC3b (в красном). Стрелки показывают мутант eGFP-NEFH белка агрегатов, которые также являются LC3b положительный. Шкалы бар = 10 мкм. изображения изменяются от Жакье et al. 2017, Acta Neuropathologica связи13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из критических точек в этот протокол является, что эмбрионов мыши разделяются на точное время окна во время разработки (E12.5), чтобы оптимизировать количество МНБ, полученные в конце. Кроме того для оптимальной урожайности, вскрытие должно выполняться утром или в начале второй половине дня. Перед E12.5 (например, в E11.5) рассечение трудно, особенно в отношении ликвидации мозговых оболочек. После E12.5 количество полученных MNs значительно падает. Для управления стадии развития эмбриона, взрослые самки и самцы сначала помещаются вместе в конце дня. На следующее утро, взрослые отделены, и женщины, проверяются на наличие Вагинальные вилка. Если вилка не присутствует, эмбрионы в этот момент считаются в E0.5 день развития. Для этих экспериментов мы обычно используем мыши линии, которая является активной и продуктивной. Прародителями, происходящих из колонии, разводят в Миссури были использованы в настоящем Протоколе, и штамм был назван CF1 (Carworth ферм штамм 1). Этот штамм был введен в реку Чарльз лаборатории Франции в 1967 году, и приобрела имя OF1 (Франция 1 Oncins).
Вторая точка критической является центрифугирования шаги, которые существенно влияют на чистоту культуры. МНБ представляют собой низкий процент клеток спинного мозга (около 1%), и цель заключается в том, чтобы получить культуры, содержащие 40-50% MNs среди других позвоночника нейрональные клетки и менее 5% глиальные клетки предшественники. Для мониторинга эффективности centrifugations телефоны, подвеска образцы, полученные до и после каждого шага можно покрытием в среде MNs на 24 часа, после чего фиксации и окраски для выражения мотонейрона маркеров Hb9 (81.5C10, DSHB) или островок-1/островок-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), чья комбинации определяют различные субпопуляции MNs19. На более зрелых MNs другие маркеры например холина ацетил трансферазы (чат, Ab144P) или Neurofilament H фосфорилированных (SMI - 32 P) может использоваться для оценки качества культуры. Хорошая альтернатива для быстрого контроля эффективности очистки является использование трансгенных мышей, которые выражают Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) конкретно в МНБ. К примеру Вихтерле и коллеги ранее разработанных трансгенных мышей, выражая GFP под контролем мыши промоутер Hb9 (также называется Hlxb9 или Mnx1)18. Hb9::GFP трансгенных мышей отображения отдельных выражение гена GFP в дендриты, аксоны и СОСМ позвоночника МНБ от эмбриональных день 9.5 послеродовой день 10.
МНБ требует роста на подложке разрешительной, полученные поли-L-орнитин и Ламинин покрытие. В зависимости от экспериментальных условий, могут использоваться разнообразные пластиковые, полимерные и стекла-на основе контейнеров (например, 6-24-96-луночных пластины, стекло coverslips, или палаты слайды). Среди этих вариантов microfluidic приборы могут представлять интерес для решения конкретных вопросов, касающихся формирования синапсов или аксональное руководство и транспорта20. МНБ, как известно, быть чувствительным к изменениям в их микроокружения с участием моделей, концентрации факторов, механические изменения в субстрат (например, жесткость), огромного стресса и пространственно-временных градиента подсказки (например, топографические особенности, патронирования поверхностей с веществами различных клеточных сродства). Microfluidic платформы являются системы, которые можно интегрировать многофакторного условий, позволяя для определения оптимального клеточного микросреды.
С момента открытия GDNF на выживание эффекты7растет количество нейротрофических факторов в MN первоначальный рост и выживание, руководства и развития аксонов и вызывая синаптической пластичности. Интересно, что каждый фактор действует на конкретных субпопуляция MNs8. К примеру была описана CNTF защищать средний мотор столбец (MMC), которая иннервирует осевой мускулатуры, тогда как HGF действует на боковые мотор столбце (ОБК) который иннервирует мышцы конечностей. С другой стороны GDNF и BDNF показать действие про выживание сильнейших на целые группы населения МНБ. Наконец сочетание GDNF, BDNF и CNTF достаточна для защиты более чем 70% населения MN и широко используется в лабораториях.
В условиях стандартного культуры MNs может храниться в vitro 14 дней, заменив половину СМИ культуры свежие СМИ раз в 3 дня, начиная с пятого дня культуры. Во время созревания в пробирке MNs может transfected в magnetofection в любое время, используя этот протокол. По характеру плазмидов и вставки может модуляции эффективность и токсичность этой техники. В нашем случае, когда magnetofection была выполнена на MN культуры после 2 дней в пробирке с помощью 9 КБ плазмида с CAGGS promotor (pCAGEN-21) контроль neurofilament cDNA, мы наблюдали в среднем 31,48% ± 9,94 (стандартное отклонение) transfected МНБ 48 часов после transfection. Тем не менее для других конструкций, должны быть протестированы различные соотношение ДНК/бусы, как описано в протоколе производителя. Другой параметр, который может повлиять на эффективность трансфекции уровня является созревания MNs с течением времени. Действительно, в течение первых 3 дней культуры, роста аксонов и расширение СОСМ будет происходить, что увеличивает площадь поверхности, где будет проникать бисер. Этот параметр может повысить эффективность трансфекции MN со временем во время созревания.
Наконец по сравнению с MN культур, было бы интересно выращивать сенсорных нейронов22,23,24. В частности болезнь Шарко-Мари-зуб является сенсорные моторная нейропатия, характеризуется дистальной мышечной атрофии, относящиеся к дегенерации как позвоночника MNs и Сенсорные нейроны ДРГ. интересно, ДРГ расположены по обе стороны спинного мозга и может быть собранные в ходе той же процедуре вскрытия, используется для получения MNs. В этой связи можно сравнить патофизиологических механизмов на работе в этих двух типов соответствующих клеток, мотонейронов и DRG чувствительных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить «Ассоциация le développement de la neurogénétique» доктор Жакье стипендий и AFM-Телетон за его поддержку через MyoNeurAlp стратегического плана. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Крис Хендерсон, д-р Уильям Camu, доктор Brigitte Pettmann, Raoul Седрик д-р и д-р Георг Haase, кто участвовал в развитии и совершенствовании техники и распространения их знаний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
