Summary
Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.
Abstract
Neurodegeneratie van spinale motoneurons (MNs) is betrokken bij een groot spectrum van neurologische stoornissen zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth en spinale musculaire atrofie, die allen geassocieerd met atrofie van de spieren. Primaire culturen van spinale MNs zijn wijd gebruikt om blijk te geven van de betrokkenheid van specifieke genen in dergelijke ziekten en karakteriseren van de cellulaire gevolgen van hun mutaties. Dit protocol modellen een primaire MN cultuur is afgeleid van het baanbrekende werk van Henderson en collega's meer dan twintig jaar geleden. Ten eerste, we detail een methode voor het ontleden van de voorste hoorns van het ruggenmerg van het embryo van een muis en het isoleren van de MNs van naburige cellen met behulp van een dichtheid verloop. Vervolgens presenteren we een nieuwe manier van efficiënt transfecting MNs met expressie plasmiden met behulp van magnetofection. Tot slot, we illustreren hoe op te lossen en immunokleuring primaire MNs. met behulp van neurofilament mutaties die leiden type 2 ziekte Charcot-Marie-Tooth tot, dit protocol toont aan een kwalitatieve benadering van uiten van proteïnen van belang en het bestuderen van hun betrokkenheid bij MN groei, onderhoud en overleving.
Introduction
Neuromusculaire ziekten omvatten een scala aan klinisch en genetisch verschillende aandoeningen die worden gekenmerkt door de verandering van de spier en/of het zenuwstelsel. Vanwege de vooruitgang in sequencing technologieën, honderden genen die verantwoordelijk zijn voor deze zeldzame aandoeningen zijn vastgesteld tijdens het laatste decennium (lijst beschikbaar op de neuromusculaire ziekte Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). De verscheidenheid van geïdentificeerde mutaties geeft aan dat er verschillende mutaties in een enkel gen leiden verschillende fenotypes en ziekten1,2,3 tot kunnen en dat mutaties in verschillende genen soortgelijke fenotypen kunnen produceren 4 , 5. in dit verband zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van cellulaire modellen die krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van de gevolgen van de mutatie en pathologische mechanismen kunnen worden.
Spinale MNs hebben grote Soma gelegen in de ventrale hoorns van het ruggenmerg, formulier lange axons te richten skelet spiervezels en voor vrijwillige bewegingen door het vrijkomen van acetylcholine bij neuromusculaire kruisingen. Aangezien MNs worden beïnvloed door neuromusculaire ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT), en spinale musculaire atrofie, Dr Henderson en collega's ontwikkelde de eerste protocol6 , dat is toegestaan voor de teelt van in vitro spinale MNs en de ontdekking van neurotrophic factor GDNF7 (gliale cel afgeleide neurotrophic factor). Technische verfijningen sindsdien hebben toegestaan voor nauwkeuriger zuivering van spinale MNs en de bijbehorende subtypen FACS8gebruikt, maar verrijking door dichtheid verloop blijft krachtige en meest gebruikte in laboratoria die momenteel werken met primaire spinale MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. vervolgens is het ook mogelijk te krijgen een hogere rang van MN zuivering door middel van immunopanning door gebruik te maken van oppervlakte marker p75(NTR)15,16,17.
Het ruggenmerg bevat verschillende subtypen van cervicale, thoracale en lumbale MNs, evenals met mediaan en lateraal motor kolommen die verschilt van de vindplaats in de voorste hoorn op een dorso-ventrale as en de doelen onderling innervate ze8, 18. primaire MN culturen kunnen herstellen alle van deze subtypen MN in fysiologische verhoudingen. De belangrijkste beperking van deze techniek is het geringe aantal MNs bekomen op het einde van de procedure; in feite, kan worden verwacht te verkrijgen rond 105 MNs zes embryo's, die is geschikt voor microscopie maar voor Biochemie experimenten te beperken. Voor het uitvoeren van experimenten met meer gestandaardiseerde subtypen en overvloedige MNs (> 106 cellen), embryonale stamcel afkomstige MNs18moeten worden beschouwd.
De transfectie van wild-type/mutant transgenen of vechtpartij endogene genen in primaire MNs is een snelle en nuttig hulpmiddel voor het ontcijferen van de pathofysiologische trajecten, met name wanneer Muismodellen niet beschikbaar zijn. Magnetofection is een techniek voor transfecting primaire neuronen, vergelijkbaar met lipofection zonder de verwante neurotoxiciteit. Bovendien kan transfectie worden uitgevoerd op volwassen neuronen na verschillende dagen in vitro, in tegenstelling tot de technieken op basis van electroporation9. Een nadeel van deze techniek is echter dat de kralen nucleïnezuren in de cultuur binden, waardoor ruis in de DAPI labeling. Virale infectie is waarschijnlijk de meest efficiënte techniek voor transfecting MNs; magnetofection vereist echter geen bepaalde veiligheidsprocedures die nodig is voor virale productie en cellulaire infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden aanvaard door de ethische commissie van de instelling.
1. oplossing voorbereiding
- 10 mL van 4% BSA dialyzed in L-15 medium voor te bereiden.
- Los bovien serumalbumine poeder op 4% (m/v) in 10 mL L-15 voedingsbodem.
- Voeg de oplossing op een 20 mL dialyse cassette met een 20 kDa cut-off. Dialyze tegen 500 mL L-15 voedingsbodem voor 3 dagen onder agitatie bij 4 ° C. Het veranderen van het medium van de L-15 elke dag.
- Filtreer de oplossing door een 0,22 µm membraan en aliquot in 15 mL tubes. Opslaan van de buizen bij-20 ° C.
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van de volgende referenties: ongewijzigde rauwe L-15 middellange = L-15 medium, zure L-15 middellange = pH L-15, en L-15 voedingsbodem = bicarbonaat L-15.
- 200 mL pH L-15 voor te bereiden.
- Breng de pH van het medium van de L-15: eerst een wash-fles vullen met enkele stukken van droogijs. Injecteren van gas (CO2) in het L-15 medium tot de kleur omslaat naar oranje (~ pH 6.4 en ~ 40 druk). De pH kan ook worden aangepast met een standaard pH-meter.
- Het filteren van het medium door een 0,22 µm membraan en bewaren bij 4 ° C voor een maand.
- 100 mL bicarbonaat L-15 voor te bereiden.
- Toevoegen van 2.5 mL van 7% natriumbicarbonaat aan 97,5 mL van L-15 medium en opslaan bij 4 ° C.
- Voorbereiden van de IPCS (insuline Putrescin Conalbumin seleniet) supplementen.
- Los 2,5 mg van insuline in 0,5 mL 0,1 M HCl. toevoegen 4.5 mL tweemaal gedestilleerd water.
- Los 8 mg als putrescine in 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Los 100 mg conalbumin in 10 mL PBS.
- Los 1 mg Natriumseleniet in 19,3 mL water en breng de pH op 7.4 Verdun de oplossing 10-fold.
- 1 mL van insuline oplossing, 1 mL van de oplossing als putrescine, 1 mL van conalbumin en 0,1 mL van natrium seleniet oplossing tot het verkrijgen van IPCS supplement 3.1 mL combineren. Winkel de oplossing bij-20 ° C.
- Bereid een progesteron-oplossing van 0,02 mM.
- Los 1 mg van progesteron in 1.6 mL 80% ethanol.
- Verdun de oplossing 100-fold in 100% ethanol en opslaan bij-20 ° C.
- 100 mL volledige L-15 voedingsbodem voor te bereiden.
- Voeg 1.8 mL van D-glucose oplossing (200 mg/mL) toe aan 92 mL pH L-15 om een eindconcentratie van 3,5 mg/mL glucose.
- Combineren van 1 mL 100 x penicilline-streptomycine (10.000 U/mL), 2 mL serum van de warmte-geïnactiveerd paard, 3.1 milliliters IPCS mix en 0,1 mL van progesteron oplossing (2 x 10-5 M).
- Het medium op een membraan 0,22 µm filteren en op te slaan bij 4 ° C.
- 5 mL dichtheid kleurovergang oplossing (eindconcentratie van 5,5%) per experiment voor te bereiden.
- 476 µL van het medium voor het verloop van 60% dichtheid commerciële toevoegen aan 4524 µL van L-15 (eventueel zonder rode fenol om het visueel contrast op de interfase; verdunningsverhouding van 1:10. 5).
- Opslaan van de oplossing bij 4 ° C voor 2 weken of bevriezen bij-20 ° C.
- 10 mL van voedingsbodems bereiden.
- Voeg 200 µL van supplement medium aan 9,6 mL neuron cel kweekmedium.
- Voeg 200 µL van warmte-geïnactiveerd paard serum (die de neiging heeft om te differentiëren gliale cel precursoren en werken tegen proliferatie) 25 µL van glutamine en 10 µL van 2-mercaptoethanol.
- Filtreer de media door een 0,22 µm filter.
- Toevoegen van de volgende neurotrophic factoren: Ciliaire neurotrophic factor (CNTF) op een eindconcentratie van 10 ng/mL, en hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en gliale cel afgeleide neurotrophic factor (GDNF) op de eindconcentraties van 1 ng/mL.
- Opslaan van de media bij 4 ° C.
- 50 mL dissectie media voor te bereiden.
- Voeg 2,25 mL glucose (200 mg/mL) toe aan 47.05 milliliters HBSS. Voeg 700 µL van 1 M HEPES met pH 7.4. Opslaan van de media bij 4 ° C.
- Bereid een 4% PFA-oplossing.
- Los 20 g PFA in 500 mL PBS.
- Onder een chemische kap, Verwarm de oplossing tot 60 ° C en voeg een paar druppels van 1 M NaOH totdat de oplossing duidelijk wordt.
- Filtreer de oplossing door middel van een filtreerpapier en breng de pH op 7,2. Bewaar het bij-20 ° C.
Opmerking: U kunt ook andere commerciële PFA-oplossingen kunnen worden gebruikt en verdund tot 4% in PBS.
- De hulpmiddelen van de dissectie met inbegrip van de pincet, schaar en siliconen gerechten met 70% ethanol vóór gebruik, en met zeep schoon en helder water na gebruik.
2. poly-ornithine/Laminin (Po/L) schotel Coating
Opmerking: Volumes zijn aangepast aan de jas een 24-well-plate.
- Indien nodig zet een steriele 12 mm dekglaasje aan in de put.
- Coat de putjes met 500 µL van 10 µg/mL Poly-L-Ornithine oplossing opgelost in water.
- Laat de putjes regelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder de Poly-L-Ornithine-oplossing en drogen voor 30 min.
- Coat de putjes 's nachts bij 37 ° C met 500 µL van 3 µg/mL laminin in bicarbonaat L-15.
Opmerking: Wells kan worden achtergelaten bij 37 ° C gedurende 7 dagen in de incubator. Voor lange incubations, kan toevoegen van steriele PBS tussen de putten helpen voorkomen middellange verdamping.
3. dissectie
- Offeren een zwangere muis wanneer de embryo's embryonale stadium E12.5. Reinig de buik met 70% ethanol.
- Verwijderen van de baarmoeder door het snijden van de twee oviducts en de vagina en zet het in een petrischaal gevuld met koude PBS (zonder Ca2 + Mg2 +).
- Alle de embryo's te verzamelen en deze overbrengen naar vers, koud PBS (zonder Ca2 + Mg2 +) in een petrischaal.
- Zet één embryo in een schaal bekleed met siliconen en vol van dissectie media (HBSS 4.5 g/L glucose en 7 mM HEPES pH 7.4).
Opmerking: Embryo dissectie wordt uitgevoerd onder een microscoop met behulp van schone fijne Tang en schaar. Anderzijds kan een regelmatige petrischaal zonder siliconen voor dissectie worden gebruikt. - Verwijder de kop, staart en ingewanden, met behulp van de verlostang als schaar.
- Het handhaven van het embryo met de buik tegen het silicone met een tang.
- Met een tweede paar pincet, invoegen een van de tips in het centrale kanaal van het ruggenmerg rostraal.
- Sluit de verlostang om te scheuren van de dorsale weefsel een paar millimeter.
- Herhaal deze bewerking naar de caudal kant totdat het gehele ruggenmerg geopend is (figuur 1B).
- Loskoppelen van de rostraal deel van het ruggenmerg ("cerebral trunk") uit het lichaam.
- Draai het embryo te handhaven het open ruggenmerg tegen de siliconen.
- Knijp de rostraal deel van het ruggenmerg en het embryo te trekken door het hoofd te halen van het ruggenmerg.
Opmerking: Hersenvliezen en achterwortelganglia, bevatten (DRG) moeten blijven vasthouden aan het embryo. Anders Trek voorzichtig weg alle resterende hersenvliezen en DRG nog steeds verbonden met het ruggenmerg. Bij deze stap de DRG ook voor gevoelige neuron cultuur kunnen worden ingezameld (zie discussie). - Het ruggenmerg op het silicone afvlakken en verwijder de dorsale helft van het snoer door te snijden langs het midden van iedere kant met behulp van een scalpel. Snijd het middendeel in 10 stukken met behulp van een scalpel, en overdracht van de stukken aan een nieuwe buis.
4. ruggenmerg celsuspensie
- Herhaal deze procedure dissectie voor 6 tot en met 8 spinal koorden.
- Laat het ruggenmerg stukken verzamelen aan de onderkant van de buis en de HBSS vervangen door 1 mL van Ham-F10 medium.
- Voeg 10 µL van trypsine (2,5% w/v; eindconcentratie 0,025%). Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Om te stoppen met de enzymatische spijsvertering, door de fragmenten te overbrengen in een nieuwe tube van 15 mL met 800 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA, en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
- Triturate tweemaal door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat die de fragmenten regelen voor 2 min. verzamelen de bovendrijvende substantie in een vers 15 mL-buis.
- Voeg het gehakt, 900 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
- Triturate 6 keer door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat de fragmenten die genoegen nemen met 2 min. toevoegen het supernatant op de tube van 15 mL in stap 4.5 verkregen.
- Voeg het gehakt, 900 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
- Triturate 10 keer door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat de fragmenten die genoegen nemen met 2 min. toevoegen het supernatant op de tube van 15 mL in stap 4.5 verkregen. Ga verder met het supernatant.
- Plaats een kussen van 2 mL BSA 4% (m/v) met een P1000 pipet zachtjes onderin supernatant buis. Centrifugeer bij 470 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 2 mL van volledige L-15 medium.
5. MN verrijking door kleurovergang dichtheid
- De celsuspensie gesplitst in twee 15 mL buizen (van elk 1 mL). Dan, voeg 2 mL van volledige L-15 medium. Als beginnend met 6 embryo's, gebruikt u het equivalent van 3 embryo's per buis in 3 mL medium.
- Voeg 2 mL dichtheid kleurovergang oplossing door langzaam de oplossing aan de onderkant van elke buis te verkrijgen van een sterke interface toe te voegen.
- Centrifugeer bij 830 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na deze stap, is de kleine cellen aan de onderkant van de buis, moet dat grote cellen zoals MNs op het raakvlak van de kleurovergang oplossing/medium dichtheid worden moeten.
- Verzamelen van de cellen op het raakvlak door zuigen 1 of 2 mL en deze overbrengen naar een vers 15 mL-buis. Stel het volume op 10 mL met L-15 pH medium.
- Voeg 2 mL van de 4% BSA kussen aan de onderkant van de buis en centrifuge op 470 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 mL van volledige L-15 medium.
- Herhaal stap 5.5.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver volledige kweekmedium. Tellen de celaantal en levensvatbaarheid onder een fasecontrastmicroscoop met een hemocytometer.
Opmerking: Voor 6 spinal netsnoeren, het celaantal naar verwachting ongeveer 1 x 105 MNs.
6. MN cultuur
- Verdun de MNs naar de juiste dichtheid, meestal 5.000 tot 10.000 cellen in 500 µL cultuurmedium per putje in een 24-well-plate.
Opmerking: Zaaien dichtheid is ongeveer 30.000 en 1.500 cellen voor 6 - en 96-wells-platen, respectievelijk. - Verwijder de laminin oplossing met een P1000.
- Onmiddellijk overdracht de MNs verdund in een kweekvloeistof in de coating platen Voorkom drogen.
- Incubeer de cultuur gedurende 2 dagen bij 37 ° C.
7. Magnetofection van MNs
Opmerking: In de volgende stappen, de gebruikte hoeveelheden zijn bedoeld voor de transfectie van één putje van de plaat van een 24-well. Raadpleeg de fabrikant protocol voor een andere indeling.
- Voor de bereiding van DNA, resuspendeer 1 µg van DNA in 50 µL van neuronale kweekmedium en vortex voor 5 s.
- Voorbereiding kraal buis, resuspendeer 1.5 µL van parels in 50 µL van neuronale kweekmedium.
- De 50 µL kraal oplossing toevoegen aan de 50 µL DNA oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (total volume = 100 µL).
- Tijdens deze incubatie, 100 µL cultuurmedium te trekken uit de put die zal zijn transfected.
Opmerking: Zet de magnetische plaat in de incubator het opwarmen tot 37 ° C. - Breng 100 µL van de DNA/kraal mix naar de waterput en Incubeer de plaat 20 – 30 min op de magnetische plaat bij 37 ° C.
- Wacht ten minste 24 uur voordat de detectie van cDNA expressie.
8. fixatie en kleuring
- Wassen van de cultuur 2 keer met PBS.
- Incubeer de cultuur gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA/PBS.
- Wassen van de cultuur 2 keer met PBS.
- De cultuur in 500 µL van blokkeerbuffer (PBS, 4% BSA, 2% normale serum, 0.3% Triton X-100, 0,1 M glycine) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
Opmerking: Normale serum moet worden afgeleid van dezelfde soort als het secundaire antilichaam (bijvoorbeeld normaal geit Serum). - Incubeer de cultuur 's nachts bij 4 ° C met primair antilichaam verdund in 250 µL van buffer met blokkerend.
Opmerking: bijvoorbeeld TUJ1 wordt gebruikt bij 1/1000, SMI32 wordt gebruikt bij 1/1.000, en Lc3b wordt gebruikt bij 1/200. - Wassen van de cultuur 3 keer met PBS.
- Incubeer de cultuur met fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 250 µL van buffer met blokkerend gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen van de cultuur 3 keer met PBS.
- Monteren op glas dia's met behulp van montage medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 24 uur in de cultuur moeten worden motoneurons (MNs) al aanzienlijke axonale groei (ten minste 6 keer langer dan de grootte van het soma) weergegeven. In de volgende dagen, moeten axonen blijven groeien en weergeven van vertakkende (Figuur 2). Er zullen verschillende morphologies als gevolg van subtype specifieke kenmerken. Mediane kolom MNs die axiale spieren innervate hebben bijvoorbeeld korter en meer vertakt axonen dan laterale motor kolom MNs die ledemaat spieren18 innervate.
Deze isolatie en kweken technieken die hierboven beschreven zijn onlangs gebruikt om een nieuwe mutatie in het gen neurofilament NEFH waardoor een autosomaal dominante axonale vorm van CMT13karakteriseren. In dit geval, zijn twee dagen na de beplating, gezuiverde MNs transfected met plasmiden codering een gemuteerde vorm van NEFH om te van eGFP gesmolten of de vorm van de wild-type gesmolten om te van eGFP. Twee dagen later, mutant NEFH-eGFP gevormd aggregaten langs het cytoskeletal netwerk. Vier dagen na magnetofection, deze aggregaten geëvolueerd in een prominente perinuclear aggresome met de LC3b autophagic marker (Figuur 3). Deze aanpak konden we aantonen dat de gemuteerde vorm van NEFH veroorzaakt de vorming van aggregaten die gekoppeld aan autophagic trajecten in primaire MNs zijn.
Figuur 1: overzicht van de belangrijkste stappen van de procedure. (A) E12.5 muis embryo's worden ontleed om uit te pakken van de ventrale Hoorn van het ruggenmerg. Vervolgens neuronen van de ventrale hoorn cellen zijn losgekoppeld en MNs zijn gezuiverd door dichtheid verloop voordat plating. Tot slot, MNs zijn transfected door magnetofection en geanalyseerd na een paar dagen. (B) de eerste stap in het ruggenmerg dissectie is wanneer de plaat van het dak van het ruggenmerg wordt geopend langs de rostro-caudal as met een tang. Vervolgens is het ruggenmerg losgekoppeld van het lichaam door te trekken van de cerebrale kofferbak. Op dit punt, blijven hersenvliezen en achterwortelganglia, bevatten (DRG) op de embryonale lichaam. Het dorsale deel van het ruggenmerg is gesneden overlangs met een scalpel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger MN cultuur. (A) MNs morfologie na 4 dagen van cultuur geopenbaard door de kleuring van endogene non-phosphorylated neurofilament zware ketting (SMI32). Schaal bar = 100 µm. (B) MNs morfologie na 4 dagen in vitro en transfected voor eGFP transgenic door magnetofection op dag 2. MNs waren counterstained met de markering SMI32 of de pan-neuronale markering Tuj1. Pijlen wijzen Soma van de neuronen. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Confocale beelden van magnetofected MNs uiting van wild-type of mutant eGFP-NEFH bouwt (in groen) en gekleurd voor de autophagic markering LC3b (in rood). Pijlen wijzen mutant eGFP-NEFH eiwit-aggregaten die ook LC3b positief. Schaal bar = 10 µm. afbeeldingen worden gewijzigd van Jacquier et al. 2017, Acta Neuropathologica communicatie13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eén van de kritieke punten in dit protocol is dat de muis embryo's worden ontleed bij het venster van een precieze tijd tijdens de ontwikkeling (E12.5) voor het optimaliseren van de hoeveelheid MNs bekomen op het einde. Bovendien, voor optimale opbrengst, moet de dissectie worden uitgevoerd in de ochtend of vroeg in de middag. Voor E12.5 (bijvoorbeeld op E11.5) is dissectie moeilijk, vooral met betrekking tot de afschaffing van de hersenvliezen. Na E12.5 daalt het aantal verkregen MNs aanzienlijk. Om te controleren de embryonale fase van ontwikkeling, volwassen vrouwtjes en mannetjes eerst staan samen aan het eind van de dag. De volgende ochtend, de volwassenen worden gescheiden, en vrouwtjes worden gecontroleerd op de aanwezigheid van een vaginale stekker. Als een stekker aanwezig is, embryo's zijn op dit moment beschouwd als in de E0.5 dag van ontwikkeling. Voor deze experimenten gebruiken we meestal een muis-lijn die is krachtig en productief. Progenitorcellen, van oorsprong uit een kolonie gefokt in Missouri werden gebruikt in dit protocol, en de stam vernoemd CF1 (Carworth boerderijen stam 1). Deze soort werd geïntroduceerd bij Charles River laboratoria Frankrijk in 1967, en het kreeg de naam 1 (Oncins Frankrijk 1).
Een tweede belangrijk punt is de centrifugeren stappen die grote invloed hebben op de zuiverheid van de cultuur. MNs een laag percentage vertegenwoordigen van het ruggenmerg cellen (ongeveer 1%) en het doel is het verkrijgen van een cultuur met 40 tot 50% MNs onder andere spinale neuronale cellen en minder dan 5% gliale cel progenitoren. Controleren van de doeltreffendheid van centrifugations, cell schorsing monsters verworven vóór en na elke stap kan worden vergulde in MNs medium voor 24 uur, gevolgd door de vaststelling en kleuring voor de expressie van motor neuron markers Hb9 (81.5C10, DSHB) of Islet-1/Islet-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), wiens combinaties definiëren verschillende MNs subpopulatie19. Op rijpere MNs, kunnen andere markeringen zoals Choline Acetyl Transferase (CHAT, Ab144P) of Neurofilament H niet-phosphorylated (SMI - 32 P) worden gebruikt om te schatten van de kwaliteit van de cultuur. Een goed alternatief voor het snel toezicht op de effectiviteit van de zuivering is het gebruik van transgene muizen die uitdrukking geven aan de groen fluorescente proteïne (GFP) specifiek in MNs. Bijvoorbeeld, ontwikkelde Wichterle en collega's eerder transgene muizen GFP uiten onder de controle van de muis Hb9 (ook Hlxb9 of Mnx1 genoemd) promotor18. Verschillende expressie van GFP weergeven Hb9::GFP transgene muizen in dendrites, axonen en Soma van spinale MNs vanaf embryonale dag 9,5 naar postnatale dag 10.
MNs is groei op een tolerante substraat verkregen door Poly-L-Ornithine en laminin coating vereist. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, een verscheidenheid van kunststof-, polymeer- en op basis van glas containers kan worden gebruikt (bijvoorbeeld 6-, 24-, 96-wells-platen, coverslips glas, of kamer van dia's). Onder deze opties kunnen microfluidic apparaten van belang zijn voor het aanpakken van specifieke vragen betreffende de synapse formatie of axonale begeleiding en vervoer20. MNs bekend is dat ze gevoelig voor veranderingen in hun communicatie met betrekking tot patronen, concentratie factoren, mechanische veranderingen in het substraat (bijvoorbeeld stijfheid), pure stress en Spatio kleurovergang signalen (bijvoorbeeld topografische functies, patroon van de muziek van oppervlakken met stoffen van de verschillende cellulaire affiniteiten). Microfluidic platforms zijn systemen die multifactoriële voorwaarden, zodat voor de bepaling van de optimale cellulaire microenvironments kunnen integreren.
Sinds de ontdekking van GDNF van overleving effecten7groeit het aantal neurotrophic factoren die betrokken zijn bij MN eerste groei en overleving, begeleiding en ontwikkeling van axonen en inducerende van synaptische plasticiteit. Interessant, fungeert elke factor op een specifieke populaties van MNs8. CNTF is bijvoorbeeld beschreven ter bescherming van de mediane motor kolom (MMC) die axiale spieren bevordert, overwegende dat HGF besluiten op de laterale motor kolom (LMC) die bevordert van de spieren van de ledematen. Aan de andere kant, Toon GDNF en BDNF beide de sterkste pro-overleving-activiteit op hele populaties van MNs. Tot slot, de combinatie van GDNF BDNF en CNTF is voldoende voor de bescherming van meer dan 70% van de bevolking van een MN en wordt vaak gebruikt in laboratoria.
In standaard kweekomstandigheden, kunnen MNs worden gehouden in vitro van 14 dagen door vervanging van de helft van de voedingsbodems met verse media eenmaal om de 3 dagen, vanaf de vijfde dag van cultuur. Tijdens de in vitro maturatie, kunnen MNs zijn transfected door magnetofection op elk gewenst moment met behulp van dit protocol. Doeltreffendheid en toxiciteit van deze techniek kunnen worden gedifferentieerd door de aard van de plasmiden en inserts. In ons geval, toen magnetofection werd uitgevoerd op MN cultuur na 2 dagen in vitro met behulp van een plasmide van 9 kb met een CAGGS promotor (pCAGEN21) controle neurofilament cDNA, merkte we een gemiddelde van 31.48% ± 9,94 (standaarddeviatie) van transfected MNs 48 uur na transfectie. Toch, voor andere constructies, een verschillende verhouding van DNA/kralen moet worden getest zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Een andere parameter die invloed op de transfectie niveau efficiëntie hebben kan is de rijping van MNs na verloop van tijd. Inderdaad, tijdens de eerste 3 dagen van cultuur, groei van axonen en uitbreiding van Soma treedt, die verhoogt de oppervlakte waar de kralen zal doordringen. Deze parameter kan MN transfectie efficiëntie toenemen in de tijd tijdens de rijping.
Ten slotte, in vergelijking met MN culturen zou het interessant zijn om te cultiveren van de sensorische neuronen22,23,24. In het bijzonder, is ziekte van Charcot-Marie-Tooth een sensorische motorische neuropathie gekenmerkt door distale musculaire atrofie in verband met de aftakeling van zowel spinale MNs en sensorische neuronen van DRG. interessant, DRG bevinden zich aan beide zijden van het ruggenmerg en kan tijdens dezelfde dissectie procedure gebruikt voor het verkrijgen van MNs verzameld. In dit verband is het mogelijk om te vergelijken van de pathofysiologische mechanismen op het werk in deze twee relevante celtypes, de motoneurons en de Deutsche Reichsbahn gevoelige neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken de "Association pour le développement de la neurogénétique" voor Dr. Jacquier de fellowship en AFM-Telethon voor zijn steun via MyoNeurAlp strategisch plan. Wij zouden ook willen bedanken Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul en Dr. Georg Haase, die deelgenomen aan de ontwikkeling en verbetering van de techniek en de verspreiding van hun kennis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
