Summary
Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration der spinalen Motoneurone (MNs) ist verwickelt in einem großen Spektrum von neurologischen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit und spinale Muskelatrophie, die Muskelatrophie zugeordnet sind. Primärkulturen von spinalen MNs haben verbreitet zu demonstrieren die Beteiligung bestimmter Gene in solchen Krankheiten und charakterisieren die zellulären folgen deren Mutationen. Dieses Protokoll Modelle eine primäre MN Kultur abgeleitet von der bahnbrechenden Arbeit von Henderson und Kollegen vor mehr als zwanzig Jahren. Zuerst zeigen wir eine Methode der sezieren die vorderen Hörner des Rückenmarks aus einem Maus-Embryo und MNs aus benachbarten Zellen mit einem Dichtegradienten zu isolieren. Dann präsentieren wir Ihnen eine neue Art des effizient transfecting MNs mit Ausdruck Plasmide mit Magnetofection. Schließlich zeigen wir, wie Sie zu beheben und Immunostain primäre zeigt MNs. mit Neurofilament-Mutationen, die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2 verursachen, dieses Protokoll einen qualitativen Ansatz, mit dem Ausdruck interessierender Proteine und studieren ihre Beteiligung an MN-Wachstum, Wartung und überleben.
Introduction
Neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von klinisch und genetisch unterschiedlichen Pathologien, die durch die Veränderung von Muskel und/oder des Nervensystems gekennzeichnet sind. Aufgrund der Fortschritte in Sequenziertechnologien, Hunderte von Genen, die für diese seltenen Erkrankungen wurden während des letzten Jahrzehnts (Liste an Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Die Vielfalt der identifizierten Mutationen bedeutet, dass verschiedene Mutationen in einem einzelnen Gen verschiedene Phänotypen und Krankheiten1,2,3 verursachen können und Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen erzeugen kann 4 , 5. in diesem Zusammenhang gibt es Bemühungen, zelluläre Modelle zu entwickeln, die leistungsfähige Werkzeuge für die Analyse von Mutation folgen und pathologischen Mechanismen werden kann.
Spinale MNs haben große Somas befindet sich in der ventralen Hörner des Rückenmarks, Form lange Axone Skelett-Muskelfasern und bewussten Bewegungen durch die Freisetzung von Acetylcholin an neuromuskulären Verbindungen ermöglichen. Da MNs von neuromuskulären Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung (CMT), betroffen sind und spinale Muskelatrophie, Dr. Henderson und Kollegen entwickelt das erste Protokoll6 , die für den Anbau von zulässig in-vitro- Wirbelsäule MNs und die Entdeckung von neurotrophen Faktor GDNF7 (Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor). Technische Raffinessen seitdem haben für eine genauere Reinigung von spinalen MNs und ihre Subtypen mit FACS8zugelassen, aber Anreicherung durch Dichtegradienten bleibt kräftig und weit verbreiteten im Labor arbeitet derzeit mit primärer spinaler MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. anschließend, es ist auch möglich, eine höhere Besoldungsgruppe von MN-Reinigung durch Immunopanning zu erhalten, unter Ausnutzung der Oberfläche Marker p75(NTR)15,16,17.
Das Rückenmark enthält verschiedene Subtypen des zervikalen, thorakalen und lumbalen MNs sowie mittlere und seitliche motor Spalten, die sich unter ihren Standort in der Vorderhornzellen auf einer Achse dorsal-Ventral unterscheiden und unter den Zielen sie innervieren8, 18. primäre MN Kulturen aller diese Subtypen MN in physiologischen Verhältnissen erholen können. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die geringe Anzahl von MNs erhalten am Ende des Verfahrens; in der Tat können voraussichtlich erhalten rund 105 MNs aus sechs Embryonen für Mikroskopie aber einschränkend für Biochemie Experimente geeignet ist. Experimente mit mehr standardisierte Subtypen und reichlich MNs durchführen (> 106 Zellen), embryonale Stammzellen abgeleitet MNs18betrachtet werden.
Transfektion von Wild-Typ/Mutant transgene oder Knockdown endogene Gene in primären MNs ist ein schnelles und hilfreiches Werkzeug für die Entschlüsselung pathophysiologischen Wege, vor allem, wenn Maus-Modellen nicht zur Verfügung stehen. Magnetofection ist eine Technik für transfecting primären Neuronen, ähnlich wie Lipofektion ohne die damit verbundenen Neurotoxizität. Darüber hinaus kann Transfektion auf Reife Neuronen nach mehreren Tagen in Vitro, im Gegensatz zu Techniken basierend auf Elektroporation9durchgeführt werden. Ein Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass die Perlen in der Kultur, Lärm in DAPI-labeling Nukleinsäuren binden. Virale Infektion ist wahrscheinlich die effizienteste Technik für transfecting MNs; Magnetofection erfordert jedoch keine bestimmte Sicherheitsvorkehrungen für virale Produktions- und zelluläre Infektion benötigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Institution akzeptiert.
1. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie 10 mL von 4 % BSA in L-15 Medium dialysiert.
- Rinderserumalbumin Pulver bei 4 % (w/V) in 10 mL des L-15 Mediums auflösen.
- Ergänzen Sie die Projektmappe, um eine 20 mL-Dialyse-Kassette mit einer 20 kDa Cutoff. Dialyse gegen 500 mL L-15 Medium für 3 Tage unter Unruhe bei 4 ° C. Verändern Sie das L-15 Medium jeden Tag.
- Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm Membran und Aliquot in 15 mL-Tuben. Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet die folgenden Verweise: unmodifizierte raw L-15 Medium = L-15 Mittel, sauren L-15 Medium = pH L-15 und L-15 Basismedium = Bicarbonat L-15.
- 200 mL pH L-15 vorzubereiten.
- Stellen Sie den pH-Wert des Mediums L-15: Zuerst füllen eine Waschflasche mit einigen Stücken von Trockeneis. Gas (CO2) in das L-15 Medium zu injizieren, bis die Farbe Orange wird (~ pH 6,4 und ~ 40 Druck). Der pH-Wert kann auch mit einem standard-pH-Meter eingestellt werden.
- Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 µm Membran und bei 4 ° C für einen Monat.
- 100 mL Bicarbonat L-15 vorzubereiten.
- 97,5 mL des L-15 Mediums 2,5 mL 7 % Sodium Bicarbonat hinzu und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie die IPCS (Insulin Putrescin Conalbumin Selenit) ergänzt.
- 2,5 mg Insulin in 0,5 mL 0,1 M HCl. Add 4,5 mL bidestilliertem Wasser auflösen.
- 8 mg Putrescin in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auflösen.
- 100 mg in 10 mL PBS Conalbumin auflösen.
- 1 mg Natriumselenit in 19,3 mL Wasser auflösen, anpassen des pH-Werts 7,4 und 10-fach verdünnen Sie die Lösung.
- Kombinieren Sie 1 mL Insulinlösung, 1 mL der Putrescin Lösung, 1 mL Conalbumin und 0,1 mL Natrium Selenit Lösung um 3,1 mL IPCS Ergänzung Lösung zu erhalten. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
- Bereiten Sie eine 0,02 mM Progesteron Lösung.
- Lösen Sie 1 mg Progesteron in 1,6 mL 80 % Ethanol.
- Verdünnen Sie die Lösung 100-fold in 100 % Ethanol und bei-20 ° c lagern
- 100 mL des kompletten L-15 Medium vorzubereiten.
- Fügen Sie 1,8 mL D-Glucose-Lösung (200 mg/mL) bis 92 mL pH L-15, eine Endkonzentration von 3,5 mg/mL Glukose zu erhalten.
- Kombinieren Sie 1 mL 100 x Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 2 mL des Hitze-inaktivierten Pferd Serum, 3,1 mL IPCS-Mix und 0,1 mL Progesteron-Lösung (2 x 10-5 M).
- Filtern Sie das Medium auf eine Membran 0,22 µm und bei 4 ° c lagern
- 5 mL Dichte-Gradienten-Lösung (Endkonzentration von 5,5 %) pro Experiment vorbereiten.
- 4524 µL L-15 476 µL des kommerziellen 60 % Dichte Gradienten Mediums hinzufügen (wenn möglich ohne rote Phenol den visuellen Kontrast in der Interphase; erhöhen Verdünnungsverhältnisses von 1:10. 5).
- Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für 2 Wochen oder bei-20 ° c eingefroren
- 10 mL von Kulturmedien vorzubereiten.
- 9,6 mL Neuron Zellkulturmedium 200 µL Medium Ergänzung hinzufügen.
- 25 µL des Glutamins und 10 µL 2-Mercaptoethanol fügen Sie 200 µL der Hitze-inaktivierten Pferd Serum (was eher Gliazelle Vorstufen und arbeiten gegen die Verbreitung zu unterscheiden hinzu).
- Filtermedien Sie die durch einen 0,22 µm-Filter.
- Fügen Sie die folgenden neurotrophen Faktoren: ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) auf eine Endkonzentration von 10 ng/mL, und Gehirn abgeleiteten Neurotrophic Factor (BDNF) und Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor (GDNF) bei Endkonzentrationen von 1 ng/mL.
- Speichern Sie die Medien bei 4 ° C.
- 50 mL der Dissektion Medien vorbereiten.
- 47,05 mL HBSS 2,25 mL Glukose (200 mg/mL) hinzufügen. Fügen Sie 700 µL 1 m HEPES mit pH 7.4. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine 4 % PFA-Lösung.
- Lösen Sie 20 g der PFA in 500 mL PBS.
- Erhitzen Sie unter einer chemischen Haube die Lösung auf 60 ° C und fügen Sie einige Tropfen von 1 M NaOH, bis die Lösung klar wird.
- Filtern Sie die Lösung durch ein Filterpapier und einstellen Sie den pH-Wert auf 7,2. Bei-20 ° c lagern
Hinweis: Alternativ andere kommerziellen PFA-Lösungen verwendet und werden auf 4 % im PBS verdünnt.
- Die Dissektion Werkzeuge wie Zange, Schere und Silikon Gerichte mit 70 % Ethanol vor Gebrauch und mit Seife reinigen und klares Wasser nach Gebrauch.
(2) Poly-Ornithin/Laminin (Po/L) Dish Beschichtung
Hinweis: Volumes werden Mantel einer 24-Well-Platte angepasst.
- Wenn nötig, im Brunnen ein steril 12 mm Deckglas legen.
- Bestreichen Sie die Brunnen mit 500 µL 10 µg/mL Poly-L-Ornithin-Lösung in Wasser aufgelöst.
- Lassen Sie die Brunnen für 1 h bei Raumtemperatur zu begleichen.
- Die Poly-L-Ornithin-Lösung entfernen und für 30 min an der Luft trocknen.
- Bestreichen Sie die Brunnen über Nacht bei 37 ° C mit 500 µL 3 µg/mL Laminin in Bikarbonat L-15.
Hinweis: Brunnen können für 7 Tage im Inkubator bei 37 ° C gespeichert werden. Für lange Inkubationen können hinzufügen von sterilen PBS zwischen den Vertiefungen um mittlere Verdunstung zu vermeiden.
(3) Dissektion
- Eine schwangere Maus zu opfern, wenn die Embryonen im embryonalen Stadium E12.5 sind. Reinigen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol.
- Entfernen der Gebärmutter durch Schneiden die beiden Eileiter und die Scheide und steckte es in eine Petrischale gefüllt mit kaltem PBS (ohne Ca2 + Mg2 +).
- Sammeln Sie alle Embryonen und übertragen Sie sie auf frischen, kalten PBS (ohne Ca2 + Mg2 +) in einer Petrischale.
- Setzen Sie ein Embryo in eine Schüssel mit Silikon beschichtet und voller Dissektion Medien (mit HBSS, 4,5 g/L Glukose und 7 mM HEPES pH 7.4).
Hinweis: Embryo Dissektion erfolgt unter dem Mikroskop mit sauberen feinen Pinzetten und Scheren. Alternativ kann eine regelmäßige Petrischale ohne Silikon für Dissektion verwendet werden. - Entfernen Sie Kopf, Schweif und Eingeweide, mit Pinzette als Schere.
- Pflegen Sie den Embryo mit dem Bauch gegen das Silikon mit der Pinzette.
- Mit einem zweiten Paar Zangen Einfügen einer der Tipps in den Zentralkanal des Rückenmarks rostral.
- Schließen Sie die Zange um den dorsalen Gewebe ein paar Millimeter zu reißen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt in Richtung der kaudalen Seite, bis das gesamte Rückenmark geöffnet ist (Abbildung 1 b).
- Die rostral Teil des Rückenmarks (zerebrale Stamm) aus dem Körper zu lösen.
- Drehen Sie den Embryo zur Aufrechterhaltung der offenen Rückenmark gegen das Silikon.
- Drücken den rostral Teil des Rückenmarks und ziehen des Embryos durch den Kopf, um das Rückenmark zu extrahieren.
Hinweis: Hirnhaut und Dorsal Root Ganglien (DRGs) sollte für den Embryo nicht wegziehen lassen. Andernfalls ziehen Sie vorsichtig entfernt alle verbleibenden Meningen und DRGs noch zum Rückenmark befestigt. An dieser Stelle könnte auch DRGs für sensible Neuron Kultur gesammelt werden (siehe Diskussion). - Glätten Sie das Rückenmark auf das Silikon und entfernen Sie die dorsale Hälfte der Schnur durch Schnitt entlang der Mitte jeder Seite mit einem Skalpell. Mittelteil in 10 Stücke mit einem Skalpell schneiden und die Stücke zu einem neuen Schlauch übertragen.
(4) Rückenmark Zellsuspension
- Wiederholen Sie diese Präparation für 6 bis 8 Rückenmark.
- Lassen Sie das Rückenmark Stücke sammeln sich am Boden des Rohres und der HBSS mit 1 mL Schinken-F10-Medium zu ersetzen.
- Fügen Sie 10 µL von Trypsin (2,5 % w/V; Endkonzentration 0,025 %). Inkubieren Sie das Rohr für 10 min bei 37 ° c
- Um die enzymatische Verdauung zu stoppen, übertragen Sie die Fragmente auf eine neue 15 mL Tube mit 800 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).
- Genannte zweimal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Sammeln der Überstand in ein frisches 15 mL-Tube zu begleichen.
- Die Fragmente fügen Sie hinzu, 900 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).
- Genannte 6 Mal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Add Regeln Schritt 4.5 der Überstand an der 15 mL Tube abschloss.
- Die Fragmente fügen Sie hinzu, 900 µL des kompletten L-15 Medium, 100 µL von 4 % (w/V) BSA und 100 µL der DNase (1 mg/mL in L-15 Medium).
- Genannte 10mal durch Absaugen von 1 mL mit einer Pipette P1000. Lassen Sie die Fragmente für 2 min. Add Regeln Schritt 4.5 der Überstand an der 15 mL Tube abschloss. Fahren Sie mit der Überstand.
- Legen Sie eine 2 mL BSA 4 % (w/V) Polster mit einem P1000 pipettieren, sanft am unteren überstand Rohr. Bei 470 X g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 2 mL des kompletten L-15 Medium.
(5) MN Anreicherung von Gradient Dichte
- Die Zellsuspension in zwei Röhren in 15 mL (1 mL) aufgeteilt. Fügen Sie 2 mL des kompletten L-15 Medium. Wenn mit 6 Embryonen ab, verwenden Sie den Gegenwert von 3 Embryonen pro Röhre in 3 mL Medium.
- Fügen Sie 2 mL Dichte-Gradienten-Lösung hinzu, indem Sie langsam die Lösung am Ende jedes Rohr eine scharfe Oberfläche zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie bei 830 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Nach diesem Schritt sollte kleine Zellen an der Unterseite des Rohres, große Zellen wie MNs an der Dichte-Gradienten-Lösung/Medium-Schnittstelle vorzusehen.
- Sammeln Sie die Zellen an der Schnittstelle von 1 oder 2 mL Absaugen und übertragen Sie sie auf einem frischen 15 mL-Tube. Stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit L-15 pH-Wert Medium.
- Fügen Sie 2 mL 4 % BSA Kissen an der Unterseite des Rohres und Zentrifuge bei 470 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellets in 3 mL des kompletten L-15 Medium.
- Wiederholen Sie Schritt 5.5.
- Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL komplette Kulturmedium. Zählen Sie die Handynummer und die Lebensfähigkeit unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop mit einer Hemocytometer.
Hinweis: Für 6 Rückenmark ist die Zellzahl voraussichtlich rund 1 x 105 MNs.
(6) MN-Kultur
- Verdünnen Sie die MNs auf die entsprechende Dichte, in der Regel 5.000 bis 10.000 Zellen in 500 µL Kulturmedium pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte.
Hinweis: Dichte Aussaat um 30.000 und 1.500 Zellen für 6 und 96-Well-Platten, bzw. ist. - Entfernen Sie die Laminin-Lösung mit einem P1000.
- Sofortüberweisung der MNs in die Lackplatten in Kulturmedium verdünnt, um Austrocknen zu vermeiden.
- Inkubieren Sie die Kultur für 2 Tage bei 37 ° c
7. Magnetofection des MNs
Hinweis: In den folgenden Schritten sind die verwendeten Mengen für die Transfektion von einem Brunnen von einer 24-Well-Platte gedacht. Entnehmen Sie bitte den Hersteller Protokoll für ein anderes Format.
- Für die DNA-Vorbereitung, Aufschwemmen 1 µg DNA in 50 µL der neuronalen Kulturmedium und Vortex für 5 s.
- Aufschwemmen Sie für Perle Rohrvorbereitung 1,5 µL Perlen in 50 µL der neuronalen Kulturmedium.
- Die 50 µL DNA-Lösung 50 µL Wulst Lösung hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (Gesamtvolumen = 100 µL).
- Während diese Inkubation auszahlen Sie 100 µL Kulturmedium aus dem Brunnen, der transfiziert werden wird.
Hinweis: Legen Sie die Magnetplatte im Inkubator es auf 37 ° c erwärmen - 100 µL DNA/Korn-Mix zum Brunnen zu übertragen, und inkubieren Sie die Platte 20-30 min auf der Magnetplatte bei 37 ° C.
- Warten Sie mindestens 24 Stunden vor dem Nachweis der cDNA Ausdruck.
(8) Fixierung und Färbung
- Waschen Sie die Kultur 2 Mal mit PBS.
- Inkubation die Kultur für 20 min bei Raumtemperatur in 4 % PFA/PBS.
- Waschen Sie die Kultur 2 Mal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Kultur in 500 µL blocking-Puffer (PBS, 4 % BSA, 2 % normalen Serum, 0,3 % Triton x-100, 0,1 M Glycin) für 1 h bei Raumtemperatur.
Hinweis: Normale Serum sollte von der gleichen Art wie die sekundäre Antikörper (z. B. Normal Ziegenserum) abgeleitet. - Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 4 ° C mit Primärantikörper in 250 µL blocking-Puffer verdünnt.
Hinweis: Z. B. TUJ1 dient bei 1/1000, SMI32 dient bei 1/1000 und Lc3b wird auf 1/200 verwendet. - Waschen Sie die Kultur 3 Mal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Kultur mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt in 250 µL blocking-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Kultur 3 Mal mit PBS.
- Auf Glas-Objektträger mit Eindeckmedium montieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach 24 Stunden in der Kultur sollte Motoneurone (MNs) zeigen bereits erhebliches axonale Wachstum (mindestens 6 mal länger als die Soma-Größe). In den folgenden Tagen sollte Axone weiter wachsen und Verzweigung (Abbildung 2) angezeigt. Es werden unterschiedliche Morphologien durch Subtyp Besonderheiten. Zum Beispiel mittlere Spalte MNs, die axiale Muskeln innervieren haben kürzere und mehr verzweigten Axone als seitliche motor Spalte MNs, die Extremität Muskeln18innervieren.
Diese Isolierung und Kultivierung der oben beschriebenen Techniken haben vor kurzem verwendet worden, um eine neue Mutation im Neurofilament-gen NEFH zu charakterisieren, die eine autosomale dominante axonale Form der CMT13verursacht. In diesem Fall wurden zwei Tage nach der Beschichtung, gereinigten MNs mit Plasmiden Codierung eine mutierte Form des NEFH mit eGFP verschmolzen oder Wildtyp Form verschmolzen zu eGFP transfiziert. Zwei Tage später, mutierten NEFH-eGFP gebildet Aggregate entlang des Zytoskeletts. Vier Tage nach Magnetofection, entwickelte sich diese Aggregate in einer prominenten Perinukleäre Aggresome mit der LC3b selbstverdauende Marker (Abbildung 3). Dieser Ansatz erlaubt uns zu zeigen, dass die mutierte Form des NEFH induziert die Bildung von Aggregaten, die selbstverdauende Pfade im primären MNs zugeordnet sind.
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Verfahrensschritte. (A) E12.5-Maus-Embryonen werden indiziert, um die ventralen Horn des Rückenmarks zu extrahieren. Dann Neuronen aus der ventralen Hornzellen getrennt und MNs durch Dichtegradienten vor Beschichtung gereinigt werden. Zu guter Letzt werden MNs transfiziert durch Magnetofection und nach ein paar Tagen analysiert. (B) ist der erste Schritt im Rückenmark Dissektion, wenn die Dach-Platte des Rückenmarks Rostro-kaudalen Achse mit Zange geöffnet wird. Dann wird das Rückenmark durch Ziehen des zerebralen Stammes aus dem Körper gelöst. Zu diesem Zeitpunkt bleiben Meningen und Dorsal Root Ganglien (DRG) auf den embryonalen Körper. Der dorsale Teil des Rückenmarks wird längs mit einem Skalpell geschnitten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative MN Kultur. (A) MNs Morphologie nach 4 Tagen Kultur offenbart durch Färbung der endogenen nicht phosphoryliert Neurofilament schwere Kette (SMI32). Maßstabsleiste = 100 µm. (B) MNs Morphologie nach 4 Tagen in Vitro und transfizierten für eGFP Transgen von Magnetofection am 2. Tag. MNs wurden mit dem Marker SMI32 oder der Pfanne neuronalen Marker Tuj1 counterstained. Pfeile zeigen Somas der Neuronen. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Konfokale Bilder von Magnetofected MNs Wildtyp oder mutierte eGFP-NEFH zum Ausdruck zu bringen (in grün) konstruiert und gebeizt für die selbstverdauende Markierung LC3b (in rot). Pfeile zeigen mutierten eGFP-NEFH Protein-Aggregate, die auch LC3b positiv sind. Maßstabsleiste = 10 µm. Bilder sind von Jacquier Et Al. 2017, Acta Neuropathologica Kommunikation13geändert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die kritischen Punkte in diesem Protokoll gehört, dass die Maus-Embryonen bei einem genauen Zeitfenster während der Entwicklung (E12.5), die Höhe der MNs erhalten am Ende zu optimieren seziert werden. Darüber hinaus sollte für optimalen Ertrag der Dissektion am Morgen oder in den frühen Nachmittag durchgeführt werden. Vor E12.5 (z. B. bei E11.5) ist Dissektion schwierig, insbesondere im Hinblick auf die Beseitigung von der Hirnhaut. Nach E12.5 sinkt die Anzahl der erhaltenen MNs deutlich. Um den Embryostadium der Entwicklung zu steuern, sind adulte Weibchen und Männchen zuerst am Ende des Tages zusammengestellt. Am nächsten Morgen die Erwachsenen sind getrennt, und Frauen werden auf das Vorhandensein von einem vaginalen Stecker geprüft. Wenn eine Steckdose vorhanden ist, gelten die Embryonen an dieser Stelle in E0.5 Tag der Entwicklung sein. Für diese Experimente verwenden wir in der Regel eine Mauslinie, die kräftig und fruchtbar ist. Vorfahren stammen aus einer Kolonie in Missouri gezüchtet wurden in dieses Protokoll verwendet, und die Sorte hieß CF1 (Carworth Farmen Stamm 1). Diese Sorte wurde am Charles River Laboratories Frankreich 1967 eingeführt, und es gelangte unter dem Namen OF1 (Brown Frankreich 1).
Ein zweiter kritischer Punkt ist die Zentrifugation Schritte, die einen großen Einfluss auf die Reinheit der Kultur. MNs repräsentieren einen geringen Prozentsatz der Rückenmark Zellen (ca. 1 %), und das Ziel ist es, eine Kultur mit 40 bis 50 % MNs unter anderen spinalen neuronalen Zellen und weniger als 5 % Gliazelle Vorfahren zu erhalten. Gefolgt von Fixierung und Färbung für den Ausdruck von Motoneuron Markern Hb9 (81.5C10, DSHB) überwacht die Wirksamkeit von Centrifugations, Zell-Aufhängung Proben vor und nach jeder Schritt im MNs Medium für 24 Stunden, vergoldet kann erworben oder Islet-1/Insel-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), deren Kombinationen definieren verschiedene MNs Subpopulation19. Auf reifere MNs können andere Marker wie Cholin Acetyl-Transferase (CHAT, Ab144P) oder Neurofilament H nicht phosphoryliert (SMI - 32P) verwendet werden, um die Qualität der Kultur zu schätzen. Eine gute Alternative für die Wirksamkeit der Reinigung schnell Überwachung soll transgene Mäuse verwenden, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) speziell in MNs ausdrücken. Wichterle und Kollegen entwickelt beispielsweise zuvor transgene Mäuse GFP unter der Kontrolle der Maus Hb9 (auch Hlxb9 oder Mnx1 genannt) Projektträger18zum Ausdruck zu bringen. Hb9::GFP transgene Mäuse zeigen deutliche Ausdruck der GLP in Dendriten und Axone Somas der spinalen MNs aus embryonalen Tag 9,5 auf postnatale Tag 10.
MNs erfordern Wachstum auf einem freizügigen Substrat durch Poly-L-Ornithin und Laminin Beschichtung erhalten. Abhängig von den experimentellen Bedingungen kann eine Vielzahl von Kunststoff - Polymer- und Glas-basierten Container verwendet werden (z. B. 6-24, 96-Well-Platten, Glas Deckgläsern oder Kammer-Folien). Unter diesen Optionen möglicherweise mikrofluidischen Geräten von Interesse für bestimmte Fragen der Synapse Bildung oder axonalen Beratung und Transport20richten. MNs sind bekanntermaßen anfällig für Veränderungen in ihrer Mikroumgebung von Mustern, Konzentration Faktoren, mechanische Änderungen im Substrat (z.B. Steifigkeit), Scherung und räumlich-zeitliche Verlauf Hinweise (z. B. topographische Funktionen, Strukturierung von Oberflächen mit Stoffen von verschiedenen zellulären Affinitäten). Mikrofluidische Plattformen sind Systeme, die multifaktorielle Bedingungen, so dass für die Bestimmung der optimalen zellulären Mikroumgebungen integrieren können.
Seit der Entdeckung GDNFs überleben Effekte7wächst die Zahl von neurotrophen Faktoren beteiligt MN ersten Wachstum und überleben, Führung und Entwicklung von Axonen, und der synaptischen Plastizität induzieren. Interessanterweise wirkt jeder Faktor auf eine bestimmte Subpopulation von MNs-8. Zum Beispiel wurde CNTF beschrieben, zum Schutz der mittlere motor Spalte (MMC) die axiale Muskeln innerviert, während HGF auf der seitlichen motor Spalte (LMC) wirkt die Extremität Muskeln innerviert. Auf der anderen Seite zeigen GDNF und BDNF die stärkste Aktivität pro-überleben auf ganze Populationen von MNs. Schließlich die Kombination von GDNF, BDNF und CNTF reicht für mehr als 70 % der Bevölkerung eine MN zu schützen und wird häufig in Labors verwendet.
Standard-Kulturbedingungen können MNs in Vitro bis 14 Tage gehalten werden indem die Hälfte der Nährmedien mit frischen Medien einmal alle 3 Tage, ab dem fünften Tag der Kultur. Während der in-Vitro Reifung können MNs durch Magnetofection jederzeit unter Verwendung dieses Protokolls transfiziert. Effizienz und Toxizität dieser Technik können durch die Art der Plasmide und Einsätze moduliert werden. In unserem Fall, wenn Magnetofection auf MN Kultur nach 2 Tagen in Vitro mit ein 9 kb-Plasmid mit einem CAGGS-Promotor (pCAGEN21) Steuerung Neurofilament cDNA erfolgte beobachtet wir durchschnittlich 31.48 % ± 9,94 (Standardabweichung) der transfizierten MNs 48 Stunden Post-Transfektion. Dennoch sollte für andere Konstrukte ein anderes Verhältnis von DNA/Perlen getestet werden wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Ein weiterer Parameter, der die Transfektion Ebene Effizienz beeinflussen können ist die Reifung der MNs im Laufe der Zeit. In der Tat werden während der ersten 3 Tage der Kultur, Wachstum der Axone und Erweiterung des Somas stattfinden, das vergrößert die Oberfläche, wo die Perlen dringen werden. Dieser Parameter kann im Laufe der Zeit während der Reifung MN Transfektion Effizienz erhöhen.
Im Vergleich zu MN Kulturen wäre es schließlich interessant, sensorischen Neuronen22,23,24zu kultivieren. Insbesondere ist Charcot-Marie-Zahn Krankheit, eine sensorische motorische Neuropathie durch distale Muskelatrophie gekennzeichnet die Degeneration der sowohl spinale MNs und sensorischen Neuronen der DRGs. interessant ist, im Zusammenhang mit DRGs befinden sich auf beiden Seiten des Rückenmarks und kann während das gleiche Dissektion-Verfahren verwendet, um MNs gesammelt. In diesem Zusammenhang ist es möglich, die pathophysiologischen Mechanismen bei der Arbeit in diesen zwei relevante Zelltypen, Motoneurone und DRG sensible Neuronen zu vergleichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten danken, der "Association pour le Développement De La Neurogénétique" für Dr. Jacquier Fellowship und AFM-Telethon für seine Unterstützung durch MyoNeurAlp Strategieplan. Wir möchten auch danke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul und Dr. Georg Haase, die bei der Entwicklung und Verbesserung der Technik teilgenommen und ihr Wissen zu verbreiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
