Summary
L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.
Abstract
Neurodegenerazione dei motoneuroni spinali (MNs) è implicata in un ampio spettro di disturbi neurologici, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscolare spinale, che sono tutti associati ad atrofia muscolare. Colture primarie di MNs spinale sono stati utilizzati ampiamente per dimostrare il coinvolgimento di geni specifici in tali malattie e caratterizzare le conseguenze cellulari delle loro mutazioni. Questa cultura di modelli un MN primario del protocollo derivato dal lavoro seminale di Henderson e colleghi più di venti anni fa. In primo luogo, abbiamo un metodo di dissezione corni anteriori del midollo spinale da un embrione di topo e isolando il MNs da cellule utilizzando un gradiente di densità vicine in dettaglio. Quindi, vi presentiamo un nuovo modo di trasfezione in modo efficiente MNs con plasmidi di espressione utilizzando magnetofection. Infine, illustriamo come risolvere e immunostain primaria che MNS. utilizzando mutazioni di neurofilament che causano la malattia di Charcot-Marie-Tooth, tipo 2, questo protocollo dimostra un approccio qualitativo che esprimono le proteine di interesse e studiare il loro coinvolgimento nella Crescita di MN, la manutenzione e la sopravvivenza.
Introduction
Malattie neuromuscolari comprendono una varietà di patologie clinicamente e geneticamente distinte che si caratterizzano per l'alterazione del muscolo e/o il sistema nervoso. A causa dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento, centinaia di geni responsabili di questi disordini rari è stati identificati durante l'ultimo decennio (elenco disponibile presso il centro di malattie neuromuscolari, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La varietà di mutazioni identificate indica che mutazioni differenti in un singolo gene possono causare diversi fenotipi e malattie1,2,3 e che mutazioni in geni differenti possono produrre fenotipi simili 4 , 5. in questo contesto, ci sono gli sforzi per sviluppare modelli cellulari che possono diventare potenti strumenti per analizzare le conseguenze di mutazione e meccanismi patologici.
MNs spinale hanno grande somas situato nelle corna ventrale del midollo spinale, gli assoni lunghi forma come target fibre muscolari scheletriche e consentire movimenti volontari attraverso il rilascio di acetilcolina alle giunzioni neuromuscolari. Poiché MNs sono colpiti da malattie neuromuscolari come la sclerosi laterale amiotrofica, la malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) e l'atrofia muscolare spinale, Dr. Henderson e colleghi ha sviluppato il primo protocollo n.6 che ha permesso per la coltivazione di in vitro spinale MNs e la scoperta di neurotrophic factor GDNF7 (fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali). Raffinatezze tecniche da allora hanno consentito una più accurata purificazione di MNs spinale e relativi sottotipi usando FACS8, ma arricchimento mediante gradiente di densità rimane potente e ampiamente utilizzati nei laboratori attualmente lavorando con MNs spinale primaria 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. successivamente, è anche possibile ottenere un grado di purificazione MN superiore attraverso immunopanning, approfittando di superficie dell'indicatore p75(NTR)15,16,17.
Il midollo spinale contiene diversi sottotipi di MNs cervicale, toracica e lombare, nonché colonne motore mediani e laterali che differiscono tra loro posizione nel corno anteriore su un asse dorso-ventrale e tra i bersagli innervate8, 18. culture MN primario possono recuperare tutti questi sottotipi di MN in proporzioni fisiologiche. Il limite principale di questa tecnica è il basso numero di MNs ottenuti al termine della procedura; in realtà, ci si attende di ottenere circa 105 MNs da sei embrioni, che è adatto per la microscopia ma limitante per esperimenti di biochimica. Per eseguire esperimenti con più standardizzati sottotipi e MNs abbondanti (> 106 cellule), embrionale MNs derivati da cellule staminali dovrebbe essere considerato18.
Transfezione di selvaggio-tipo/mutante transgeni o atterramento geni endogeni nelle primarie MNs è uno strumento rapido e utile per decifrare le vie fisiopatologiche, soprattutto quando non sono disponibili modelli murini. Magnetofection è una tecnica per trasfezione neuroni primari, simili a lipofezione senza la neurotossicità correlata. Inoltre, la transfezione può essere eseguita su neuroni maturi dopo diversi giorni in vitro, a differenza di tecniche basate su elettroporazione9. Tuttavia, uno svantaggio di questa tecnica è che le perle si legano gli acidi nucleici nella cultura, causando rumore in DAPI etichettatura. Infezione virale è probabilmente la tecnica più efficiente per trasfezione MNs; Tuttavia, magnetofection non richiede determinate procedure di sicurezza necessarie per la produzione virale e infezione cellulare.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state accettate dal comitato etico dell'istituzione.
1. soluzione preparazione
- Preparare 10 mL di 4% BSA dializzata nel mezzo di L-15.
- Sciogliere polvere di albumina di siero bovino al 4% (p/v) in 10 mL di terreno di L-15.
- Aggiungere la soluzione a una cassetta di dialisi da 20 mL con un cut-off kDa 20. Dializzare contro 500 mL di terreno L-15 per 3 giorni sotto agitazione a 4 ° C. Cambiare il mezzo di L-15 ogni giorno.
- Filtrare la soluzione attraverso un 0,22 µm membrana e aliquota in provette da 15 mL. Conservare le provette a-20 ° C.
Nota: Questo protocollo utilizza i seguenti riferimenti: non modificato crudo L-15 medio = medio L-15, acido L-15 medio = pH L-15 e terreno base L-15 = L-15 di bicarbonato.
- Preparare 200 mL di pH L-15.
- Regolare il pH del mezzo L-15: in primo luogo, riempire una spruzzetta con alcuni pezzi di ghiaccio secco. Iniettare il mezzo di L-15 gas (CO2) fino a quando il colore diventa arancione (~ pressioni pH 6.4 e ~ 40). Il pH può essere regolato anche con un misuratore di pH standard.
- Filtro di supporto con un 0,22 µm membrana e conservare a 4 ° C per un mese.
- Preparare 100 mL di bicarbonato L-15.
- Aggiungere 2,5 mL di bicarbonato di sodio del 7% a 97,5 mL di terreno di L-15 e conservare a 4 ° C.
- Preparare i supplementi IPCS (insulina Putrescin Conalbumin Selenite).
- Sciogliere 2,5 mg di insulina in 0,5 mL di 0.1 M HCl. Aggiungi 4,5 mL di acqua bidistillata.
- Sciogliere 8 mg di putrescina in 5 mL di tampone fosfato salino (PBS).
- Sciogliere 100 mg del conalbumin in 10 mL di PBS.
- Sciogliere 1 mg di selenito di sodio in 19,3 mL d'acqua, regolare il pH a 7,4 e diluire la soluzione 10 volte.
- Unire 1 mL di soluzione di insulina, 1 mL di soluzione di putrescina, 1 mL di conalbumin e 0,1 mL di soluzione di selenito di sodio per ottenere 3,1 mL di soluzione di supplemento di IPC. Conservare la soluzione a-20 ° C.
- Preparare una soluzione di progesterone di 0,02 mM.
- Sciogliere 1 mg di progesterone in 1,6 mL di etanolo di 80%.
- Diluire la soluzione 100 volte in 100% etanolo e conservare a-20 ° C.
- Preparare 100 mL di terreno completo di L-15.
- Aggiungere 1,8 mL di soluzione di D-glucosio (200 mg/mL) a 92 mL di pH L-15 per ottenere una concentrazione finale di 3,5 mg/mL di glucosio.
- Unire 1 mL di 100 x penicillina-streptomicina (10.000 U/mL), 2 mL di siero equino inattivati, 3,1 mL di miscela IPCS e 0,1 mL di soluzione di progesterone (2 x 10-5 M).
- Filtrare il mezzo su una membrana da 0,22 µm e conservarla a 4 ° C.
- Preparare 5 mL di soluzione gradiente di densità (concentrazione finale del 5,5%) per esperimento.
- µ L 476 del mezzo di gradienti di densità 60% commerciale a 4524 µ l di L-15 (se possibile, senza rosso fenolo per aumentare il contrasto visivo all'interfase; rapporto di diluizione di 1:10. 5).
- Conservare la soluzione a 4 ° C per 2 settimane o congelare a-20 ° C.
- Preparare 10 mL di terreno di coltura.
- Aggiungere 200 µ l di terreno di supplemento a 9,6 mL di mezzo di coltura cellulare del neurone.
- Aggiungere 200 µ l di siero inattivato con calore cavallo (che tende a differenziare i precursori delle cellule gliali e opere contro proliferazione) a 25 µ l di glutamina e 10 µ l di 2-mercaptoetanolo.
- Filtrare i media attraverso un filtro da 0,22 µm.
- Aggiungere i seguenti fattori neurotrofici: fattore neurotrofico ciliare (CNTF) ad una concentrazione finale di 10 ng/mL e fattore neurotrophic derivato cervello (BDNF) e fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali (GDNF) alle concentrazioni finali di 1 ng/mL.
- Conservare i supporti a 4 ° C.
- Preparare 50 mL di media di dissezione.
- Aggiungere mL 47,05 di HBSS 2,25 mL di glucosio (200 mg/mL). Aggiungere 700 µ l di 1 M HEPES pH 7,4. Conservare i supporti a 4 ° C.
- Preparare una soluzione PFA del 4%.
- Sciogliere 20 g di PFA in 500 mL di PBS.
- Sotto una cappa chimica, riscaldare la soluzione a 60 ° C e aggiungere qualche goccia di 1 M NaOH fino a quando la soluzione diventa chiara.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro di carta e regolare il pH a 7,2. Conservare a-20 ° C.
Nota: In alternativa, altre soluzioni commerciali di PFA possono essere utilizzati e diluiti al 4% in PBS.
- Pulire gli attrezzi di dissezione inclusi pinze, forbici e piatti in silicone con etanolo al 70% prima dell'uso e con sapone e acqua cristallina dopo l'uso.
2. poly-ornitina/laminina (Po/L) piatto rivestimento
Nota: I volumi sono adattati al cappotto una piastra a 24 pozzetti.
- Se necessario, è possibile mettere un vetrino coprioggetto sterili 12 mm nel pozzo.
- Rivestire i pozzetti con 500 µ l di 10 µ g/mL Poly-L-ornitina soluzione disciolti in acqua.
- Lasciare i pozzetti stabilirsi a temperatura ambiente per 1 h.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-ornitina e asciugare all'aria per 30 min.
- Ricoprire i pozzi durante la notte a 37 ° C con 500 µ l di 3 µ g/mL laminina in bicarbonato di L-15.
Nota: Pozzi possono essere memorizzati a 37 ° C per 7 giorni nell'incubatrice. Per lunghe incubazioni, aggiungendo PBS sterile tra i pozzetti può contribuire a evitare l'evaporazione media.
3. dissezione
- Sacrificare un mouse incinto quando gli embrioni sono in fase embrionale 12.5. Pulire la pancia con etanolo al 70%.
- Rimuovere il grembo tagliando due ovidotti e la vagina e metterlo in una capsula Petri riempito con PBS freddo (senza Ca2 + Mg2 +).
- Raccogliere tutti gli embrioni e trasferirli al fresco, PBS freddo (senza Ca2 + Mg2 +) in una capsula di Petri.
- Mettere un embrione in un piatto rivestito con silicone e completo di supporti di dissezione (con HBSS, glucosio di 4,5 g/L e 7 mM HEPES pH 7.4).
Nota: La dissezione dell'embrione viene eseguita sotto un microscopio utilizzando forbici e pinzette pulite bene. In alternativa, una capsula di Petri regolari senza silicone può essere utilizzato per la dissezione. - Rimuovere la testa, coda e visceri, usando il forcipe come forbici.
- Mantenere l'embrione con la pancia contro il silicone con una pinza.
- Con un secondo paio di pinze, inserire una punta nel canale centrale del midollo spinale rostrale.
- Chiudere il forcipe per strappare il tessuto dorsale pochi millimetri.
- Ripetere questa operazione verso il lato caudale fino a quando l'intero midollo spinale è aperto (Figura 1B).
- Staccare la parte rostrale del midollo spinale (tronco cerebrale) dal corpo.
- Girare l'embrione per mantenere la colonna vertebrale aperta contro il silicone.
- Pizzicare la parte rostrale del midollo spinale e tirare l'embrione dal capo per estrarre il midollo spinale.
Nota: Meningi e gangli delle radici dorsali (DRG) devono rimanere collegati all'embrione. In caso contrario, attentamente tirare via qualsiasi residuo meninges e DRGs ancora attaccato al midollo spinale. A questo punto, DRGs potrebbero essere raccolti anche per la cultura di neuroni sensibili (vedi discussione). - Appiattire il midollo spinale sul silicone e togliere la metà dorsale del midollo tagliando lungo il centro di ogni lato usando un bisturi. Tagliare la parte centrale in 10 pezzi usando un bisturi e trasferire i pezzi in una nuova provetta.
4. sospensione di cellule di midollo spinale di
- Ripetere questa procedura di dissezione per 6 a 8 midolli spinali.
- Lasciate che il midollo spinale pezzi raccolgono nella parte inferiore del tubo e sostituire l'HBSS con 1 mL di terreno di prosciutto-F10.
- Aggiungere 10 µ l di tripsina (2,5% w/v; concentrazione finale 0.025%). Incubare la provetta per 10 min a 37 ° C.
- Per interrompere la digestione enzimatica, trasferire i frammenti di un nuovo tubo da 15 mL contenente 800 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).
- Triturare due volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min. raccogliere il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL.
- Per i frammenti, aggiungere 900 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).
- Triturare 6 volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min Aggiungi il surnatante per il tubo da 15 mL ottenuto al passaggio 4.5.
- Per i frammenti, aggiungere 900 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).
- Triturare 10 volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min Aggiungi il surnatante per il tubo da 15 mL ottenuto al passaggio 4.5. Procedere con il surnatante.
- Utilizzando una pipetta da P1000, posizionare delicatamente un cuscino di 2 mL BSA 4% (p/v) nella parte inferiore del tubo galleggiante. Centrifugare a 470 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 2 mL di terreno completo di L-15.
5. MN arricchimento di gradiente di densità
- Dividere la sospensione cellulare in due provette da 15 mL (1 mL ciascuno). Quindi, aggiungere 2 mL di terreno completo di L-15. Se a partire da 6 embrioni, è possibile utilizzare l'equivalente di 3 embrioni per tubo in 3 mL di terreno.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di gradienti di densità aggiungendo lentamente la soluzione per il fondo di ciascuna provetta per ottenere un'interfaccia tagliente.
- Centrifugare a 830 x g per 15 min a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, piccole cellule dovrebbero essere nella parte inferiore del tubo, mentre grandi cellule come MNs dovrebbero essere nell'interfaccia di medio/soluzione gradienti di densità.
- Raccogliere le cellule a livello di interfaccia di aspirazione 1 o 2 mL e trasferirli in una provetta di fresco da 15 mL. Regolare il volume a 10 mL con il mezzo di pH L-15.
- Aggiungere 2 mL del cuscino di BSA del 4% il fondo del tubo e la centrifuga a 470 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 3 mL di terreno completo di L-15.
- Ripetere il punto 5.5.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura completa. Contare il numero di cell e attuabilità sotto un microscopio a contrasto di fase con un emocitometro.
Nota: Per 6 midolli spinali, il numero delle cellule dovrebbe essere di circa 1 x 105 MNs.
6. MN cultura
- Diluire il MNs alla densità appropriata, solitamente 5.000 a 10.000 cellule in 500 µ l di terreno di coltura per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
Nota: Densità di semina è intorno 30.000 e 1.500 cellule per 6 e 96 pozzetti, rispettivamente. - Rimuovere la soluzione di laminina con un P1000.
- Trasferire immediatamente il MNs diluito in terreno di coltura in piastre di rivestimento per evitare l'essiccazione.
- Incubare la cultura per 2 giorni a 37 ° C.
7. Magnetofection di MNs
Nota: Nei passaggi seguenti, i quantitativi utilizzati sono pensati per la transfezione di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fare riferimento al protocollo del produttore di un altro formato.
- Per la preparazione di DNA, risospendere 1 µ g di DNA in 50 µ l di terreno di coltura neuronale e vortexare per 5 s.
- Per la preparazione di tubo del branello, risospendere 1,5 µ l di perline in 50 µ l di terreno di coltura neuronale.
- Aggiungere la soluzione di perlina di 50 µ l per la soluzione di DNA di 50 µ l e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (volume totale = 100 µ l).
- Durante questa incubazione, prelevare 100 µ l di terreno di coltura dal pozzo che sarà trasfettato.
Nota: Mettere la piastra magnetica nell'incubatrice per riscaldarla a 37 ° C. - Trasferire 100 µ l della miscela del DNA/tallone nel pozzetto e incubare la piastra 20 – 30 minuti sulla piastra magnetica a 37 ° C.
- Attendere almeno 24 ore prima del rilevamento di espressione di cDNA.
8. fissazione e colorazione
- Lavare la cultura 2 volte con PBS.
- Incubare la cultura per 20 min a temperatura ambiente in 4% PFA/PBS.
- Lavare la cultura 2 volte con PBS.
- Incubare la cultura in 500 µ l di tampone bloccante (PBS, 4% BSA, siero normale di 2%, 0,3% Triton X-100, glicina 0.1 M) per 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Normale del siero dovrebbe essere derivato dalla stessa specie come l'anticorpo secondario (ad esempio, del siero di capra normale). - Incubare la coltura durante la notte a 4 ° C con l'anticorpo primario diluito in 250 µ l di tampone bloccante.
Nota: ad esempio, TUJ1 viene utilizzato a 1/1000, SMI32 è usato a 1/1.000 e Lc3b viene utilizzato a 1/200. - Lavare la cultura 3 volte con PBS.
- Incubare la cultura con gli anticorpi secondari coniugati a fluorophore diluiti in 250 µ l di tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare la cultura 3 volte con PBS.
- Montare sulle lastre di vetro utilizzando il mezzo di montaggio.
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Representative Results
Dopo 24 ore nella cultura, motoneuroni (MNs) dovrebbero mostrare già significativa crescita assonale (almeno 6 volte supera rispetto alla dimensione di soma). Nei giorni seguenti, gli assoni dovrebbero continuare a crescere ed esposizione di ramificazione (Figura 2). Ci saranno diverse morfologie a causa della specificità del sottotipo. Ad esempio, colonna mediana MNs che innervano i muscoli assiali hanno assoni più brevi e più ramificati rispetto colonna laterale motore MNs che innervano i muscoli di arto18.
Questi isolamento e coltura tecniche sopra descritte recentemente sono state usate per caratterizzare una nuova mutazione nel gene del neurofilamento NEFH che causa una forma assonale autosomica dominante di CMT13. In questo caso, due giorni dopo il placcaggio, purificata MNs transfected con plasmidi che codifica la maschera di selvaggio-tipo fuso a eGFP o una forma mutante di NEFH fusa a eGFP. Due giorni più tardi, mutante NEFH-eGFP formano aggregati lungo la rete del citoscheletro. Quattro giorni dopo magnetofection, questi aggregati si è evoluto in un aggresome di perinucleare prominente che contiene l'indicatore autofagica LC3b (Figura 3). Questo approccio ci ha permesso di dimostrare che la forma mutata di NEFH ha indotto la formazione di aggregati che sono associati con vie autofagiche in MNs primario.
Figura 1: Panoramica dei principali passaggi della procedura. (A) 12.5 embrioni del mouse vengono sezionati per estrarre il corno ventrale del midollo spinale. Quindi, i neuroni dalle cellule del corno ventrale sono dissociati e MNs sono purificati mediante gradiente di densità prima placcatura. Infine, MNs sono transfettate di magnetofection e analizzati dopo pochi giorni. (B) il primo passo nella dissezione del midollo spinale è quando la lamiera del tetto del midollo spinale è aperto lungo l'asse rostro-caudale con il forcipe. Quindi, il midollo spinale è staccato dal corpo tirando il tronco cerebrale. A questo punto, meningi e gangli delle radici dorsali (DRG) rimangono sul corpo embrionale. La parte dorsale del midollo spinale è tagliata longitudinalmente con un bisturi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: cultura rappresentante MN. (A) morfologia MNs dopo 4 giorni di cultura ha rivelato dalla macchiatura della catena pesante endogeno non fosforilate neurofilament (SMI32). Barra della scala = 100 µm. (B) MNs morfologia dopo 4 giorni in vitro e trasfettate per eGFP transgene di magnetofection al giorno 2. MNs erano controcolorati con il marcatore SMI32 o il marcatore pan-neuronale Tuj1. Le frecce indicano i somas dei neuroni. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini confocal di magnetofected MNs esprimendo la wild-type o mutanti eGFP-NEFH costruisce (in verde) e macchiato per il marcatore autofagica LC3b (in rosso). Le frecce indicano mutante eGFP-NEFH aggregati proteici che sono anche LC3b positivo. Barra della scala = 10 µm. immagini vengono modificate da Jacquier et al 2017, Acta Neuropathologica comunicazione13.
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Discussion
Uno dei punti critici di questo protocollo è che gli embrioni del mouse vengono sezionati in una finestra di tempo preciso durante lo sviluppo (12.5) per ottimizzare la quantità di MNs ottenuti alla fine. Inoltre, per una resa ottimale, la dissezione deve essere eseguita al mattino o nel primo pomeriggio. Prima 12.5 (ad es., a E11.5), la dissezione è difficile, soprattutto per quanto riguarda l'eliminazione delle meningi. Dopo 12.5, il numero di MNs ottenuti scende significativamente. Per controllare la fase embrionale di sviluppo, i maschi e le femmine adulte sono innanzitutto messi insieme alla fine della giornata. La mattina successiva, gli adulti sono separati, e le femmine vengono controllate per la presenza di un plug vaginale. Se una spina è presente, gli embrioni sono a questo punto considerati in 0.5 giorno di sviluppo. Per questi esperimenti, in genere utilizziamo una linea di topo che è vigoroso e produttivo. Progenitori che proviene da una colonia allevata in Missouri sono stati utilizzati nel presente protocollo, e il ceppo è stato denominato CF1 (aziende agricole sedutoin ceppo 1). Questo ceppo è stato introdotto al Charles River Laboratories Francia nel 1967 ed ha acquistato il nome OF1 (Oncins Francia 1).
Un secondo punto critico è la procedura di centrifugazione che influenzano notevolmente la purezza della cultura. MNs rappresentano una bassa percentuale delle cellule del midollo spinale (1% circa), e l'obiettivo è di ottenere una cultura contenente MNs 40 al 50% tra altre cellule neuronali spinali e meno di 5% cellule gliali progenitrici. Per monitorare l'efficacia di centrifugazioni, sospensione campioni acquisiti prima e dopo ogni passaggio può essere placcato nel mezzo di MNs per 24 ore, di celle seguita da fissazione e colorazione per l'espressione di marcatori del neurone di motore Hb9 (81.5C10, DSHB) o isolotto-1/2 dell'isolotto (ISL1 / 40.2D6 2, /39.4D5, DSHB), cui combinazioni definiscono diversi MNs sottopopolazione19. Il più maturo MNs, altri indicatori quali colina acetil transferasi (CHAT, Ab144P) o Neurofilament H non fosforilate (SMI - 32P) possono essere utilizzati per stimare la qualità della cultura. Una buona alternativa per monitorare rapidamente l'efficacia di purificazione consiste nell'utilizzare topi transgenici che esprimono il verde fluorescente Protein (GFP) specificamente in MNs. Ad esempio, Wichterle e colleghi precedentemente sviluppavano topi transgenici che esprimono GFP sotto il controllo del mouse Hb9 (chiamato anche Hlxb9 o Mnx1) promotore18. Topi transgenici Hb9::GFP visualizzare distinti espressione della GFP in dendriti e assoni somas di MNs spinale da giorno embrionale 9.5 per 10 giorno postnatale.
MNs richiedono crescita su un substrato permissiva ottenuto con Poly-L-ornitina e rivestimento di laminina. A seconda delle condizioni sperimentali, una varietà di plastica, polimero e contenitori basati su vetro può essere utilizzata (ad es., 6-, 24-, piastre da 96 pozzetti, vetrini coprioggetto in vetro o diapositive da camera). Tra queste opzioni, dispositivi microfluidici possono essere di interesse per affrontare domande specifiche per quanto riguarda la formazione della sinapsi o orientamento e trasporto assonale20. MNs sono noti per essere sensibili ai cambiamenti nel loro microambiente che coinvolgono modelli, fattori di concentrazione, modifiche meccaniche nel substrato (ad es., rigidità), puro stress e spaziotemporali gradiente cues (ad es., rilievi topografici caratteristiche, campitura delle superfici con sostanze diverse affinità cellulare). Piattaforme di microfluidica sono sistemi che possono integrare condizioni multifattoriali, consentendo per la determinazione di microambienti cellulare ottimale.
La scoperta di sopravvivenza effetti7 di GDNF, cresce il numero di fattori neurotrofici coinvolti nella crescita iniziale di MN e sopravvivenza, orientamento e sviluppo degli assoni e induzione di plasticità sinaptica. È interessante notare che, ogni fattore agisce su una specifica sottopopolazione di MNs8. Ad esempio, CNTF è stato descritto per proteggere la colonna motore mediana (MMC) che innerva i muscoli assiali, considerando che HGF agisce sulla colonna laterale motore (LMC) che innerva i muscoli degli arti. D'altra parte, GDNF e BDNF entrambi mostrano la più forte attività di pro-sopravvivenza su intere popolazioni di MNs. Infine, la combinazione di GDNF, BDNF e CNTF è sufficiente per proteggere oltre il 70% di una popolazione di MN e viene comunemente utilizzata nei laboratori.
In condizioni di coltura standard, MNs possono essere conservati in vitro fino a 14 giorni sostituendo la metà dei terreni di coltura con fresca media una volta ogni 3 giorni, a partire dal quinto giorno della cultura. Durante la maturazione in vitro , MNs possono essere transfected di magnetofection in qualsiasi momento utilizzando questo protocollo. L'efficienza e la tossicità di questa tecnica può essere modulate dalla natura dei plasmidi e inserti. Nel nostro caso, quando magnetofection è stato effettuato sulla cultura MN dopo 2 giorni in vitro utilizzando un plasmide di 9 kb con un promotore CAGGS (pCAGEN21) controllo dei neurofilamenti cDNA, abbiamo osservato una media di 31,48% ± 9,94 (deviazione standard) di transfettate MNs post-transfezione di 48 ore. Tuttavia, per altri costrutti, un diverso rapporto di DNA/perline deve essere testato come descritto nel protocollo del produttore. Un altro parametro che può influenzare l'efficienza di trasfezione livello è la maturazione di MNs nel corso del tempo. Infatti, durante i primi 3 giorni di cultura, crescita degli assoni e l'allargamento di somas si verificherà, che aumenta la superficie dove penetrerà le perline. Questo parametro può aumentare l'efficienza di trasfezione di MN nel tempo durante la maturazione.
Infine, in confronto con culture MN, sarebbe interessante coltivare i neuroni sensoriali22,23,24. In particolare, malattia di Charcot-Marie-Tooth è una neuropatia sensitiva del motore caratterizzata da atrofia muscolare distale relativi ad la degenerazione di MNs spinale sia e neuroni sensoriali di DRGs. interessante, DRGs sono situati su entrambi i lati del midollo spinale e può essere raccolti durante la stessa procedura di dissezione utilizzata per ottenere MNs. A questo proposito, è possibile confrontare i meccanismi patofisiologici al lavoro in questi due tipi di cellule pertinenti, motoneuroni e neuroni sensibili di DRG.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la "Association pour le développement de la neurogénétique" del Dr. Jacquier fellowship e AFM-Telethon per il suo sostegno attraverso il piano strategico MyoNeurAlp. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, che hanno partecipato a sviluppare e migliorare la tecnica e diffondere la loro conoscenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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