Summary
Målet med denne teknikken er å forberede en høyanriket kultur for primære motoneurons (MNs) fra murine ryggmargen. For å vurdere konsekvensene av mutasjoner forårsaker MN sykdommer, beskriver vi her isolasjon av dette isolerte MNs og deres transfection av magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration av spinal motoneurons (MNs) er involvert i et stort spekter av nevrologiske lidelser inkludert amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom og spinal muskel atrofi, som er alle forbundet med muskel atrofi. Primære kulturer av spinal MNs har brukt mye å demonstrere involvering av bestemte gener i slike sykdommer og karakterisere mobilnettet konsekvensene av deres mutasjoner. Denne protokollen modeller en primær MN kulturen avledet fra banebrytende arbeid Henderson og kolleger mer enn tjue år siden. Først detalj vi en metode for dissekere den fremre horn i ryggmargen fra en mus embryoet og isolere MNs fra nærliggende celler med en tetthet gradering. Deretter presenterer vi en ny måte å effektivt transfecting MNs med uttrykket plasmider bruker magnetofection. Til slutt, vi illustrere hvor å fastsette og immunostai primære MNs. bruke neurofilament mutasjoner som forårsaker Charcot-Marie-Tooth sykdom type 2, denne protokollen demonstrerer en kvalitativ tilnærming til uttrykke proteiner av interesse og studere deres engasjement i MN vekst, vedlikehold og overlevelse.
Introduction
Neuromuscular sykdommen omfatter en rekke klinisk og genetisk distinkte patologi som kjennetegnes ved endring av muskler og/eller nervesystemet. På grunn av fremskritt i sekvensering teknologi, hundrevis av gener ansvarlig for disse sjeldne diagnoser har blitt identifisert i løpet av det siste tiåret (liste tilgjengelig på Neuromuscular sykdommen Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Ulike identifiserte mutasjoner angir at ulike mutasjoner i et enkelt gen kan føre til Norge og sykdommer1,2,3 og at mutasjoner i ulike gener kan produsere lignende fenotyper 4 , 5. i denne sammenheng er det innsats for å utvikle mobilnettet modeller som kan bli kraftig verktøy for å analysere mutasjon konsekvenser og patologisk mekanismer.
Spinal MNs har stor somas ligger i den ventral horn i ryggmargen, skjemaet lang axons å målrette skjelettlidelser muskel fiber, og tillate frivillig bevegelser gjennom utgivelsen av acetylcholine på nevromuskulær veikryss. Siden MNs påvirkes av nevromuskulær sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom (CMT), og spinal muskel atrofi, Dr. Henderson og kolleger utviklet den første protokoll6 som er tillatt for dyrking av i vitro spinal MNs og oppdagelsen av nevrotropisk faktor GDNF7 (glial celle avledet nevrotropisk faktor). Tekniske forbedringer siden da har tillatt for mer nøyaktig rensing av spinal MNs og undertypene bruker FACS8, men berikelse av tetthet gradert fortsatt kraftig og mye brukt i laboratorier jobber med primære spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. deretter er det også mulig å få en høyere MN rensing karakter gjennom immunopanning ved å utnytte overflaten markør p75(NTR)15,16,17.
Ryggmargen inneholder forskjellige undergrupper av cervical thorax og lumbale MNs, samt median og lateral motor kolonner som varierer plasseringen i det fremre Hornet på en dorso-ventrale akse og blant målene de innervate8, 18. primære MN kulturer kan gjenopprette alle disse MN subtyper i fysiologiske forhold. Den viktigste begrensningen av denne teknikken er lavt antall MNs på slutten av prosedyren; Faktisk, kan det forventes å få rundt 105 MNs fra seks embryo, som er egnet for mikroskopi men begrensende for biokjemi eksperimenter. Utføre eksperimenter med mer standardiserte subtyper og rikelig MNs (> 106 celler), embryonale Stamcelle-avledet MNs anses18.
Hva av vill-type/mutant effekter av transgener eller pusse endogene gener i primære MNs er en rask og nyttig verktøy for tyde physiopathological veier, spesielt når musen modeller er utilgjengelig. Magnetofection er en teknikk for transfecting primære neurons, ligner lipofection uten den relaterte nevrotoksisitet. Videre, hva kan utføres på modne nevroner etter flere dager i vitro, i motsetning til teknikker basert på electroporation9. En ulempe med denne teknikken er imidlertid at perlene binde nukleinsyrer i kultur, forårsaker støy i DAPI merking. Virusinfeksjon er trolig den mest effektive metoden for transfecting MNs; magnetofection krever imidlertid ikke bestemte prosedyrer nødvendig for viral produksjon og mobilnettet infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble akseptert av den etiske komiteen ved institusjonen.
1. løsning forberedelse
- Forberede 10 mL av 4% BSA dialyzed L-15 medium.
- Oppløse bovin serum albumin pulver på 4% (w/v) i 10 mL av L-15 medium.
- Legger til løsningen på en 20 mL dialyse bånd med en 20 kDa cut-off. Dialyze mot 500 mL L-15 medium for 3 dager under omrøring på 4 ° C. Endre L-15 mediet hver dag.
- Filtrere løsningen gjennom en 0.22 µm membranen og aliquot i 15 mL rør. Lagre rør på 20 ° C.
Merk: Denne protokollen bruker følgende referanser: uforandret rå L-15 medium = L-15 medium, sure L-15 medium = pH L-15 og grunnleggende L-15 medium = bikarbonat L-15.
- Forberede 200 mL pH L-15.
- Justere pH i L-15 mediet: først fylle en vaskeflaske med noen stykker av tørris. Injisere gass (CO2) til L-15 medium til fargen blir oransje (~ pH 6.4 og ~ 40 press). PH kan også justeres med en standard pH-meter.
- Filtrere mediet gjennom en 0.22 µm membran og butikk på 4 ° C i en måned.
- Forberede 100 mL av bikarbonat L-15.
- Legge til 2,5 mL av 7% natrium bikarbonat 97.5 mL av L-15 medium og lagre på 4 ° C.
- Forberede IPCS (Insulin Putrescin Conalbumin selenitt) kosttilskudd.
- Oppløse 2,5 mg av insulin i 0,5 mL 0.1 M HCl. Legg 4,5 mL dobbel-destillert vann.
- Oppløse 8 mg av putrescine i 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Oppløse 100 mg av conalbumin i 10 mL PBS.
- Oppløse 1 mg av natrium selenitt i 19,3 mL vann, justere pH 7,4 og fortynne løsningen 10-fold.
- Kombiner 1 mL av insulin løsning, 1 mL av putrescine løsning, 1 mL av conalbumin og 0,1 mL av natrium selenitt løsning å få 3.1 mL IPCS supplement løsning. Lagre løsningen på 20 ° C.
- Forberede en 0.02 mM progesteron løsning.
- Oppløse 1 mg av progesteron i 1.6 mL av 80% etanol.
- Fortynne løsning 100-fold i 100% etanol og lagre den på 20 ° C.
- Forberede 100 mL komplett L-15 medium.
- Legge til 1,8 mL av D-glukose løsning (200 mg/mL) 92 mL pH L-15 å få en endelig konsentrasjon av 3,5 mg/mL glukose.
- Kombiner 1 mL av 100 x Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 2 mL inaktivert hest serum 3.1 mL IPCS mix og 0,1 mL av progesteron løsning (2 x 10-5 M).
- Filtrere mediet på en 0.22 µm membran og lagre den på 4 ° C.
- Forberede 5 mL av tetthet gradert løsning (siste konsentrasjon av 5.5%) per forsøk.
- Legge til 476 µL av kommersielle 60% tetthet gradert medium 4524 µL av L-15 (om mulig uten røde fenol å øke visuell kontrast på interphase; fortynning forholdet 1:10. 5).
- Lagre løsningen på 4 ° C i 2 uker eller fryse den på 20 ° C.
- Forberede 10 mL av kultur medier.
- Legge til 200 µL av supplement medium 9,6 mL av Nevron celle kultur medium.
- Legge til 200 µL av inaktivert hest serum (som har en tendens til å skille glial celle prekursorer og arbeider mot spredning) 25 µL av glutamin og 10 µL av 2-mercaptoethanol.
- Filtrere media gjennom filtere 0.22 µm.
- Legg til følgende nevrotropisk faktorer: ciliary nevrotropisk faktor (CNTF) i en siste konsentrasjon av 10 ng/mL, og hjerne-avledet nevrotropisk faktor (BDNF) og glial celle avledet nevrotropisk faktor (GDNF) på siste konsentrasjoner av 1 ng/mL.
- Lagre media på 4 ° C.
- Forberede 50 mL av disseksjon media.
- Legge til 2,25 mL av glukose (200 mg/mL) 47.05 mL av HBSS. Legge til 700 µL av 1 M HEPES med pH 7.4. Lagre media på 4 ° C.
- Forberede en 4% PFA løsning.
- Oppløse 20 g PFA i 500 mL PBS.
- Under kjemiske hette, varme løsningen på 60 ° C og legge noen dråper av 1 M NaOH til løsningen blir klart.
- Filtrere løsningen gjennom et filter papir og justere pH til 7.2. Lagre den på 20 ° C.
Merk: Eventuelt andre kommersielle PFA løsninger kan brukes og fortynnet 4% i PBS.
- Rengjør disseksjon verktøy inkludert tang, saks og silikon retter med 70% etanol før bruk, og med såpe og klart vann etter bruk.
2. poly-ornithine/Laminin (Po/L) rett belegg
Merk: Volumer er tilpasset strøk en 24-vel plate.
- Eventuelt sette et sterilt 12 mm dekkglassvæske i brønnen.
- Coat brønner med 500 µL av 10 µg/mL Poly-L-Ornithine løsning oppløst i vann.
- La brønnene nøy 1t ved romtemperatur.
- Fjern Poly-L-Ornithine løsningen og air-dry i 30 min.
- Coat brønnene overnatting på 37 ° C med 500 µL av 3 µg/mL laminin i bikarbonat L-15.
Merk: Brønner kan lagres på 37 ° C i 7 dager i inkubator. For lang incubations, kan legger sterilt PBS mellom brønnene hjelpe for å unngå middels fordampning.
3. disseksjon
- Ofre en gravid mus når embryoene på gryende scenen E12.5. Rengjør magen med 70% etanol.
- Fjerne livmoren ved å kutte de to oviducts og skjeden og putte den i en Petriskål fylt med kaldt PBS (uten Ca2 + Mg2 +).
- Samle alle embryoer og overføre dem til friske, kaldt PBS (uten Ca2 + Mg2 +) i en Petriskål.
- Sette en embryoet i en rett belagt med silikon og full av disseksjon media (med HBSS, 4,5 finans glukose og 7 mM HEPES pH 7.4).
Merk: Embryo disseksjon utføres under et mikroskop med rene fine tang og saks. Alternativt kan en vanlig Petriskål uten silikon brukes for disseksjon. - Fjerne hodet, hale og viscera, bruke tang som saks.
- Opprettholde embryoet med magen mot silikon med tang.
- Med et par pinsett, setter du inn et av tipsene i det sentrale kanalen i ryggmargen rostral.
- Lukk tang å rive dorsal vevet noen millimeter.
- Gjenta denne operasjonen mot caudal side til hele ryggmargen er åpen (figur 1B).
- Koble den rostral delen av ryggmargen (cerebral trunk) fra kroppen.
- Slå embryoet for å opprettholde åpne ryggmargen mot silikon.
- Klemme den rostral delen i ryggmargen og trekk embryoet av hodet til ekstra ryggmargen.
Merk: Meninges og dorsal root Ganglion (DRGs) bør være knyttet til fosteret. Ellers trekk forsiktig unna eventuelle gjenværende meninges og DRGs fortsatt festet til ryggmargen. På dette trinnet, DRGs kan også hentes for følsom Nevron kultur (se diskusjon). - Flat ryggmargen på silikon og fjerne hudskjelettet av ledningen ved å kutte langs midten av hver side bruker en skalpell. Den midtre delen skjære 10 stykker ved hjelp av en skalpell og overføre bitene til en ny tube.
4. ryggmargen celle suspensjon
- Gjenta dette disseksjon for 6-8 spinal snorer.
- La ryggmargen samle på bunnen av røret og erstatte HBSS med 1 mL av skinke-F10 medium.
- Legge til 10 µL av trypsin (2,5% w/v, siste konsentrasjon 0.025%). Inkuber røret i 10 min på 37 ° C.
- For å stoppe enzymatisk fordøyelsen, overføre fragmenter til en ny 15 mL tube med 800 µL av komplett L-15 medium, 100 µL på 4% (w/v) BSA og 100 µL av DNase (1 mg/mL i L-15 medium).
- Triturate to ganger av aspirating 1 mL bruker en P1000 pipette. La fragmenter betale for 2 min. samle nedbryting i en fersk 15 mL tube.
- Legge til 900 µL av komplett L-15 medium, 100 µL på 4% (w/v) BSA og 100 µL av DNase (1 mg/mL i L-15 medium) fragmenter.
- Triturate 6 ganger av aspirating 1 mL bruker en P1000 pipette. La fragmenter nøy 2 min. Legg nedbryting til 15 mL røret fikk i trinn 4.5.
- Legge til 900 µL av komplett L-15 medium, 100 µL på 4% (w/v) BSA og 100 µL av DNase (1 mg/mL i L-15 medium) fragmenter.
- Triturate 10 ganger av aspirating 1 mL bruker en P1000 pipette. La fragmenter nøy 2 min. Legg nedbryting til 15 mL røret fikk i trinn 4.5. Fortsett med nedbryting.
- Bruker en P1000 Pipetter, forsiktig plassere en 2 mL BSA 4% (w/v) pute nederst på supernatant tube. Sentrifuge 470 x g i 5 min.
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellets med 2 mL komplett L-15 medium.
5. MN berikelse av Gradient tetthet
- Dele celle suspensjon i to 15 mL rør (1 mL hver). Legg deretter til 2 mL av komplett L-15 medium. Hvis starter med 6 embryo, kan du bruke tilsvarende 3 embryo per rør i 3 mL medium.
- Legge til 2 mL tetthet gradert løsning ved sakte legger løsningen til bunnen av hver rør en skarp grensesnittet.
- Sentrifuge 830 x g i 15 min ved romtemperatur. Etter dette trinnet, bør små celler være på bunnen av røret, mens store celler som MNs bør være på tetthet gradert løsning og mellomstore grensesnittet.
- Samle cellene på grensesnittet aspirating 1 eller 2 mL og overføre dem til en frisk 15 mL tube. Juster volumet til 10 mL med L-15 pH medium.
- Legg 2 mL 4% BSA pute til bunnen av røret og sentrifuge 470 x g for 5 min ved romtemperatur.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 3 mL av komplett L-15 medium.
- Gjenta trinn 5.5.
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 2 mL fullstendig kultur medium. Telle celle nummer og levedyktighet under fase kontrast mikroskop med en hemocytometer.
Merk: For 6 spinal snorer, celle nummer forventes å være rundt 1 x 105 MNs.
6. MN kultur
- Fortynne MNs til den aktuelle tettheten, vanligvis 5000 til 10.000 celler i 500 µL av kultur medium per brønn i en 24-vel plate.
Merk: Seeding tetthet er rundt 30.000 og 1500 celler for 6 - og 96-brønnen plater, henholdsvis. - Fjern laminin løsningen med en P1000.
- Øyeblikkelig overføre MNs fortynnet i kultur medium i belegg platene for å unngå tørking.
- Inkuber kulturen i 2 dager på 37 ° C.
7. Magnetofection av MNs
Merk: I følgende trinn, mengder brukt er ment for hva et godt av en 24-vel plate. Se produsentens protokoll for et annet format.
- DNA forberedelse, resuspend 1 µg DNA i 50 µL av neuronal kultur medium og vortex 5 s.
- For perle tube forberedelse, resuspend 1,5 µL av perler i 50 µL av neuronal kultur medium.
- Legge 50 µL perle løsningen til 50 µL DNA løsningen og Inkuber for 20 min ved romtemperatur (totalt volum = 100 µL).
- Under denne inkubasjon trekke 100 µL av kultur medium fra brønnen som vil være transfected.
NOTE Sette magnetisk plate i inkubator å varme det 37 ° C. - Overføre 100 µL av DNA/perle blandingen til brønnen, og ruge platen 20-30 minutter på magnetisk plate på 37 ° C.
- Vent minst 24 timer før oppdagelsen av cDNA uttrykk.
8. fiksering og flekker
- Vask 2 ganger med PBS kulturen.
- Inkuber kultur for 20 min i romtemperatur i 4% PFA/PBS.
- Vask 2 ganger med PBS kulturen.
- Inkuber kulturen i 500 µL blokkerer bufferen (PBS, 4% BSA, 2% normal serum, 0,3% Triton X-100, 0.1 M glysin) 1t ved romtemperatur.
Merk: Normal serum skal hentes fra den samme arten som sekundær antistoffer (f.eks Normal geit Serum). - Inkuber kulturen overnatting på 4 ° C med primære antistoff fortynnet i 250 µL blokkerer bufferen.
Merk: For eksempel TUJ1 brukes i 1/1000 SMI32 brukes på 1/1000 og Lc3b brukes på 1/200. - Vask kulturen 3 ganger med PBS.
- Inkuber kulturen med fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet i 250 µL blokkerer bufferen i 1 time ved romtemperatur.
- Vask kulturen 3 ganger med PBS.
- Montere på glass lysbilder ved hjelp av montering medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 24 timer i kultur, bør motoneurons (MNs) allerede viser betydelig axonal vekst (minst 6 ganger lengre enn soma). I de følgende dagene, bør axons fortsette å vokse og vise forgrening (figur 2). Det vil være ulike morphologies på grunn av undertype særegenheter. For eksempel median kolonnen MNs som innervate aksial musklene har kortere og mer forgrenet axons enn lateral motor kolonnen MNs som innervate lem muskler18.
Disse isolasjon og dyrking teknikker beskrevet ovenfor har nylig blitt brukt som kjennetegner en ny mutasjon i neurofilament genet NEFH som forårsaker en autosomal dominant axonal form for CMT13. I dette tilfellet, to dager etter plating, renset MNs var transfekterte med Plasmidene koding en mutant form for NEFH del eGFP eller skjemaet vill-type del eGFP. To dager senere, muterte NEFH-eGFP dannet aggregater langs cellen cytoskjelett nettverket. Fire dager etter magnetofection, disse aggregater utviklet seg i en fremtredende perinuclear aggresome som inneholder LC3b autophagic markøren (Figur 3). Denne tilnærmingen mulig for oss å demonstrere at mutant form av NEFH indusert dannelsen av aggregater som er forbundet med autophagic stier i primære MNs.
Figur 1: oversikt over fremgangsmåten hovedtrinn. (A) E12.5 mus embryoer er dissekert for å pakke ut ventral horn i ryggmargen. Deretter neurons fra ventral horn celler er atskilt og MNs blir renset ved tetthet gradert før plating. Endelig er MNs transfekterte av magnetofection og analysert etter noen dager. (B) er det første trinnet i ryggmargen disseksjon når takplate i ryggmargen åpnes langs rostro-caudal aksen med tang. Deretter er ryggmargen løsrevet fra kroppen ved å trekke cerebral bagasjerommet. Foreløpig forblir meninges og dorsal root Ganglion (DRG) på embryonale kroppen. Delen dorsal i ryggmargen skjæres langs med skalpell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant MN kultur. (A) MNs morfologi etter 4 dager kultur avslørt av farging av endogene ikke fosforylert neurofilament tunge kjede (SMI32). Skala bar = 100 µm. (B) MNs morfologi etter 4 dager i vitro og transfekterte for eGFP transgene av magnetofection på dag 2. MNs var counterstained med markøren SMI32 eller pan-nevrale merket Tuj1. Pilene viser somas av neurons. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: AC confocal bilder av magnetofected MNs uttrykker vill-type eller mutant eGFP-NEFH bygger (i grønt) og farget for autophagic markøren LC3b (i rødt). Pilene viser mutant eGFP-NEFH protein aggregater som også LC3b positive. Skala bar = 10 µm. bilder endres fra Jacquier et al. 2017, Acta Neuropathologica kommunikasjon13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de kritiske punktene i denne protokollen er at de mouse embryoene er dissekert på en presis vinduet under utvikling (E12.5) å optimalisere mengden MNs på slutten. I tillegg for optimal avkastning, skal dissection utføres i morgen eller tidlig på ettermiddagen. Før E12.5 (f.eks på E11.5) er disseksjon vanskelig, spesielt om eliminering av meninges. Etter E12.5 drops antall innhentet MNs betydelig. For å kontrollere embryoet utviklingstrinn, plasseres voksne hunner og hanner først sammen på slutten av dagen. Neste morgen, voksne skilles og kvinner kontrolleres for tilstedeværelsen av en vaginal plugg. Hvis en plugg, anses foreløpig embryo i E0.5 dagen i utvikling. For disse eksperimentene bruker vi vanligvis en mus linje som er sterk og produktiv. Progenitors stammer fra en koloni oppvokst i Missouri ble brukt i denne protokollen, og belastningen ble kalt CF1 (Carworth gårdene press 1). Denne belastningen ble introdusert på Charles elv laboratorier Frankrike i 1967, og det fikk navnet OF1 (Oncins Frankrike 1).
En andre kritiske punktet er sentrifugering trinnene som stor innflytelse renheten av kulturen. MNs representerer en lav prosentandel av ryggmargen cellene (rundt 1%), og målet er å oppnå en kultur som inneholder 40-50% MNs blant andre spinal neuronal celler og mindre enn 5% glial celle progenitors. Overvåke effekten av centrifugations, celle suspensjon prøver kjøpt før og etter hvert trinn kan være belagt i MNs medium for 24 timer, etterfulgt av festing og flekker for uttrykket av motoriske nervecellen markører Hb9 (81.5C10, DSHB) eller Holme-1/Islet-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), som kombinasjoner definere forskjellige MNs subpopulasjon19. Mer modne MNs, kan andre markører som kolin Acetyl Transferase (CHAT, Ab144P) eller Neurofilament H ikke fosforylert (SMI - 32 P) brukes til å beregne kvaliteten på kultur. Et godt alternativ for raskt overvåke effekten av rensing er å bruke transgene mus som uttrykker den grønne fluorescerende Protein (GFP) spesielt i MNs. For eksempel utviklet Wichterle og kolleger transgene mus uttrykke GFP under kontroll av musen Hb9 (også kalt Hlxb9 eller Mnx1) promoter18. Hb9::GFP transgene mus viser tydelig uttrykk for GFP i axons og dendrites, og somas av spinal MNs fra embryonale dag 9.5 postnatal dag 10.
MNs krever vekst på en ettergivende substrat ved Poly-L-Ornithine og laminin belegg. Avhengig av eksperimentelle forhold, en rekke plast-, polymer- og glass-basert beholdere kan brukes (f.eks 6-, 24-96-brønns tallerkener, glass coverslips, eller kammer lysbildene). Blant disse alternativene, kan microfluidic enheter være av interesse å løse spesifikke spørsmål om synapse formasjon eller axonal veiledning og transport20. MNs er kjent for å være følsomme for endringer i deres microenvironment med mønstre, konsentrasjon faktorer, mekaniske endringer i underlaget (f.eks stivhet), ren stress og spatiotemporal gradient signaler (f.eks topografiske funksjoner, mønstre av overflater med stoffer av forskjellige mobilnettet interesseområder). Microfluidic plattformer er systemer som kan integrere multifaktoriell forhold, slik at for fastsettelse av optimal mobilnettet microenvironments.
Siden oppdagelsen av GDNFS overlevelse effects7vokser antall nevrotropisk faktorer involvert i MN første vekst og overlevelse, veiledning og utvikling av axons og indusere av synaptiske plastisitet. Interessant, fungerer hver faktor på en bestemt subpopulasjon av MNs8. For eksempel har CNTF blitt beskrevet for å beskytte median motor kolonnen (MMC) som innervates aksial muskler, mens HGF virker på den laterale motor kolonnen (LMC) som innervates lem muskler. På den annen side, Vis både GDNF og BDNF sterkeste Pro overlevelse aktiviteten på hele populasjoner av MNs. Til slutt, kombinasjonen av GDNF og BDNF CNTF er tilstrekkelig for å beskytte mer enn 70% av MN innbyggere og er vanlig i laboratorier.
I standard kultur forhold, kan MNs holdes i vitro til 14 dager ved å erstatte halvparten av kultur media med fersk media en gang hver 3 dager, fra den femte dagen av kultur. Under i vitro modning, kan MNs være transfected av magnetofection når som helst bruker denne protokollen. Effektivitet og toksisitet av denne teknikken kan være modulert av plasmider og setter inn. I vårt tilfelle, når magnetofection ble utført på MN kultur etter 2 dager i vitro bruker en 9 kb plasmider med en CAGGS promotor (pCAGEN21) kontrollere neurofilament cDNA, observerte vi en gjennomsnittlig 31.48% + 9.94 (standardavvik) av transfekterte MNs 48 timer etter hva. Likevel, for andre konstruksjoner, ulike forholdet DNA/perler bør testes som beskrevet i produsentens protokollen. En annen parameter som kan påvirke hva nivå effektiviteten er modning av MNs over tid. Faktisk i de første 3 dagene av kultur skjer vekst axons og utvidelse av somas, noe som øker arealet der perlene vil trenge. Denne parameteren kan øke MN transfection effektivitet over tid under modning.
Til slutt, med MN kulturer, det ville være interessant å dyrke sensoriske neurons22,23,24. Spesielt er Charcot-Marie-Tooth sykdom en sensoriske motor nevropati preget av distale muskelsvinn relatert til degenerering av både spinal MNs og sensoriske neurons DRGs. interessant, DRGs ligger på begge sider av ryggmargen og kan samlet under samme disseksjon prosedyren brukes til å innhente MNs. I denne forbindelse, er det mulig å sammenligne patofysiologiske mekanismer på jobb i disse to relevante celletyper, motoneurons og DRG følsom neurons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke den "Association helle le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquiers fellesskap og AFM-Telethon for støtte gjennom MyoNeurAlp strategisk plan. Vi vil også gjerne takke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul og Dr. Georg Haase, som deltok i utvikle og forbedre teknikken og spre kunnskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
