Summary
Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.
Abstract
Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .
Introduction
Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung1,2steuert, 3,4,5. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten5 beitragen können , 6 , 7 , 8. Z. B. Aktivierung von Endothelzellen nach innen Gleichrichter Kir2.1 und Ca2 +-aktivierte K+ (KCa2,3, KCNN3) Kanäle nach Ca2 + Zustrom von Flüssigkeitsströmung vorgeschlagen worden ist, beizutragen zur Flüssigkeit strömungsinduzierte Vasodilatation6,7,8. Daher viele Ionenkanäle, vor allem mechanisch aktiviert oder -gehemmte Kanäle wurden untersucht im Hinblick auf die Kraftempfindlichkeit Fluid Flow/Scherung mit der Patch-Clamp Technik6,9,10 , 11. abhängig vom experimentellen Protokoll während Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt, Ergebnisse und Interpretation der Daten auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen können jedoch fehlerhafte10,11.
Eine Quelle der Flüssigkeit strömungsinduzierte Artefakte in der Patch-Clamp-Aufnahme ist aus der Kreuzung zwischen der Badflüssigkeit und Ag/AgCl Referenz-Elektrode11möglichen. Es wird allgemein angenommen, dass die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl Elektroden konstant ist wie die Cl– -Konzentration der Flüssigkeit Baden konstant gehalten, ist unter Berücksichtigung der chemischen Reaktion zwischen der Baden-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode zu werden:
AG + Cl–↔ AgCl + Elektron (e–) (Gleichung 1)
Jedoch in einem Fall, wo die insgesamt elektrochemische Reaktion zwischen dem Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Gleichung 1) von links nach rechts verläuft, verweisen die Cl– -Konzentration der Baden Flüssigkeit neben der Ag/AgCl Elektrode (ungerührte Grenzschicht12,13,14,15) möglicherweise viel geringer als die in der Masse der Lösung, Baden, sofern genügend Konvektion Transport gewährleistet ist. Mit einer alten oder nicht-ideale Ag/AgCl-Elektrode mit unzureichenden Chlorierung der Ag kann dieses Risiko erhöhen. Dieses Fluid Flow-bezogene Artefakt an der Referenzelektrode, in der Tat kann ausgeschlossen werden, indem Sie einfach eine herkömmliche Agarose-Salz-Brücke zwischen Baden Fluid und Referenz Elektrode, da das Artefakt auf Veränderungen im realen Cl– Angrenzend an die Ag/AgCl-Elektrode11Konzentration. Das Protokoll in dieser Studie vorgestellt beschreibt die verhindern, dass die Junction Flow-im Zusammenhang mit möglichen Änderungen und echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht zu messen.
Nach dem Platzieren einer Agarose KCl-Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, ist ein weiterer entscheidender Faktor, der berücksichtigt werden sollte: nur als Referenz Ag/AgCl-Elektrode wirkt wie ein Cl– -Elektrode, die Ionenkanäle auch funktionieren können wie eine ionenselektive Elektrode. Die Situation der eine ungerührte Grenzschicht zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode entsteht während der Bewegung der Ionen zwischen den extrazellulären und intrazellulären Lösungen durch die Membran-Ionenkanäle. Dies impliziert, dass Vorsicht bei Auslegung der Verordnung von Ionen durch Flüssigkeitsströmung Kanäle verwendet werden soll. Wie in unserer vorherigen Studie11besprochen, die Bewegung von Ionen durch eine Lösung, in denen eine elektrochemische Steigung vorliegt, kann auftreten, über drei verschiedene Mechanismen: Diffusion, Migration und Konvektion, wo Diffusion die Bewegung ist induziert durch Konzentrationsgradienten, Migration ist die Bewegung von elektrischen Gradienten angetrieben und Konvektion ist die Bewegung durch Fluid-Flow. Unter diesen drei Transportmechanismen trägt Konvektion-Modus die meisten um die Bewegung von Ionen11 (> 1.000 Mal größer als Diffusion oder Migration unter üblichen Patch-Clamp-Einstellungen). Dies bildet die theoretische Basis warum Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr unter verschiedenen statischen und Fluid-Flow Bedingungen11kann.
Gemäß der Hypothese oben vorgeschlagen, einige facilitatory Effekte der Strömung auf die aktuellen Ionenkanal können entnommen werden die konvektive Wiederherstellung der realen Ionenkonzentrationen angrenzend an die Kanal-Einlass an der Membranoberfläche (ungerührte Grenzschicht) 10. In diesem Fall die strömungsinduzierte Effekte von Flüssigkeiten auf Ionen-Kanal Strömungen entstanden einfach aus elektrochemischen Ereignisse nicht von der Regelung der Ionen-Kanal gating. Eine ähnliche Idee wurde zuvor von Barry und Kollegen12,13,14,15 basierend auf strengen theoretischen Überlegungen und experimentelle Beweise, auch bekannt als die ungerührte Schicht vorgeschlagen oder Transport-Nummer-Effekt. Wenn einige Ionenkanäle genügend auftreten Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit, ausreichend Transport Preise durch die Kanäle (Transport schneller in der Membran als in der ungerührte Membranoberfläche), einen Grenzschicht-Effekt zur Verfügung zu . So kann die Konvektion-abhängige Transport zum eventuellen Flüssigkeit-strömungsinduzierte Erleichterungen von Ionen-aktuelle10,12,13,14,15beitragen.
In dieser Studie betonen wir, wie wichtig es ist, mit einem Agar oder Agarose Salz-Brücke während des Studiums Flüssigkeit-strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Wir bieten auch eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht angrenzend an die Ag/AgCl Referenz-Elektrode und Membran Ionenkanäle. Darüber hinaus bieten die theoretische Interpretation der Flüssigkeit strömungsinduzierte Modulation der Ionen-Kanal Ströme (z. B. Konvektion Hypothese oder ungerührte Transport Nummer Ebeneneffekt) wertvolle Erkenntnisse für die Gestaltung und Interpretation von Studien auf die Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen. Nach dem ungerührte Grenzschicht Transport Nummer Effekt sagen wir voraus, dass Ionen-Kanal Ströme durch alle Arten von Ionenkanälen Membran durch Flüssigkeitsströmung, unabhängig von ihrer biologischen Empfindlichkeit gegenüber Flüssigkeitsströmung Querkraft, aber nur wenn gefördert werden kann die Ionenkanäle haben ausreichende Einkanal-Leitfähigkeit und lange offene Zeit. Höheren Stromdichten der Ionen-Kanal kann die ungerührte Grenzschicht Wirkung an der Oberfläche der Zellmembran erhöhen.
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Protocol
Alle Versuche wurden nach den institutionellen Vorgaben der Konkuk Universität durchgeführt.
(1) Agarose Salz Brücken zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode
Hinweis: Agarose 3M KCl Salz Brücken wie zuvor entstehen beschrieben12 mit geringfügigen Änderungen.
- Bildung von Brücken
- Beugen Sie Feuer Glas-Kapillarröhrchen um eine U-Form entsprechend bilden. Der Innendurchmesser der Kapillaren sollte groß genug für die Verringerung der Serienwiderstand beim großen Ionen-Strömungen aufnehmen. Rohre mit einem Innendurchmesser von 2-5 mm sind in der Regel akzeptabel.
- Vorbereitung der Agarose 3 M KCl-Lösung
- Bereiten Sie 100 mL 3 M KCl-Lösung (1 M oder 2 M ist auch akzeptabel).
- Wiegen Sie 3 g Agarose.
- Lösen der Agarose in 100 mL KCl (d. h. 3 % Agarose) auf einer heißen Platte zwischen 90 und 100 ° C.
- Laden die Brücken mit 3 M KCl agarose
- Zum einfachen beladen, Tauchen Sie die u-förmige Glasbrücken in der Agarose-KCl-Lösung.
Hinweis: Es ist leicht zu graben, die gläserne Brücken, wenn die Agarose-KCl-Lösung in einem flachen und breiten Container enthalten ist. - Halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) für die Agarose zu setzen und zu härten.
- Sorgfältig die Agarose-KCl-geladen Glasbrücken aus dem Satz/gehärtet Agarose-Salz auszugraben.
- Zum einfachen beladen, Tauchen Sie die u-förmige Glasbrücken in der Agarose-KCl-Lösung.
- Speicherung der Brücken
- Bereiten Sie genügend Volumen (z.B. 500 mL) der 3 M KCl-Lösung in einer weiten-necked Flasche.
- Die vorbereiteten Agarose-Salz-Brücken in der Flasche im Kühlschrank aufbewahren.
2. Anwendung der Flüssigkeitsströmung Querkraft auf Zellen in einer Patch-Klemmung Kammer
Hinweis: Ein schematisches Diagramm der Patch-Clamp-Versuchsanordnung ist in Abbildung 1dargestellt.
- Ort ein Container beladen Bade-Lösung (Volumen und Höhe sollte bereits gemessen werden) über die Patch-Clamp-Kammer.
- Füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer mit der Baden-Lösung durch Absaugen der Röhre.
- Um die Strömung zu stoppen, clip das Rohr seitlich des Containers, die Strömung zu blockieren, dann clip den Schlauch auf der Saugseite, das Saugen zur gleichen Zeit zu stoppen. Dies ist der "stationären" Kontrollbedingung.
- Um Flüssigkeitsströmung Querkraft anzuwenden, öffnen Sie beide Rohre an den Container und Absaugung Seiten zur gleichen Zeit.
- Vor oder nach der Anwendung die Flüssigkeitsströmung Scherkraft auf die Zelle, die Durchflussmenge in mL/min messen.
- Den Durchfluss durch die Messung des Rückgang Flüssigkeitsvolumen über einen bestimmten Zeitraum zu berechnen.
- Aus dem gemessenen Volumenstrom und Geometrie (Struktur) der Kammer Baden sollte die Scherkraft, die von der Strömung auf die Zelle angewendet (siehe Diskussion) geschätzt werden.
- Alternativ zur Steuerung der Durchflussmenge (für Schritte 2,3-2,6) verwenden Sie eine Perfusion Pumpe. In diesem Fall achten Sie, eine konstante, anstatt eine pulsierende Strömung.
3. Messung der Veränderungen der Flüssigmetall-Junction-Potenzial durch Strömung zwischen Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Abbildung 3A)
- Verwenden Sie die Ag/AgCl-Elektrode oder Pellets, die von der Fertigprodukte, ohne die Agarose Salzbrücke erhältlich ist.
- Bereiten Sie eine normale physiologische Salz Kochsalzlösung für die Baden-Kammer (z.B., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-Glucose, pH 7.4 mit NaOH angepasst).
- Legen Sie eine Patch-Pipette mit einer 3 M KCl-Lösung in der Kammer, die Kreuzung Potenzialverschiebung zwischen der Pipette und Baden Lösungen zu minimieren.
- Beheben den Voltage-Clamp-Verstärker in den aktuellen Klemme-Modus ("ich = 0" oder "CC").
- Messen Sie nach zunichte macht das erste Offset Potenzial Änderungen in der Spannung induziert durch verschiedene Durchflussmengen.
- Erneut prüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Änderungen in der Spannung Flüssigmetall/Kreuzung Potentiale sind, die Wirkung der Strömung auf die Kreuzung Potenzial über die Agarose-Salz-Brücke zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode.
4. experimentelle Abschätzung der Real Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht neben Ag/AgCl-Elektrode unter statischen Zustand (Abb. 3 b)
- Zeichnen Sie aus den Ergebnissen von Schritt 3 die Kreuzung Potenzial-Durchfluss-Beziehungen und schätzen Sie den Wert der maximalen (Sättigung) der Kreuzung Potenzialverschiebung durch die supra-Fluid Flow Rate.
- Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von Cl (d.h., 50, 99, 147, 195 und 288 mM NaCl).
- Zeichnen Sie durch eine Änderung der Cl– -Konzentration in der Flüssigkeit Baden die Kreuzung Potential-[Cl–] Beziehung. Beachten Sie, dass die flüssige Rate konstant und hoch genug sein sollte (> 30 mL / min), die Abnahme der Konzentration der Cl– mit derjenigen der angrenzenden Ag/AgCl-Referenzelektrode zu verhindern.
- Schätzen Sie aus den beiden Beziehung Kurven die Konzentrationsänderungen Cl– aus der gemessenen Kreuzung Potenzialverschiebung.
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Representative Results
Ganze Zelle spannungsabhängige L-Typ Ca2 + -Kanal (VDCCL) Strömungen verzeichneten die enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten, wie oben beschrieben11. Die arteriellen Myozyten wurden mit einer Cs-reiche Pipette Lösung unter der Nystatin-perforierten Konfiguration mit zweiwertigen kationen frei Baden Lösung zur Erleichterung des Stromfluss durch VDCCL11,16dialysiert. Kurze depolarisierende Spannung Rampen oder Spannungsstufen auf einem Holding-Potenzial von-70 mV, wurden eingesetzt, um die VDCCL -Ströme zu entlocken. Eine repräsentative Strom-Spannung (Ich-V) Beziehung in VDCCL in Abwesenheit und Anwesenheit der Strömung (5 mL/min oder etwa 0,004 m/s), aufgenommen mit einer Agarose KCl-Brücke, ist in Abbildung 2Adargestellt. Leicht erhöht Flüssigkeitsströmung VDCCL Strom in eine Spannung-unabhängige Weise. Diese unterstützende Wirkung der Flüssigkeitsströmung auf VDCCL aktuelle wird in Abbildung 2 bzusammengefasst.
Die Spannung-unabhängige Erleichterung der VDCCL aktuelle durch Strömung ist eine angemessene Reaktion des VDCCL Flüssigkeit oder scher Kraft. 5 mL/min bzw. ca. 0.004 m/s der Strömung in der aktuellen Versuchsaufbau wurde Schätzungen zufolge etwa 0,1 dyn/cm2 in Bezug auf Querkraft (siehe Diskussion). Jedoch wenn der Ag/AgCl verweisen war Elektrode direkt an die Baden-Flüssigkeit ohne eine Agarose KCl-Brücke, die ich-V Beziehung im Beisein von Flüssigkeitsströmung verschoben auf der rechten Seite im Vergleich zu den VDCCL Strömungen unter einer statischen verbunden Zustand (Abbildung 2 und 2D). Dies führte in der Hemmung der VDCCL aktuelle bei negativen Spannungen und Erleichterung der VDCCL zurzeit mehr depolarisiert oder positive Potenziale. Dies ist ein Beispiel für das Fluid strömungsinduzierte Artefakt in der Patch-Clamp-Aufnahme, in dem eine Spannung Verschiebung der ich-V Beziehung wurde nicht aufgrund von der Änderung der Kanal gating aber war eigentlich durch eine Kreuzung Potenzialverschiebung zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl verweisen Sie Elektrode11. Direkte Beweise für das Fluid strömungsinduzierte Kreuzung Potenzialverschiebung ist in Abbildung 3dargestellt.
Die Kreuzung mögliche Verschiebungen wurden nach Schritt 3 gemessen. Die Änderungen aufgrund von Strömung, wurden mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl, wie oben beschrieben11bewertet. Mit einem offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl die Kreuzung Potenzial zwischen der Pipette und Baden Lösungen minimiert werden könnte, und die möglichen Änderungen durch Flüssigkeitsströmung stammten hauptsächlich aus Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode. Ohne eine Agarose 3 M KCl Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, Flüssigkeitsströmung verschoben potenziellen Kreuzung zwischen der Flüssigkeit und Ag/AgCl-Elektrode in einer Flüssigkeitsströmung Rate-abhängigen Weise (Abb. 3A). Die maximale Kreuzung mögliche Änderung war extrapoliert, um ~ 7 mV aus der Kreuzung Potenzial-Fluid Flow Beziehung (Abb. 3A, unten). Im Gegensatz dazu wenn die Agarose 3 M KCl Brücke diente, Flüssigkeitsströmung änderten nichts an die Kreuzung Potenzial zwischen Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode (zusammengefasst in dem unteren Diagramm der Abbildung 3A, unten).
Um Konzentrationsunterschiede zwischen den statischen und Fluid Flow-Bedingungen zu messen, in denen genügend Konvektion Wirkmechanismen funktionieren, haben wir untersucht die Auswirkungen einer Änderung Cl– -Konzentrationen auf der Baden-Flüssigkeit-Ag/AgCl-Elektrode Kreuzung potenzielle gemäß Schritt 4. Erhöhung der Konzentration von Cl– die Kreuzung Potenzial in einer Konzentration-abhängigen Weise verschoben (Abb. 3 b, oben) nur als Strömung die Kreuzung Potenzial in einer Rate-abhängigen Weise verschoben. Mit einer KCl-Agarose-Brücke, verhinderte die Kreuzung Potenzial ändern in einem Cl– Konzentration-abhängigen Weise (Abbildung 3), darauf hinweist, dass der Kreuzung mögliche zwischen der Bad-Lösung und Referenz-Elektrode Änderung, nicht zwischen dem Bad und Pipette Lösungen. Die semi-Anmeldung Handlung der Kreuzung Potenzial-[Cl–] Beziehung wird im unteren Bereich der Abbildung 3 bangezeigt. Nach den Ergebnissen in Abb. 3 b, dem hochgerechneten maximalen Wert von ~ 7 mV in Kreuzung Potenzialverschiebung (aus Abbildung 3A) legt nahe, dass die Cl– -Konzentration angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode ~ 70 % verringert die durchschnittliche Konzentration der Masse Flüssigkeit Baden, wenn Strömung nicht vorhanden ist (Abb. 3 b, unten).
In unserem vorangegangenen Studie wurden Kir2.1 Strömungen durch Flüssigkeitsströmung erleichtert werden, durch die convectively Wiederherstellung (zunehmende) [K+] am Kanal Einlass10gemeldet. Diese Idee stammt aus der Phänomene, die zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Elektrode, wie der Kir2.1-Kanal als K+ Elektrode ebenso wie die Ag/AgCl-Elektrode-Funktionen wie ein Cl– -Elektrode funktionieren kann. Diese Idee ist schematisch in Abbildung 4A und 4 bdargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für flüssige strömungsinduzierte Erleichterung der Kir2.1 Ströme ist in Abbildung 4gezeigt. Kir2.1 Strömungen wurden ausgelöst durch eine hyperpolarizing Spannung Schritt aus einem Holding-Potential von 0-100 mV in Ratte Basophile Leukämie (RBL) Zellen. Anwendung der Strömung (5 mL/min oder 0,004 m/s) erhöht leicht den Kir2.1 Strom (Abbildung 4). Diese Erleichterung durch Strömung wurde bisher vorgeschlagen, nicht durch zellulare signalisieren, sondern durch die elektrochemische Wirkung der konvektive Transporte von K+ -Ionen auf die ungerührte Grenzschicht10vermittelt wird.
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Kammer Baden für die Fluid-Flow Regulierung von Ionenkanälen in der Patch-Clamp-Aufnahme zeigt. Unteren Bereich ist die Seitenansicht (sagittale Abschnitt) der Patch-Clamp-Kammer. Er fasst den Weg der Flüssigkeitsströmung und Standorte der untersuchten Handy, Elektroden und Einlass/Auslass des Fluids. Da die Flüssigkeit kontinuierlich durch Auslaufrohr durch Absaugen abgepumpt ist, ist die Höhe der Flüssigkeit in der Kammer auf einem relativ konstanten Niveau beibehalten. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Auswirkungen der Flüssigkeit fließen auf L-Type spannungsabhängige Ca2 + -Kanal (VDCCL) Strömungen mit und ohne die Agarose 3 M KCl-Brücke. VDCCL Strömungen in der enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten mit Nystatin perforierten Patch-Clamp-Aufnahme aufgenommen wurden. Normale Tyrode physiologische Salzlösung mit 4,2 mM EDTA ohne zweiwertigen kationen diente als Baden Lösung11. Die Pipette Lösung enthaltenen CsCl, 140 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0,05 mM; 7.2 mit CsOH der pH-Wert eingestellt. (A und B) Mit Agarose 3M KCl-Brücke. (A) eine repräsentative ich-V Beziehung für das laufende VDCCL und die Auswirkungen der Flüssigkeitsströmung. (B) die Effekte von Flüssigkeiten auf das ich-V Verhältnis von VDCCL Strömungen im Überblick. (C und D) Ohne Agarose 3M KCl zu überbrücken. (C) ich-V Beziehungen der VDCCL Ströme. (D) Ich-V Beziehungen von VDCCL Spitzenströme in Abwesenheit und Anwesenheit der Flüssigkeitsströmung zusammengefasst. Die Formen der Spannungsstufen für VDCCL Strömungen zu entlocken sind in der Abbildung Inset angegeben. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Beeinflussung der Flüssigkeitsströmung Flüssigmetall-Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl verweisen, Elektrode und Einschätzung der realen Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Referenzelektrode von der gemessenen Kreuzung Potenzial. (A) A repräsentative Ablaufverfolgung Kreuzung möglicher Änderungen aufgrund der verschiedenen Tarife der Strömung (obere Leiste). Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung11geändert. Die Kreuzung Potenzial-Fluid Flow Rate Beziehung (n = 5). (B) oberen Panel: Vertreter Aufnahme Kreuzung möglicher Änderungen durch verschiedene Konzentrationen von NaCl-Lösungen. Unten: die semi-Anmeldung Handlung der Kreuzung Potenzial-[Cl–] Beziehung (n = 5). Die gerade Linie in Rot steht für die beste Passform durch eine modifizierte Nernst-Gleichung für das Gleichgewicht mit einem zehn-fache Gefälle von 49 möglichen mV. Aufgrund der endlichen Selektivität der Na+, im Vergleich zu der Cl-, zur Erzeugung der Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial des Neigungswerts 49 mV anstatt 58 mV, produziert die beste Passform in der Kreuzung Potenzial-[Cl–] Beziehung im Raum Temperatur. 49-mV Hang gibt den Cl– Abhängigkeit (oder Selektivität) der Ag/AgCl Referenz Elektrode > 95 % über die andere Ionen (in diesem Fall, Na+), nach der Goldman-Hodgkin-Katz Spannung Gleichung. Eine Verschiebung der 7 mV bei einer Cl– -Konzentration von 150 mM zeigt eine Abnahme von ~ 30 % der Cl– -Konzentration. (C) eine repräsentative Ablaufverfolgung Kreuzung Potenzial in verschiedenen Konzentrationen der NaCl-Lösungen mit einem Einsatz von 3 M KCl-Agarose-Brücke (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Schematische der Auswirkungen der Konvektion Modell der Strömung auf die Ionenkonzentrationen angrenzend an die offenen Kanäle in Ionen-Stromfluss. (A) unter statischen Bedingungen mit wenig konvektiven Transport von Ionen in der Lösung mit elektrischen Feld, das K+ Ion flux durch K+-selektive Ionenkanäle können dazu führen, einen Rückgang der K+ -Konzentrationen in der Microdomain neben der Kanal-Eingang. (B) Strömung kann die Abnahme der K+ Konzentration angrenzend an den offenen Kanal Einlass convectively wiederherstellen. (C) Wirkung der Strömung auf die innere Gleichrichter Kir2.1 Kanal Ströme. Flüssigkeitsströmung erhöht sofort die Kir2.1 strömen. Die Form der Spannung Schritt ist in der Abbildung Inset dargestellt. Die Kir2.1 Ströme verzeichneten mit hoher K+-Bade- und - Pipette Lösungen. Baden Lösung: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-Glucose; pH auf 7,4 mit NaOH angepasst. Pipette Lösung: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM Ethylenglykol-Bis (2-Aminoethyl)-N, N, N', N',-Tetraacetic Säure (EGTA), pH 7,2 (mit KOH eingestellt). Da RBL - 2H 3 Zellen sehr anfällig für Hypo-osmotischen Schwellung sind und konsequente Trigger Volume aktiviert CL– Strömungen, 38 mM Saccharose wurde hinzugefügt, um die Baden-Lösung für Osmolarität anpassen und Zelle Schwellung zu verhindern. Darüber hinaus wurde die Pipette Lösung zur Beseitigung von Verunreinigungen durch Cl– Strömungen ein Cl– -Kanal-Blocker [4, 4'-Diisothiocyano-2, 2'-Stilbenedisulfonic Säure (DIDS, 30 µM)] hinzugefügt. Gruppe C wurde von einer früheren Veröffentlichung10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl– -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer Agarose KCl Brücke zwischen Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit kann Cl– Konzentration-bezogene Fehler oder Artefakte während der Patch-Clamp-Aufnahme verhindern.
Neben betonend, wie wichtig eine Agar oder Agarose Salzbrücke, ist eine weitere Anwendung dieser Methode bei der Abschätzung der realen Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht wie folgt. Weil plasmalemmal Ionenkanäle als ionenselektive Elektroden (ebenso wie die Ag/AgCl-Elektrode Funktionen wie eine Cl– -Elektrode), die echte Ionenkonzentration in der ungerührte Grenze funktionieren können Schicht neben dem Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche kann die durchschnittliche Konzentration der Masse Flüssigkeit unterscheiden. Dieser Unterschied in Ionen-Konzentration zwischen der Großteil flüssig und ungerührte Schicht neben Zellmembran ist das reale Szenario unter klinischen Bedingungen und sollten von der biologischen Modulation der Kanal Anspritzung von Fluid Flow/Querkraft unterschieden werden. Im Gegensatz zu den ungerührte Ebeneneffekt zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit beheben nicht wir leider das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran, wenn die Regulierung von Ionenkanälen durch Fluid Flow/Querkraft zu studieren.
Jedoch angesichts der Erkenntnis, dass echte Ionenkonzentration in der ungerührte Schicht etwa 70 % davon in loser Schüttung Flüssigkeit (Abbildung 3), können wir einige Änderungen in den experimentellen Daten, die biologische Modulation der Ionenkanäle unterscheiden vom "elektrochemische Phänomen der ungerührte Ebeneneffekt". Die echte Ionenkonzentration in der ungerührte Schicht an der Oberfläche der Zellmembran war voraussichtlich ca. 70 % der durchschnittlichen Konzentration der Lösung in einer jüngsten Studie10Baden Masse. Da Strömung die verminderte Ionenkonzentration wiederhergestellt, erleichtert es die aktuellen unabhängig von Mobilfunk-Signalisierung10Kir2.1. In unserem vorherigen Studie Stromdichte war sehr hoch (2,5 A / m2) mit einem hohen extrazellulären K+ Konzentration und hohe Expression von Kir2.1 in RBL Zellen10. Jedoch kann bei echten Zellmembranen mit verschiedenen Ionen-Kanal Stromdichte Amplituden, die ungerührte Ebeneneffekt an der Oberfläche der Zellmembran stark die Amplitude der Ionen-Kanal Stromdichte abhängen. Außerdem kann einige Ionen Kanal Ströme (vor allem solche mit relativ niedriger Stromdichten) dadurch Flüssigkeit Durchflussregulierung unempfindlich sein; Obwohl das ungerührte Ebeneneffekt elektrochemisch und nicht biologisch geregelt ist. So beeinträchtigt dies die hier beschriebene Technik. Deshalb untersucht die Möglichkeit der Entwicklung einer quantitativen Methode, die angemessen ist für experimentelle Ergebnisse korrigieren sollten in Zukunft Studien.
In Abbildung 3haben wir beobachtet, dass Flüssigmetall-Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit stark abhängig von der Bedingung der Ag/AgCl-Elektrode war. In der Tat, wenn die Ag/AgCl-Elektrode war perfekt in einem Zustand, Veränderungen der Kreuzung durch Strömung war minimal (Daten nicht gezeigt). Jedoch verursacht schlechte Chlorierung der Ag/AgCl-Elektrode eine größere Verschiebung in der Kreuzung potenzielle. Da die Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr anfällig für verschiedene äußere Reize, wie ultraviolettes Licht und oxidativen Stress, ist ist mit einem Agar oder Agarose KCl-Brücke immer empfehlenswert. Obwohl Änderungen an Kreuzung Potenzial von Flüssigkeit zwischen fließen Baden Flüssigkeit und die Bezugselektrode eine potenzielle Fehlerquelle ist, wir geschätzt erfolgreich die echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht durch die Messung der Verschiebung der Kreuzung Potenzial unter verschiedenen Flüssigkeit-Flussraten (Abbildung 3A und 3 b).
Der kritische Punkt in Schritt 4 für die Vorbereitung der Standardkurve für die Schätzung der real Cl– -Konzentration im ungerührte Grenzschichten von der Verschiebung der Kreuzung Potenzial ist, dass die Standardkurve unter einer ausreichend Durchflussmenge aufgezeichnet werden soll (30 mL / min in diesem Experiment). Obwohl diese Flussrate sehr schnell ist, in praktischen Fällen die schneller die Flüssigkeit ist je kleiner Konzentration Tropfen an den Grenzschichten (Abbildung 3). Darüber hinaus muß die offenen Pipette eingefüllt werden hohe KCl, statt einer regulären Pipette Lösung in Reihenfolge für eine Patch-Clamp-Studie, die Änderung der Kreuzung Potenzial zwischen einer Pipette und Baden Lösung zu verhindern.
Die Scherkraft in der Patch-Clamp-Einstellung kann von der folgenden Beziehung11geschätzt werden:
Τ = (6μQ) / (bh2) (Gleichung 2)
Wo: τ ist die Schubspannung (N/cm2); Μ ist die Viskosität (0,001 N m/s2 für Wasser bei 20 ° C); Q ist die Strömung-Rate (m3/s); b ist die Kammer Breite (m); und h ist die Kammer Höhe (m). Wenn die Strömung 30 mL/min beträgt ist die Schubkraft in der Patch-Kammer, die in Abbildung 1 dargestellte voraussichtlich ~0.75 dyn/cm2 nach der obigen Gleichung. Dies ist eine geringe Scherkräfte Kraftniveau im Vergleich zu den physiologischen Querkraft; endotheliale Zellen in den Blutgefäßen können um bis zu 40 dyn/cm18,19Scherkräften ausgesetzt werden. Daher vorausgesetzt, dass die Ionenkanäle nicht empfindlich gegenüber Scherkräften weniger als 0,75 dyn/cm2sind, können wir das Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit von Ionenkanälen studieren nach Ausschluss des ungerührte Grenzschicht-Effekts durch die Festlegung der Kontrollbedingung auf 0,75 dyn/cm2. Allerdings scheinen einige Ionenkanäle, einschließlich Kir2.1, empfindlich gegenüber Scherkräften weniger als 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
Das ungerührte Ebeneneffekt wurde ursprünglich von Barry und Kollegen12,13,14,15vorgeschlagen. Hier bieten wir eine Methode um echte Ionenkonzentration in der ungerührte Schicht durch die Messung der Veränderungen der Kreuzung Potenzial mit offenen Patch-Clamp-Pipette zu schätzen. Wir empfehlen außerdem, dass diesbezügliche ungerührte Grenzschicht dazu, Fluid strömungsinduzierte Regulierung der Ionen-Kanal Ströme beitragen kann und während des Studiums Fluid Flow-Mechanosensitivity von Ionenkanälen betrachtet werden. Jedoch muss auf der Grundlage dieser Hypothese, es eventuell warum einige Ionen-Kanal Strömungen sind nicht empfindlich gegen Fluid Flow-abhängige Verordnung wenn eine elektrochemische ungerührte Grenzschicht wirkt eher als biologische Schädlingsbekämpfung. Wie oben kurz angesprochen liegt dies wahrscheinlich daran nur Ionen Ströme durch Kanäle mit großen genug Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit durch Flüssigkeitsströmung erleichtert werden kann. Das heißt, für die Einrichtung der ungerührte Schicht, in der die Ionenkonzentration anders als der Durchschnitt in loser Schüttung Lösung ist, Fluss in der Membran-Phase schnell genug mit verglichen werden sollte, dass in der wässrigen-14 Phase. Wir haben vor kurzem vorgeschlagen, dass der Strom durch Kir2.1 Kanäle, deren Leitfähigkeit und offene Zeit ausreichend hoch sind, durch die Strömung über Mechanismen der konvektiven Wiederherstellung der Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht der erleichtert wird Zellmembran Oberfläche11.
Abschließend stellen wir eine Methode zur Messung der Konzentration der Ionen in der Elektrode und Zellmembran Referenzfläche mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette neben ungerührte Grenzschicht. Neben betonend, wie wichtig eine Agarose KCl-Brücke, stellt diese Methode auch eine Möglichkeit für das ungerührte Ebeneneffekt Konto beim interpretieren Fluid Flow/Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch den Pionier Research Center Program (2011-0027921), von Basic Science Research Programme (2015R1C1A1A02036887 und NRF-2016R1A2B4014795 durch die National Research Foundation of Korea gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT) unterstützt. & Zukunft planen, und durch einen Zuschuss der Korea Health Technology R & D Projekt durch Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert durch das Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
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