Summary
Mechanosensitive jonkanaler studeras ofta när det gäller flytande flöde/shear kraft känslighet med patch-clamp inspelning. Men beroende på det experimentella protokollet, kan resultatet på flytande flöde-reglemente av jonkanaler vara felaktig. Här, ger vi metoder för att förebygga och korrigera sådana fel med en teoretisk bas.
Abstract
Vätskeflöde är en viktig miljömässig stimulans som styr många fysiologiska och patologiska processer, såsom flytande flöde-inducerad vasodilatation. Även om de molekylära mekanismerna för biologiska Svaren till vätska flöde/tvärkraften inte är helt klarlagda, kan vätska flöde-medierad reglering av ion kanal gating bidra kritiskt. Därför har flytande flöde/shear kraft känslighet av jonkanaler studerats med hjälp av patch-clamp teknik. Men beroende på det experimentella protokollet, kan vilka resultat och tolkning av data vara felaktig. Här presenterar vi experimentella och teoretiska bevis för flytande flöde-relaterade fel och ger metoder för skattning, förebygga och korrigera dessa fel. Förändringar i korsningen potentiella mellan Ag/Granulatfyllda referenselektrod och bad vätska mättes med en öppen pipett fylld med 3 M KCl. vätskeflöde kan sedan flytta vätska/metal junction potential att ungefär 7 mV. Omvänt, genom att mäta spänning skiftet framkallas genom vätskeflöde, uppskattade vi ion koncentrationen i unstirred gränsskikt. I statiskt tillstånd når de verkliga jonkoncentrationer intill Ag/Granulatfyllda referens elektrod eller ion kanal inloppet vid cellmembranet ytan så låg som ca 30% av som i flödet villkorar. Att placera en agaros 3 M kan KCl bro mellan de bada vätska och referenselektrod ha hindrat detta problem av korsningen potentiella skiftande. Unstirred lagereffekten angränsande till cellmembran ytan kunde dock inte fastställas på detta sätt. Här, tillhandahåller vi en metod för att mäta verkliga jonkoncentrationer i unstirred gränsskikt med en öppen patch-clamp pipett, betonar vikten av att använda en agaros salt-bron medan du studerar vätska flöde-inducerad förordning av ion strömmar. Därför kan denna nya strategi, som tar hänsyn till de verkliga koncentrationerna av joner i unstirred gränsskikt, tillhandahålla användbar insikt på experimentell design och tolkning av data relaterade till vätska skjuvspänningen reglering av jonkanaler .
Introduction
Vätskeflöde är en viktig miljö cue som styr många fysiologiska och patologiska processer såsom flytande flöde-inducerad vasodilatation och vätska shear kraft-beroende vaskulära omdaning och utveckling1,2, 3,4,5. Även om de molekylära mekanismerna för biologiska Svaren till vätskeflöde tvärkraften inte är helt klarlagda, tror man att vätskan flöde-medierad reglering av ion kanal gating kritiskt kan bidra till vätska flöde-inducerad Svaren5 , 6 , 7 , 8. till exempel, aktivering av endotel inåt likriktaren Kir2.1 och Ca2 +-aktiverade K+ (KCa2.3, KCNN3) kanaler efter Ca2 + tillströmning av vätskeflöde har föreslagits bidra till vätska flöde-inducerad vasodilatation6,7,8. Därför många jonkanaler, särskilt mekaniskt aktiverad eller -hämmas kanaler, har studerats i form av vätska flöde/shear kraft känslighet med patch-clamp teknik6,9,10 , 11. men beroende på den experimentella protokoll utförs under patch-clamp inspelning, resultat och tolkning av data på flytande flöde-reglementet av jonkanaler kan vara felaktig10,11.
En källa av vätska flöde-inducerad artefakter i patch-clamp inspelningen är från korsningen potentiella mellan bad vätska och Ag/Granulatfyllda referens elektrod11. Det anses allmänt att vätska/metal korsningen potentiella mellan bad vätska och Ag/Granulatfyllda elektrod är konstant eftersom Cl– koncentrationen av badningen vätska hålls konstant, med tanke på den kemiska reaktionen mellan bad lösningen och Ag/Granulatfyllda elektrod vara:
AG + Cl–↔ Granulatfyllda + elektron (e–) (ekvation 1)
Dock i ett fall där den övergripande elektrokemisk reaktionen mellan bad lösning och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda (ekvation 1) intäkter från vänster till höger, Cl– koncentrationen av badningen vätska intill den Ag/Granulatfyllda referera elektroden (unstirred gränsskikt12,13,14,15) kan vara mycket lägre än i huvuddelen av badningen lösning, såvida inte tillräckligt convectional transport säkerställs. Med en gammal eller icke-ideala Ag/Granulatfyllda elektrod med otillräcklig klorering av Ag kan öka risken. Denna vätska flöde-relaterade artefakt på referenselektroden, i själva verket kan uteslutas genom att placera en konventionell agaros-salt bro mellan bad vätska och referens elektrod, eftersom artefakten är baserad på förändringar i verkliga Cl– koncentration intill Ag/Granulatfyllda elektrod11. Det protokoll som presenteras i denna studie beskrivs hur att förhindra flödet-relaterade junction potentiella ändringar och mäta riktiga jonkoncentrationer i unstirred gränsskikt.
Efter att placera en agaros KCl bro mellan bad vätska och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda, finns det en annan avgörande faktor som bör beaktas: bara som referens-Ag/Granulatfyllda elektrod som fungerar som en Cl– elektrod, jonkanalerna kan också fungera som en jonselektiv elektrod. Situationen för en unstirred gränsskikt mellan bad vätska och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda uppkommer under rörelsen av joner mellan de extracellulära och intracellulära lösningarna genom jonkanaler i membranet. Detta innebär att försiktighet bör iakttas när tolkningen regleringen av ion kanaler genom vätskeflöde. Som diskuterats i vår tidigare studie11, förflyttning av joner genom en lösning där en elektrokemisk gradient är närvarande kan ske via tre olika mekanismer: diffusion, migration och konvektion, där diffusion är rörelsen induceras av koncentration gradient, migration är den rörelse som drivs av elektrisk lutning och konvektion är rörelsen genom vätska-flöda. Bland dessa tre transportmekanismer bidrar konvektion läge mest till rörelsen av joner11 (> 1 000 gånger större än diffusion eller migration under vanliga patch-clamp-inställningar). Detta utgör den teoretiska grunden för varför korsningen potentiella mellan bad vätska och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda kan mycket under olika statiska och vätska-flöda villkor11.
Enligt hypotesen föreslås ovan, några facilitatorisk effekter av vätskeflöde på den nuvarande jonkanalen kan härledas ur konvektiv återställandet av riktiga jonkoncentrationer intill kanalen inloppet på membran ytan (unstirred gränsskikt) 10. vätska flöde-inducerad effekterna på ion kanal strömmar uppkommit i det här fallet helt enkelt elektrokemiska händelser, inte från regleringen av ion kanal gating. En liknande idé föreslogs tidigare av Barry och kollegor12,13,14,15 baserat på rigorös teoretiska överväganden och experimentella bevis, även känd som unstirred lagret eller transport nummer effekt. Om vissa jonkanaler har tillräcklig kan enskild kanal konduktans och tillräckligt lång öppen-tid att tillhandahålla tillräcklig transport priser genom kanaler (transporter snabbare i membranet än i unstirred membran yta), ett gränsskikt effekt uppstå . Således, konvektion-beroende transport kan bidra till att eventuell vätska-flöde-inducerad lättnader av ion nuvarande10,12,13,14,15.
I denna studie betonar vi vikten av att använda en agar eller agaros salt-bron medan du studerar vätska-flöde-inducerad förordning av ion strömmar. Vi ger också en metod för att mäta verkliga jonkoncentrationer i unstirred gränsskikt intill Ag/Granulatfyllda referens elektrod och membran jonkanaler. Dessutom kan teoretisk tolkning av vätska flöde-inducerad modulering av ion kanal strömmar (dvs konvektion hypotes eller unstirred transport nummer lagereffekt) ge värdefulla insikter för att konstruera och tolka studier på shear kraft-regleringen av jonkanaler. Enligt unstirred gränsskikt transport nummer effekten förutspår vi att ion kanal strömmar genom alla typer av membran jonkanaler kan underlättas genom vätskeflöde, oberoende av deras biologiska känslighet för vätskeflöde tvärkraften, men endast om jonkanalerna har tillräcklig enskild kanal konduktans och öppen-länge. Högre ion kanal strömtätheter kan öka unstirred gränsskikt effekten på cellmembran ytan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimenten utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna Konkuk University.
1. Agarens Salt broar mellan bad lösning och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda
Obs: Agaros 3M KCl salt broar tillverkas som tidigare beskrivits12 med smärre variationer.
- Bildandet av broar
- Böj de brand glas kapillärrör för att bilda en U-form som är lämpligt. Den inre diametern av kapillärerna bör vara tillräckligt stor för att minska serie motstånd vid inspelning stora ion strömmar. Rör med en inre diameter av 2-5 mm är vanligtvis acceptabelt.
- Beredning av agaros 3 M KCl lösning
- Förbereda 100 mL 3 M KCl lösning (1 M eller 2 M är också acceptabelt).
- Väga 3 g av agaros.
- Upplösa Agarens i 100 mL KCl (dvs 3% agaros) på en värmeplatta mellan 90 och 100 ° C.
- Laddar broarna med 3 M KCl agaros
- För smidig lastning, fördjupa U-formade glas broar i agaros-KCl lösning.
Obs: Det är lätt att gräva ut glas broar om agaros-KCl lösningen finns i en ytlig och bred behållare. - Hålla dem över natten i rumstemperatur (RT) för Agarens att ställa och härda.
- Försiktigt gräva ut agaros-KCl-loaded glas broar från set och härdade agaros-salt.
- För smidig lastning, fördjupa U-formade glas broar i agaros-KCl lösning.
- Lagra broarna
- Förbereda tillräckligt med volym (dvs. 500 mL) 3 M KCl lösning i en wide-necked flaska.
- Förvara beredd agaros-salt broarna i flaskan i kylskåp.
2. tillämpning av vätskeflöde tvärkraften till celler i en Patch-fastspänning kammare
Obs: En schematisk bild av patch-clamp experimental set-up visas i figur 1.
- Plats en behållare lastas med bad lösning (volym och höjd bör redan vara mätt) ovan patch-clamp kammaren.
- Fyll i patch-clamp kammaren med bad lösningen genom sugning röret.
- För att stoppa vätskeflöden, klämma röret vid behållarens sida att blockera strömningen och sedan klämma röret på sugsidan att stoppa sugningen samtidigt. Detta är villkoret ”stationära” kontroll.
- För att applicera vätskeflöde tvärkraften, öppna båda rören på behållaren och sug sidor samtidigt.
- Före eller efter applicering vätskeflöde tvärkraften till cellen, mäta flödet i mL/min.
- Beräkna flödet genom att mäta minskningen av flytande volym över en given tid.
- Från den uppmätta flöde och geometri (struktur) på bad avdelningen beräknas tvärkraften tillämpas till cellen av strömningen (se diskussionsavsnittet).
- Alternativt, för att styra flödet (för steg 2.3-2.6), använda en perfusion pump. I detta fall, var noga med att säkerställa en konstant i stället för ett pulserande flöde.
3. mäta förändringar i vätska-metall Junction Potential genom vätskeflöde mellan bad lösning och Ag/Granulatfyllda referenselektrod (figur 3A)
- Använda Ag/Granulatfyllda elektrod eller pellets, som är tillgängliga från de färdiga produkterna, utan agaros salt bron.
- Förbereda en normal fysiologisk salt koksaltlösning för badning kammaren (t.ex., 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukos; pH justeras till 7,4 med NaOH).
- Placera en lapp pipett som innehåller en 3 M KCl-lösning i kammaren att minimera junction potentiella skiftet mellan i pipetten och bad lösningar.
- Fixa spänning-clamp förstärkaren till aktuellt läge för klämman (”jag = 0” eller ”CC”).
- Efter omintetgöra den inledande offset potentialen, mäta förändringar i spänning induceras av olika flöden.
- För att kontrollera att ändringarna i spänning vätska/metal junction potentialer, ompröva effekten av vätskeflöde på korsningen potential använda agaros-salt bron mellan bad lösning och Ag/Granulatfyllda elektrod.
4. experimentell uppskattning av äkta Cl– koncentration i Unstirred lagret intill Ag/Granulatfyllda elektrod Under statiska förhållanden (figur 3B)
- Från resultaten av steg 3, rita junction potential-flöde relationer och beräkna maximal (mättar) värdet av korsningen potentiella Skift av supra-fluid flödet klassar.
- Bereda lösningar med olika koncentrationer av Cl (dvs. 50, 99, 147, 195 och 288 mM NaCl).
- Genom att ändra Cl– koncentration i badning vätska, rita junction potentiella-[Cl–] förhållandet. Observera att den vätska som ska vara konstant och tillräckligt hög (> 30 mL / min) att förebygga minskningen av Cl– koncentration med den intilliggande referenselektroden av Ag/Granulatfyllda.
- Från två relation kurvorna, uppskatta ändringarna i Cl– koncentration från det uppmätta junction potentiella skiftet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela cellen spänningsberoende L-typ Ca2 + kanal (VDCCL) strömmar registrerades i den enzymatiskt spridda råtta mesenterica arteriell myocyter, som tidigare beskrivits11. De arteriella myocyter var dialyseras med en Cs-rika pipett lösning under konfigurationen av nystatin-perforerade med tvåvärda katjon-fria bad lösning för att underlätta strömflödet genom VDCCL11,16. Korta depolariserande spänning ramper eller spänningen steg, på en anläggning potential -70 mV, tillämpades för att framkalla VDCCL strömmarna. En representativ ström-spänning (I-V) förhållandet i VDCCL i frånvaro och närvaro av vätskeflöde (5 mL/min eller ca 0,004 m/s), inspelad med en agaros KCl bridge, visas i figur 2A. Vätskeflöde ökade något VDCCL nuvarande i spänning-oberoende sätt. Denna underlättande effekt av vätskeflöde på VDCCL nuvarande sammanfattas i figur 2B.
Spänning-oberoende underlättande av VDCCL aktuell genom vätskeflöde är ett korrekt svar på VDCCL vätska eller skjuvning kraft. 5 mL/min eller ca 0,004 m/s av vätskeflöde i aktuella experimentella inställning uppskattades motsvara ungefär 0,1 dyn/cm2 när det gäller tvärkraften (se diskussion). Dock när den Ag/Granulatfyllda referera var elektrod direkt kopplad till badning vätskan utan en agaros KCl bridge, jag-V förhållandet i närvaro av vätskeflöde skiftat till höger jämfört VDCCL strömmarna under en statisk tillstånd (figur 2 c och 2D). Detta resulterade i hämning av VDCCL nuvarande vid negativa spänningar och underlättande av VDCCL ström vid mer Aricebo eller positiv potential. Detta exemplifierar vätska flöde-inducerad artefakt i patch-clamp inspelning där en spänning förskjutning av jag-V relationen var inte på grund av ändring av kanal gating men var faktiskt på grund av en junction potentiella övergång mellan bad vätska och Ag/Granulatfyllda referera till elektroden11. Direkta bevis för flytande flöde-inducerad junction potentiella övergången visas i figur 3.
Korsningen potentiella arbetsskiften mättes enligt steg 3. Förändringarna, på grund av vätskeflöde, mättes med hjälp av en öppen pipett fylld med 3 M KCl, som tidigare beskrivits11. Med en öppen pipett fylld med 3 M KCl, korsningen potentiella mellan pipetten och bad lösningar skulle kunna minimeras, och de potentiella förändringarna på grund av vätskeflöde var främst från badning lösning och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda. Utan en agaros 3 M KCl bro mellan bad vätska och referenselektrod av Ag/Granulatfyllda, vätskeflöde skiftat korsningen potentiella mellan vätskan och Ag/Granulatfyllda elektroden i ett vätskeflöde hastighet-beroende sätt (figur 3A). Den maximala junction potentiella förändringen var extrapoleras för att vara ~ 7 mV från korsningen potential-vätska flöda förhållandet (figur 3A, botten). Däremot när Agarens 3 M KCl bron användes, vätskeflöde förändrade inte korsningen potentiella mellan de bada vätska och referenselektrod (sammanfattas i figuren längst ner i figur 3A, undre).
För att mäta koncentration skillnader mellan de statiska och vätska flödesförhållanden, i vilken tillräckligt konvektion verkningssätt är funktionella, undersökte vi effekten av att ändra Cl– koncentrationer på badning vätska-Ag/Granulatfyllda elektroden korsningen potentiella enligt steg 4. Öka koncentrationen Cl– skiftade korsningen potential i ett koncentrationsberoende sätt (figur 3B, top) precis som vätskeflöde skiftade korsningen potential i ett kurs-beroende sätt. Med en KCl agaros bridge hindrades junction potential från att ändra i en Cl– koncentrationsberoende sätt (figur 3 c), vilket indikerar att korsningen potentiella förändringen inträffade mellan den bad lösning och referenselektrod, inte mellan bad och pipett lösningar. Halvlogaritmiskt handlingen i korsningen potential-[Cl–] förhållandet visas i den nedersta panelen i figur 3B. Enligt resultaten i figur 3B, extrapolerade maximal värdet av ~ 7 mV i korsningen potentiella Skift (från figur 3A) antyder att Cl– koncentrationen intill Ag/Granulatfyllda referenselektroden minskar till ~ 70% av den genomsnittliga koncentrationen av huvuddelen badar vätska när vätskeflöde är frånvarande (figur 3B, botten).
I vår tidigare studie rapporterades Kir2.1 strömmar underlättas genom vätskeflöde genom att återställa convectively (ökande) [K+] på kanal inlopp10. Denna idé härstammar från de fenomen som uppstår mellan bad vätska och Ag/Granulatfyllda elektrod, som den Kir2.1 kanalen kan fungera som en K+ elektrod precis som Ag/Granulatfyllda elektrod funktioner som en Cl– elektrod. Denna idé illustreras schematiskt i figur 4A och 4B. Ett representativt exempel på flytande flöde-inducerad underlättande av Kir2.1 strömmar visas i figur 4 c. Kir2.1 strömmarna var framkallas av ett hyperpolarizing spänningen steg från en anläggning potential för 0 -100 mV i råtta basofila leukemi (RBL) celler. Tillämpningen av vätskeflöde (5 mL/min eller 0,004 m/s) ökade lätt Kir2.1 nuvarande (figur 4 c). Denna underlättande av vätskeflöde föreslogs tidigare för att medlas av cellulär signalering utan av elektrokemiska effekten av konvektiv transporter av K+ joner till unstirred gränsskikt10.
Figur 1: Schematisk visar inställning av badningen kammaren för vätska-flöda regleringen av jonkanaler i patch-clamp inspelningen. Nedre panelen är vyn sida (sagittal sektion) av patch-clamp kammaren. Det sammanfattar sökvägen till vätskeflöde och platser för en studerade cell, elektroder och inlopp/utlopp av vätska. Eftersom vätskan pumpas kontinuerligt ut genom utloppet tube av sug, upprätthålls höjden av vätska i kammaren på en relativt konstant nivå. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekter av vätska flöde på L-typ spänningsberoende Ca2 + kanal (VDCCL) strömmar med och utan Agarens 3 M KCl bridge. VDCCL strömmar registrerades i den enzymatiskt spridda råtta mesenterica arteriell myocyter med nystatin perforerade patch-clamp inspelning. Normala tyrode fysiologisk saltlösning med 4,2 mM EDTA utan divalenta katjoner användes som bad lösning11. Pipett lösningen innehöll CsCl, 140 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0,05 mM; pH justeras till 7,2 med CsOH. (A och B) Med agarosgelelektrofores 3M KCl-bron. (A) en representativ jag-V relation för den VDCCL aktuellt och effekterna av vätskeflöde. (B) Sammanfattning av vätska effekter på jag-V förhållandet av VDCCL strömmar. (C och D) Utan agaros 3M KCl överbrygga. (C) jag-V relationer av VDCCL strömmar. (D) sammanfattade jag-V relationer av peak VDCCL strömmar i frånvaro och närvaro av vätskeflöde. Former av spänningen steg för framkalla VDCCL strömmar visas i den figur infällt. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekter av vätskeflöde på vätska-metall junction potentiella mellan bad vätska och Ag/Granulatfyllda referera elektrod och uppskattning av äkta Cl– koncentration i unstirred lagret intill referenselektroden från uppmätta korsningen potentialen. (A) A representativa spårning av korsningen potentiella förändringar på grund av olika priser för vätskeflöde (övre panel). Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation11. Korsningen potential-fluid flödet klassar förhållandet (n = 5). (B) övre panelen: representant inspelning av korsningen potentiella förändringar på grund av olika koncentrationer av NaCl lösningar. Nedre panelen: halvlogaritmiskt handlingen i korsningen potential-[Cl–] förhållandet (n = 5). Den raka linjen i rött representerar den bästa passformen av en modifierad Nernst-ekvationen för jämvikt potential med en tiofaldig lutning på 49 mV. På grund av begränsad selektivitet Na+, jämförelse med Cl-, för att generera vätska/metal korsningen potentiella, lutning värdet av 49 mV, i stället för 58 mV, producerade den bästa passformen i korsningen potential-[Cl–] förhållandet på rummet temperatur. 49-mV lutningen anger Cl– beroende (eller selektivitet) Ag/Granulatfyllda referens elektrod > 95% över andra jonen (i detta fall, Na+), enligt Goldman-Hodgkin-Katz spänning ekvation. En förskjutning av 7 mV vid en Cl– koncentration av 150 mM indikerar en minskning av ~ 30% i Cl– koncentrationen. (C) A representativa spårning av korsningen potentiella i olika koncentrationer av NaCl lösningar med användning av 3 M KCl agaros bridge (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk av effekterna av konvektion modell av vätskeflöde på jonkoncentrationer som gränsar till de öppna kanalerna under ion nuvarande flux. (A) under statiska förhållanden med lite konvektiv transport av joner i lösningen med elektriskt fält, K+ ion flux genom K+-selektiva jonkanaler kan orsaka en minskning av K+ koncentrationer i microdomain intill den Channel inlet. (B) vätskeflöde kan convectively återställa minskningen i K+ koncentration intill inloppet öppen kanal. (C) effekten av vätskeflöde på aktiv likriktare Kir2.1 kanal strömmarna. Vätskeflöde ökade omedelbart Kir2.1 strömmarna. Form av steget spänning visas i den figur infällt. Kir2.1 strömmarna var inspelade med hög K+-bad och -pipett lösningar. Bad lösning: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukos; pH justeras till 7,4 med NaOH. Pipettera lösning: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM etylenglykol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic acid (EGTA), pH 7,2 (justerat med KOH). Eftersom RBL - 2H 3 celler är mycket mottagliga för hypo-osmotiska svullnad och därav följande utlösare av volym-aktiverat Cl– strömmar, 38 mM sackaros lades till badning lösning för att justera för osmolaritet och förhindra cell svullnad. Dessutom lades en Cl– -kanal blockerare [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic syra (DIDS, 30 µM)] till pipetten lösning för att eliminera all kontaminering av Cl– strömmar. Panel C har ändrats från en tidigare publikation10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi visat en metod för att mäta verkliga Cl– koncentration i anslutning till Ag/Granulatfyllda referenselektroden unstirred lagret genom att bestämma vätska-metall korsningen potentiella med en öppen patch-clamp pipett fylld med en hög KCl koncentrationen. Förändringen i Cl– koncentration i gränsskiktet kan resultera i en förskjutning av korsningen potential när du byter från statisk till vätska-flöda villkor. Helt enkelt använda en agaros KCl bro mellan referenselektrod och bad vätska kan förhindra Cl– koncentration-relaterade fel eller artefakter under patch-clamp inspelning.
Förutom att betona vikten av en agar eller agaros salt bridge, är en annan tillämpning av denna metod för att uppskatta riktiga jonkoncentration i unstirred gränsskikt som följer. Eftersom plasmalemmal jonkanaler kan fungera som jonselektiva elektroder (precis som Ag/Granulatfyllda elektrod funktioner som en Cl– elektrod), den verkliga jonkoncentration i unstirred gränsen lager intill kanalen inloppet på cellmembranet ytan kan vara annorlunda än den genomsnittliga koncentrationen av bulk vätska. Denna skillnad i jonkoncentration mellan huvuddelen vätska och unstirred lager anslutning till cellmembranet är det verkliga scenariot under kliniska inställningar och bör skiljas från den biologiska moduleringen av kanal gating av vätska flöde/tvärkraft. Tyvärr, till skillnad från unstirred lagereffekten mellan Ag/Granulatfyllda referenselektrod och bad vätska, vi inte kan fixa unstirred lagereffekten angränsande till cellmembran ytan när studera regleringen av jonkanaler genom vätska flöde/tvärkraft.
Men med tanke på observationen att riktiga jonkoncentration i unstirred lagret är ca 70% av som i bulk vätska (figur 3), kan vi göra vissa ändringar i experimentella data att skilja biologiska moduleringen av jonkanaler från ”unstirred lagereffekt elektrokemiska fenomenet”. Den verkliga jonkoncentration i unstirred lagret på cellmembran ytan förväntades vara ungefär 70% av den genomsnittliga koncentrationen av huvuddelen bad lösning i en senare studie10. Eftersom vätskeflöde återställt den minskade jonkoncentration, underlättade det den nuvarande oberoende av cellulär signalering10Kir2.1. I vår tidigare studie, strömtäthet var betydligt hög (2,5 A / m2) med en hög extracellulära K+ koncentration och hög uttryck för Kir2.1 i RBL celler10. När det gäller riktiga cellmembran med olika ion kanal strömtäthet amplituder, kan unstirred lagereffekten på cellmembran ytan beror dock kraftigt på amplituden av ion kanal strömtäthet. Förutom, detta kan orsaka vissa ion kanal strömmar (särskilt de med relativt lägre strömtäthet) vara okänslig till vätska-flöda förordning. även om unstirred lagereffekten regleras elektrokemiskt och inte biologiskt. Således kan detta påverka den teknik som beskrivs här. Därför undersökte möjligheten att utveckla en kvantitativ metod som är lämplig för korrigering av experimentella resultat bör vara i framtida studier.
I figur 3observerade vi att vätska-metall junction potential mellan Ag/Granulatfyllda referenselektrod och bad vätska var kraftigt beroende av villkora av Ag/Granulatfyllda elektroden. I själva verket när Ag/Granulatfyllda elektroden var perfekt i skick, förändringar i korsningen potentiella på grund av vätskeflöde var minimal (inga data anges). Dock orsakade dålig klorering av Ag/Granulatfyllda elektrod en större förskjutning i korsningen potentiella. Eftersom Ag/Granulatfyllda referenselektroden är mycket mottagliga för olika yttre stimuli, såsom ultraviolett ljus och oxidativ stress, rekommenderas med en agar eller agaros KCl bro alltid. Även om förändringar i korsningen potential av vätska flöda mellan bada vätska och referenselektroden är en potentiell källa till fel, vi uppskattas framgångsrikt de verkliga jonkoncentrationer i unstirred gränsskikt genom att mäta förskjutningen av korsningen potentialen under olika vätska-flöden (figur 3A och 3B).
Den kritiska punkten i steg 4 för att förbereda standardkurvan för uppskattning av äkta Cl– koncentration i de unstirred gränsskikt från övergången av korsningen potential är att standardkurvan bör registreras under ett tillräckligt flöde (30 mL / min i detta experiment). Även om detta flöde är mycket snabb, i praktiska fall snabbare vätskan, ju mindre koncentration drop är på gränsskikt (figur 3). Dessutom måste öppna pipetten fyllas med hög KCl, istället för en vanlig pipett lösning, för att en patch-clamp-studie för att förhindra att förändringen i korsningen potentiella mellan en pipett och bad lösning.
Tvärkraften i inställningen för patch-clamp kan beräknas från följande relation11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (ekvation 2)
Var: τ är Skjuvspänningen (N/cm2). Μ är viskositeten (0,001 N m/s2 för vatten vid 20 ° C). Q är den vätskeflöde hastigheten (m3/s); b är bredden (m); och h är höjden kammare (m). Vätskeflöde är 30 mL/min, uppskattas tvärkraften i patch-kammaren visas i figur 1 till ~0.75 dyn/cm2 enligt ekvationen ovan. Detta är en låg shear kraft nivå jämfört med fysiologiska tvärkraften; endotelcellerna i blodkärlen kan utsättas för skeva styrkor upp till 40 dyn/cm18,19. Därför, under förutsättning att jonkanalerna inte är känsliga för skjuvning styrkor mindre än 0,75 dyn/cm2, kan vi studera vätska flöde/shear kraft känslighet jonkanaler efter exklusive unstirred gränsskikt effekten genom att ange villkoret kontroll till 0,75 dyn/cm2. Men verkar vissa jonkanaler, inklusive Kir2.1, vara känsliga för skjuvning styrkor mindre än 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
Unstirred lagereffekten föreslogs ursprungligen av Barry och kollegor12,13,14,15. Här ger vi en metod för att uppskatta riktiga jonkoncentration i unstirred lagret genom att mäta förändringar i korsningen potential med öppna patch-clamp pipett. Vi föreslår också att denna unstirred gränsskikt effekt kan bidra till vätska flöde-inducerad förordning av ion kanal strömmar och bör beaktas när studera vätska flöde-mekanosensitivitet av jonkanaler. Men kan utifrån denna hypotes, man fråga varför vissa ion kanal strömmar inte är känsliga för flytande flöde-beroende förordning om unstirred gränsskikt effekten är en elektrokemisk i stället för biologisk bekämpning. Som kortfattat behandlas ovan är detta förmodligen eftersom endast ion strömmar genom kanaler med stora tillräckligt enkanalig konduktans och länge tillräckligt öppet-tid kan underlättas genom vätskeflöde. Det vill säga för etableringen av unstirred lagret där jonkoncentration skiljer sig från genomsnittet i bulk lösningen, flux i membran fas bör vara snabb nog jämfört med att i kammarvattnet fas14. Vi har nyligen föreslagit att strömmen genom Kir2.1 kanaler, vars konduktans och öppen tid är tillräckligt hög, underlättas genom vätskeflöde via verkningsmekanismer konvektiv restaurering av jonkoncentration i gränsskikt unstirred cellmembranet yta11.
Avslutningsvis presenterar vi en metod för att mäta jonkoncentration i unstirred gränsskikt intill referens elektrod och cellmembran ytan med en öppen patch-clamp-pipett. Förutom att betona vikten av en agaros KCl bridge, ger metoden också ett sätt att redovisa unstirred lagereffekten medan tolka vätska flöde/shear kraft kontroll av jonkanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av programmet pionjär forskning Center (2011-0027921), av grundläggande vetenskap forskningsprogram (2015R1C1A1A02036887 och NRF-2016R1A2B4014795) genom National Research Foundation Koreas finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT & Framtiden planering, och genom ett bidrag i Korea hälsa teknik R & D projekt genom den Korea hälsa industri utveckling Institute (KHIDI), finansierade av ministeriet för hälsa & välfärd, Sydkorea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
