Summary
機械刺激感受性イオン チャネルは、パッチク ランプ記録を持つ流体の流れ/せん断力感度の面でよく勉強しました。ただし、実験的プロトコルによってイオン チャネルの流体フロー規則に結果は、誤ったことができます。ここでは、防止および理論的根拠とそのようなエラーを修正するためのメソッドを提供します。
Abstract
流体の流れは、流体の流れによる血管拡張など、多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境刺激です。流体の流れ/せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないがイオン チャネルのゲートの流体フロー パミン批判的に貢献するかもしれない。したがって、せん断流力感受性イオン チャネルのパッチ ・ クランプの技術を使用して研究されています。しかし、実験的プロトコルによって結果とデータの解釈することができます誤った。ここで、流体の流れに関連するエラーの実験的・理論的な証拠は提示、見積もり、防止、およびこれらのエラーを修正するためのメソッドを提供します。銀/塩化銀参照電極と入浴液間電位の変化は 3 M KCl。 流れがいっぱい開いているピペットを用いて測定したし、液体/金属接合の約 7 に潜在的な mV をシフトします。逆に、流体の流れによる電圧変化を測定することにより非撹拌の境界層内のイオン濃度を推定しました。静的な状態で細胞膜表面での銀/塩化銀参照電極またはイオン ・ チャネル入口に隣接して実際のイオン濃度は低流動状態での約 30% を達することができます。3 M、アガロースを配置する入浴液と参照電極間の KCl ブリッジ防げた可能性がありますこのジャンクションの潜在的なシフトの問題。ただし、細胞膜表面に隣接する非撹拌レイヤー効果は、この方法で固定ないできませんでした。ここでは、イオン電流の流体流動誘起制御を勉強しながら agarose の塩橋を使用しての重要性を強調してオープン パッチ ・ クランプ ピペットと非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。したがって、非撹拌の境界層中のイオンの実際の濃度を考慮すると、この新規のアプローチ可能性があります実験デザインとデータ解釈イオン チャネルの流体のせん断応力規制に関連有用な洞察力を提供.
Introduction
液体の流れが流体の流れによる血管拡張や流体せん断力依存血管リモデリングと開発1,2など多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境のキュー 3,4,5。流体せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないが、イオン チャネルの開閉の流体の流れを介した制御流体流れによる応答5に批判的に貢献するかもしれないといわれています。,6,7,8しますたとえば、内皮の内側整流器 Kir2.1 と Ca2 +の活性化-活性化 K+ (KCa2.3、KCNN3) チャンネルは流体に貢献する流動による Ca2 +流入が示唆されている後。血管拡張の流動誘起6,7,8。したがって、多くのイオン チャネル、特に機械的に活性化または抑制のチャンネルは、パッチ ・ クランプの技術6,9,10と流体の流れ/せん断力感度の面で研究されています。,11します。 ただし、パッチ ・ クランプ記録中に行った実験的プロトコルによって成果とイオン チャネルの流体フロー規制に関するデータの解釈、誤った10,11。
パッチ ・ クランプ記録における流体流動誘起成果物の 1 つのソースは、浴液と銀/塩化銀参照電極11と潜在的な接合からです。液体/金属接合部入浴液と銀/塩化銀電極の電位は一定である入浴液の Cl-濃度が一定として入浴ソリューション間の化学反応を考慮したを一般的に考えられています。する銀/塩化銀電極:
Ag + Cl-↔ AgCl + 電子 (e-) (式 1)
ただし、入浴ソリューションと銀/塩化銀参照電極 (式 1) の全体的な電気化学的反応が左から右に進行する場合、銀/塩化銀に隣接する入浴液の Cl-濃度を参照します。電極 (非撹拌境界層12,13,14,15) は、十分な対流輸送を確保しない限り、ソリューションを入浴の大部分よりもはるかに低い可能性があります。Ag の不十分な塩素処理と古いまたは非理想的な銀/塩化銀電極を用いるそのようなリスクを高める可能性があります。参照電極、実際には、この流体フロー関連のアーティファクトは、入浴液と参照間の従来の agarose 塩橋を単に置くことによって除くことができる電極、アーティファクトが実際 Cl-の変化に基づいているので濃度は銀/塩化銀電極11に隣接します。本研究で提示されたプロトコルでは、ジャンクションのフロー関連の潜在的な変更を防ぐため、非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法について説明します。
入浴液と銀/塩化銀参照電極の KCl の架け橋、アガロースを配置した後に考慮すべきもう一つの重要な要因がある: Cl-電極のようにちょうど参照として銀/塩化銀電極機能、イオン チャネルにも機能することができますようイオン選択的な電極。入浴液と銀/塩化銀参照電極との間の非撹拌の境界層の状況は、膜イオン チャネルを介して細胞外および細胞内のソリューションのイオンの動きの間に発生します。これは、流体の流れによってチャンネルはイオンの規制を解釈するときに注意を使用することを意味します。電気化学的勾配が存在する溶液中のイオンの動きによって3 つの異なるメカニズムが発生する可能性が私たちの以前の研究11で説明するよう: 拡散、移行、および対流、拡散の動きです濃度勾配による、移行が電気的勾配によって駆動される動きと対流は流体での動き。これらの 3 つのトランスポート メカニズムの中では、対流モードは、イオン11 (> 1,000 回以上拡散または通常のパッチ ・ クランプの設定の下で移行) の動きにほとんどを貢献しています。これはなぜ入浴液と銀/塩化銀参照電極間電位は非常に異なる静的および流体条件11の下ですることができますの理論の基礎を形作る。
上記仮説に従ってイオン チャネル電流の流れのいくつかの手掛かり効果は実質イオン濃度膜表面 (非撹拌境界層) でチャネルの入口に隣接する対流の復元から推論する可能性があります10です。 この場合、イオン チャネル電流の流体流動誘起効果は単にイオン チャネルの開閉の制御からの電気化学的イベントから生じています。同様のアイデアは以前バリーと同僚12,13,14,15に基づいて厳密な理論的考察と実験的証拠、非撹拌層として知られているが示唆されたか数の影響を運ぶ。単一チャネルのコンダクタンスと十分な輸送料金 (非撹拌膜表面でよりも膜の高速輸送率)、チャネルを通じて境界層効果を提供するために十分な長さのオープン時間が生じることがありますいくつかのイオン チャネルがある十分な場合.対流に依存したトランスポートはイオン現在10,12,13,14,15の最終的な流体流動誘起昔話に貢献することができます。
本研究で我々 は寒天やアガロースを使用しての重要性を強調するイオン電流の流体流動誘起規制を勉強しながら塩橋。我々 はまた銀/塩化銀参照電極と膜イオン チャネルに隣接する非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。さらに、イオン チャネル電流 (すなわち、対流仮説または非撹拌層トランスポート数の影響) の流体流動誘起変調の理論的解釈は、設計との研究の解釈のための貴重な洞察力を提供できます。イオン チャネルのせん断の力規制。非撹拌境界層トランスポート数効果によると場合膜イオン チャネルのすべての種類を介してイオン チャネル電流が流体、流体せん断力にだけ、彼らの生物学的感性の独立によって促進されることができることを予測します。イオン チャネルがある十分な単一チャネルのコンダクタンスと長いオープン タイム。高いイオン チャネル電流密度は、細胞膜表面の境界層の非撹拌効果を高める可能性があります。
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Protocol
建国大学制度のガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. Agarose 塩橋バス ソリューションと銀/塩化銀参照電極との間
注: Agarose 3 M KCl 塩橋が以前に生成される説明12マイナーなバリエーションを持つ。
- 橋の形成
- 適切な U 字型を形成する火ガラス毛管管を曲げます。毛細血管の内径は、大型イオン電流を記録するときに直列抵抗を減らすために十分な大きさにする必要があります。2-5 mm の内径の管が通常は許容です。
- アガロース 3 M KCl 溶液の調製
- 3 M KCl 溶液 100 mL を準備 (1 M または 2 M、許容)。
- 寒天 3 g の重量を量る。
- 90 ~ 100 ° C のホット プレートに KCl (すなわち3% の agarose) の 100 mL のアガロースを解散します。
- 3 M の KCl の agarose が付いて橋の読み込み
- 容易なロード agarose KCl 溶液中 U 字型ガラス橋を浸します。
注: agarose KCl ソリューションが浅いと広範なコンテナーに含まれる場合、ガラスの橋を掘る簡単です。 - 室温を設定し、強化する agarose (RT) で一晩おきます。
- セット/硬化 agarose 塩からガラスの agarose KCl ロード橋を慎重に掘る。
- 容易なロード agarose KCl 溶液中 U 字型ガラス橋を浸します。
- 橋を保存します。
- 十分なボリュームを準備 (すなわち、 500 mL) 首の全体のボトルの 3 M KCl 溶液。
- 冷蔵庫にボトルに準備されたアガロース塩橋を格納します。
2. 流体せん断力のパッチ用のチャンバーで電池への応用
注: パッチ ・ クランプの実験の設定の概略図は、図 1に示すです。
- コンテナーが入浴ソリューション搭載場所 (ボリュームと高さには測定する必要があります既に) 上記のパッチ ・ クランプの商工会議所。
- パッチ ・ クランプをチャンバーに入浴ソリューションとチューブを吸引によって。
- 流体の流れを停止するには、流体の流れをブロックするコンテナーの側にチューブをクリップし、同時に吸引を停止する吸込側にチューブをクリップします。これは、「定常」コントロールの条件です。
- 流体せん断力を適用するには、同時にコンテナーと吸引側両方のチューブを開きます。
- 前に、または流体せん断力をセルに適用した後、mL/分の流量を測定します。
- 与えられた時間をかけて体液量の減少を測定することにより流量を算出します。
- 測定流量から入浴室のジオメトリ (構造)、(議論のセクションを参照してください) 流体の流れによってセルに適用するせん断力を見積もる必要があります。
- また、(手順 2.3 2.6) の流量を制御するためには、灌流ポンプを使用します。この場合、拍動流ではなく、定数を確保するように注意します。
3. バス ソリューションと銀/塩化銀参照電極 (図 3 a) 流動による液体金属接合部電位の変化を測定
- 銀/塩化銀電極または agarose の塩橋なし、既製の製品から利用可能なペレットを使用します。
- 生理的塩食塩を入浴室 (例えば、143 mM の NaCl、KCl、5.4 mM 0.33 mM NaH2PO4、5 mM HEPES、0.5 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、11 mM D-グルコース; NaOH で 7.4 に調整 pH) に備えます。
- パッチ ピペット ピペットと入浴ソリューションとのジャンクションの潜在的なシフトを最小限に抑えるためチャンバー内 3 M KCl 溶液を配置します。
- 現在のクランプにクランプ電圧増幅器を修正 (「私 = 0"または"CC")。
- 初期オフセット電位をヌル後様々 な流量による電圧の変化を測定します。
- 電圧の変化が液体/金属接合電位であることを確認、再流動のバス ソリューションと銀/塩化銀電極間 agarose 塩ブリッジを使用して接合部電位に及ぼす影響を調べる。
4. 銀/塩化銀電極 (図 3 b) 静的な条件の下に隣接する非撹拌層で実際 Cl-濃度の検討
- ステップ 3 の結果から接合の可能性 - 流量関係を描画して、ジャンクション スープラ流体流量による潜在的なシフトの (飽和) 最大値を推定します。
- Cl の様々 な濃度のソリューションを準備(すなわち、 50、99、147、195、NaCl の 288 mM)。
- Cl-入浴液中濃度を変更することによって接合の可能性-[Cl-] 関係を描きます。流体の速度定数と十分に高いする必要があることに注意してください (> 30 mL/分) 隣接する銀/塩化銀参照電極の Cl-濃度の低下を防ぐために。
- 2 つの関係曲線から測定されたジャンクションの潜在的なシフトから Cl-濃度の変化を推定します。
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Representative Results
全セル電圧依存性 L 型 Ca2 +チャネル (VDCCL) 電流、酵素によって分散したラット腸間膜動脈平滑筋細胞、前述11として記録されました。動脈平滑筋細胞されたナイスタチン穿孔の構成で Cs の豊富なピペット液 VDCCL11,16によって電流の流れを容易にする二価陽イオン無料入浴の透析。脱分極電圧ランプまたは-70 の持株電位の電圧ステップを簡単な mV、VDCCL電流を引き出すために適用されました。代表的な電流-電圧 (私V) VDCCL不在そして、アガロース KCl 橋と記録 (5 mL/分または約 0.004 m/s)、流体の流れの存在の関係は図 2 aに示すように。流体の流れわずか電圧に依存しない方法で現在 VDCCLに増加しました。現在 VDCCLの流体の流れのこの促進効果は図 2 bのとおりです。
VDCCL流動による現在の電圧に依存しない促進液またはせん断力 VDCCLの適切な応答であります。5 mL/分または約 0.004 m/s 現在の実験のセットアップ内の流動は、せん断力の面で約 0.1 dyn/cm2を表すと推定された (ディスカッションを参照してください)。ただし、銀/塩化銀参照電極に直結、アガロース KCl 橋、流動、静的 VDCCL電流に比べて右にシフトの存在下で、私V 関係なく入浴液(図 2および2 D) の条件。これは VDCCL負電圧電流の抑制と VDCCLより脱分極または正電位で現在の円滑化で起因しました。これを例証するパッチ ・ クランプ記録私V 関係の電圧シフトがチャネルの開閉の変更によるありませんでしたが入浴液と銀/塩化銀間接合の潜在的なシフトのため実際にだった流体流動誘起アーティファクト電極11を参照します。流体流れによる接合の潜在的なシフトのための直接証拠は図 3に示します。
ジャンクションの潜在的なシフトは、手順 3 に従って測定しました。流体の流れのための変更は、満ちている 3 M の KCl、前述11として開いているピペットを使用して測定しました。3 M の KCl でいっぱい開いているピペット、ピペットとソリューションを入浴の間潜在的なジャンクションを最小化できると入浴ソリューションや銀/塩化銀参照電極から主に流体の流れのための潜在的な変更があった。3 M の KCl、アガロースなし入浴液と銀/塩化銀参照電極間橋、流体の流れが流動速度依存方法 (図 3 a) で流体と銀/塩化銀電極の接合部電位をシフトします。最大接合部電位変化は 〜 7 に外挿する mV 接合潜在的な流動の関係 (図 3 a下) から。対照的に、とき agarose 3 M の KCl のブリッジを用いて、流体の流れには影響しなかった入浴液及び参照電極間電位の接合 (図 3 aの下のグラフにまとめて、下)。
濃度が十分な対流でアクションのモード、機能、静的および流体の流れの条件の違いを測定するために入浴液銀/塩化銀電極の Cl-濃度の変更による効果を検討しました。接合手順 4 によると潜在的です。濃度依存的に潜在的な接合部をシフト Cl-濃度を増加させる (図 3 bトップ) 流動シフト率依存的に潜在的なジャンクションと同様。KCl agarose ブリッジを使用して、接合の可能性が阻止された cl-バス ソリューションと参照電極間接合の潜在的な変更が発生したことを示す濃度依存的 (図 3) を変更します。間ではなくお風呂とピペットのソリューション。接合の可能性-[Cl-】 関係の片対数プロットは図 3 bの下のパネルに表示されます。図 3 b、~ 7 接合 (図 3 a) からの潜在的なシフトの mV ~ 70% 銀/塩化銀参照電極に隣接する-の Cl 濃度を減少させることを示唆しているの推定最大値の結果によると、流体の流れがない場合は、液を入浴一括 (図 3 b下) の平均濃度は。
以前の研究では、Kir2.1 電流が対流 (増加) [K+] チャネルの入口10時を復元することによって流体の流れによって促進されると報告されました。このアイデアは、Kir2.1 チャネルは、- Cl 電極として銀/塩化銀電極の関数としてちょうど K+電極として機能できるよう入浴液と銀/塩化銀電極との間に起こる現象から生じています。このアイデア模式図 4 aおよび4 bに示します。Kir2.1 電流の流体流動誘起円滑化の代表例を図 4に示します。Kir2.1 電流が-100 0 の開催可能性から過分極電圧ステップによって誘発されるラット好塩基性白血病 (RBL) 細胞の mV。流れ (5 mL/分または 0.004 m/s) のアプリケーションには、Kir2.1 電流 (図 4) 容易に増加しました。以前、細胞内シグナル伝達ではなく、対流境界層の非撹拌10K+イオン輸送の電気化学的効果によって仲介されるため流動による促進が示唆されました。
図 1: スケマティック パッチ ・ クランプ記録におけるイオン チャネルの流体制御の入浴室のセットアップを表示します。下のパネルは、パッチク ランプ-箱の側面 (矢状断面) です。それは、流体の流れのパスと研究セル、電極、および流体の入口/出口の場所をまとめたものです。流体が継続的にポンプでくまれる出口の管を通って吸引によってのでチャンバー内の液体の高さは比較的一定レベルで維持されます。この図は、以前の文書11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: L 型電位依存性 Ca2 +チャネル (VDCCL) 電流 agarose 3 M とに及ぼす流体流れ KCl 橋。VDCCLの電流が酵素によって分散したラット腸間膜動脈筋細胞ナイスタチン穿孔パッチ ・ クランプ記録で記録されました。4.2 mM EDTA の二価陽イオンなしで通常 tyrode 生理的食塩水は入浴ソリューション11として使用されました。ピペット ソリューションに CsCl、140 mM が含まれています。MgCl2、1 mM;HEPES、5 mM;グリコールエーテルジアミン四酢酸 0.05 mMCsOH と 7.2 に pH を調整します。(A と B)3 M の agarose が付いて KCl 橋。(A) 代表の私V 関係 VDCCL現在と流体の流れの影響のため。(B) VDCCL電流、私V 関係に関する流体効果の概要。(C と D)3 M の KCl の agarose のない橋します。(C)私V の関係 VDCCL電流。(D) 電流 VDCCLの私-V の関係をまとめた不在と流体の流れの存在です。VDCCL電流を引き出すための電圧ステップの図形は、図の挿入で表示されます。この図は、以前の文書11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 入浴液と銀/塩化銀の潜在的な液体金属接合に及ぼす流動参照電極と参照電極に測定のジャンクションから隣接する非撹拌層で実際の Cl-濃度の推定可能性があります。流体 (上部パネル) の様々 なレートの変動により接合部電位変化の (、) A の代表的なトレース。この図は、以前の文書11から変更されています。ジャンクションの潜在的な流動率の関係 (n = 5)。(食塩の濃度による接合部電位変化の B) 上部パネル: 代表記録。下部のパネル: 接合の可能性-[Cl-】 関係の片対数プロット (n = 5)。赤で直線を表す 49 の 10 分の 1 の勾配で潜在的な平衡の変更されたネルンストの同等化によって最適 mV。49 の勾配値 Na+、潜在的な液体/金属接合を生成するために比べて Cl-の有限性に負う 58 ではなく mV mV 制作ルームで接合の可能性-[Cl-] 関係でベスト フィット温度。49 mV 斜面かを示します、Cl-依存性 (選択性) (この場合は Na+) で他のイオン銀/塩化銀参照電極 > 95%、ゴールドマン ホジキン カッツ電圧方程式によると。7 のシフト 150 mM の-の Cl 濃度で mV Cl-濃度の 30% の減少を示します。(C) 3 M KCl agarose のブリッジの使用で食塩の濃度で接合部電位の代表的なトレース (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: イオン現在フラックス中に開いているチャネルに隣接するイオン濃度におよぼす流体の対流モデルのスケマティック。(A) 電界と水溶液中のイオンの小さな対流輸送と静的条件下で K+イオン フラックス K+を-選択的なイオン チャネルに隣接して創製の K+濃度の低下を引き起こす、チャネルの入口。(B) 流動対流開水路入口に隣接する K+濃度の低下を復元できます。(C) 内側整流器 Kir2.1 チャネル電流に及ぼす流動の影響。流体の流れは即座に Kir2.1 の電流を増加しました。電圧ステップの形状は、図の挿入で表示されます。Kir2.1 電流は高 K+を使用して記録された-入浴・ ピペットのソリューション。ソリューションを入浴: 148.4 mM KCl、0.33 mM NaH2PO4、5 mM HEPES、0.5 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、11 mM; D-グルコースpH を NaOH で 7.4 に調整。ピペットのソリューション: 135 mM KCl、5 mM の NaCl、5 mM 10 mM HEPES、Mg ATP 5 mM エチレング リコール-ビス (2-アミノエチル)-N, N, N', N'、-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) pH 7.2 (島の調整)。以来、RBL-2 H 3 セルがハイポ浸透腫れに非常に敏感、ボリューム アクティブ Cl-電流、38 mM ショ糖の結果としてトリガーは浸透圧の調整、細胞の膨化を防ぐ入浴ソリューションに追加されました。また、Cl-チャネル ブロッカー [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic 酸 (DID、30 μ M)] は、Cl-電流によって任意の汚染を除去するためにピペット ソリューションに追加されました。パネル C は、以前出版10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で行った高 KCl でいっぱいオープン パッチ ・ クランプ ピペットと液体金属の接合部の電位を決定することにより銀/塩化銀参照電極に隣接する非撹拌層で実際の Cl-濃度を測定する方法濃度。静的から流体条件に切り替えるとき、境界層における Cl-濃度の変化は接合部電位のシフトにつながります。単に参照電極と入浴液の KCl の架け橋、agarose を使用してはパッチ ・ クランプ記録中に Cl-濃度に関連するエラーまたは成果物を防ぐことができます。
寒天やアガロース塩橋の重要性を強調して、他非撹拌の境界層における実際のイオン濃度でこのメソッドの別のアプリケーションは次のとおりです。原形質膜のイオン チャネルが非撹拌の境界で本物のイオン濃度 (ちょうどとして銀/塩化銀電極機能 Cl-電極のような)、イオン選択性電極として機能することができるため層細胞膜チャネルの入口に隣接します。表面は、バルク液体の平均濃度から異なることがあります。この違い、バルクのイオン濃度の流体と非撹拌層細胞膜に隣接する臨床設定の下で実際のシナリオし、流体の流れ/せん断力によってチャネルの開閉の生体の変調を区別する必要があります。残念ながら、銀/塩化銀参照電極と入浴流体と非撹拌レイヤー効果とは異なり我々 は、ことはできません修正非撹拌層効果を細胞膜表面に隣接して流体フロー/せん断力によってイオン チャネルの規制を勉強しています。
ただし、非撹拌層で実際のイオン濃度がバルク流体 (図 3) での約 70% であること観察を考慮したいくつかの修正に作るイオン チャネルの生体の変調を区別するために実験データ「非撹拌層効果の電気化学的現象」から。細胞膜表面における非撹拌層で実際のイオン濃度は、最近の研究10でソリューションを入浴一括の平均濃度約 70% 期待されていた。流体の流れに減らされたイオン濃度が復元されるため、細胞シグナリング10とは関係なく現在の Kir2.1 が促進されます。私たちの以前の研究では、電流密度はかなり高かった (2.5 A/m2)10を細胞濃度と RBL で Kir2.1 の高発現が高い細胞外 k+ 。しかし、様々 なイオン チャネル電流密度振幅と実質細胞膜の場合細胞膜表面における非撹拌層効果可能性がありますに大きく依存イオン チャネル電流の振幅。その上、これ引き起こす可能性がありますいくつかのイオン チャネル電流 (比較的低電流密度との特にそれら) 流体規制を重視するただし、非撹拌レイヤー効果は、電気化学的、ない生物的に規制されています。したがって、ここで説明する手法があります。したがって、実験結果を修正する必要がありますには適切な定量分析法の開発の可能性は今後の研究調査。
図 3銀/塩化銀参照電極と入浴流体と液体金属の接合可能性は銀/塩化銀電極の状態に大きく依存して見られました。実際、銀/塩化銀電極の状態で完璧な頃、流体の流れによる電位の変化は最小限の (データは表示されません)。ただし、銀/塩化銀電極の貧しい塩素化反応は、潜在的なジャンクションに大きいシフトを引き起こしました。銀/塩化銀参照電極は紫外光、酸化ストレスなどの様々 な外部刺激に非常に敏感ですので、寒天やアガロース KCl ブリッジを使用してはお勧め常に。エラーの潜在的な源である入浴液と参照電極間を流れる流体による接合部電位の変化が、ジャンクションのシフトを測定することによって正常に非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を推定しました。様々 な流体フロー レート (図 3 aと3 b) の下で可能性があります。
接合部電位のシフトから非撹拌の境界層における実際の Cl-濃度の推定は十分な流量の下標準曲線を記録することに標準曲線を準備するためのステップ 4 の臨界点 (30 mL/この実験では分)。この流量は、非常に高速ですが、実用的な場合より高速で、流体が小さい濃度減少は境界層 (図 3) で。さらに、開いているピペット ピペットとソリューションを入浴の間電位の変化を防ぐためにパッチ ・ クランプの研究のための順序で、通常のピペット ソリューションではなく、高の KCl と記入します。
パッチ ・ クランプの設定でせん断力を次の関係11から推定できます。
Τ = (6μQ)/(bh2) (式 2)
場所: τは、せん断応力 (N/cm2);Μは粘度 (0.001 N m/s2の 20 ° C で水);Qは流体の流量 (m3/s);bは、室内幅 (m);h商工会議所の高さ (m)。液流量が 30 mL/分と、図 1に示す修正プログラム室でせん断力は上記の式に従って ~0.75 ディン/cm2と推定されます。これは生理学的なせん断力; と比較して低剪断力レベルです。血管内皮細胞は、最大 40 dyn/cm18,19の力をせん断する受けることができます。したがって、イオン チャネルは、せん断力未満 0.75 dyn/cm2に敏感は、されるコントロールの条件を設定することによって境界層の非撹拌効果を除外したイオン チャネルの流体フロー/せん断力感度の私たちに勉強できます。0.75 dyn/cm2。しかし、Kir2.1 を含む、いくつかのイオン チャンネルは、せん断力未満 0.75 dyn/cm2,3,4,5,6に敏感になるようです。
もともと、バリーと同僚12,13,14,15非撹拌層効果が示唆されました。ここで、オープン パッチ ・ クランプのピペットで接合部電位の変化を測定することによって非撹拌層で実際のイオン濃度を推定する方法を提供します。私達の提案にはこの非撹拌境界層効果がイオン チャネル電流の流体流動誘起制御に貢献するかもしれないし、流体の流れ-依存イオン チャネルを勉強しながら考慮する必要があります。しかし、この仮説に基づいて、それがありますいくつかのイオン チャネル電流が生物的防除ではなく、流体の流量依存制御非撹拌境界層効果が、電気の場合に敏感な理由。として簡潔に上記アドレス、これはおそらく大規模なイオン電流のみのチャンネルは、十分な単一チャネルのコンダクタンスと長い十分なオープン時間することができます流体の流れによって促進されるため。つまり、イオン濃度は一括解決策のなかから異なる非撹拌層の確立のためフラックス膜段階で十分高速とを比較することで水性相14。我々 は最近、Kir2.1 を通じて、コンダクタンスとオープン時間が十分に高いが、電流はイオン濃度の非撹拌の境界層内の対流の修復のメカニズムを介して流体の流れによって促進されることを示唆しています。細胞膜表面11。
結論としては、オープン パッチ ・ クランプ ピペットと参照電極と細胞膜表面に隣接する非撹拌の境界層内のイオン濃度を測定する方法を提案する.ほか、アガロース KCl 橋の重要性を強調し、このメソッドは、イオン チャネルの流体フロー/せん断力制御を解釈しながら非撹拌層効果を考慮する方法を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、研究財団韓国国立科学省 ICT によって資金を供給を通じて基本的な科学研究プログラム (2015R1C1A1A02036887、NRF 2016R1A2B4014795) パイオニア研究センター プログラム (2011 0027921)、によって支えられて・将来計画、韓国健康技術 R & D プロジェクト韓国健康産業開発研究所 (KHIDI) からの助成金によって韓国共和国 (HI15C1540) 福祉厚生省によって資金を供給し、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
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