Summary
Mechanosensitive ionekanaler er ofte studerte i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme opptak. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultatet på flytende flyt-regler ion kanaler være feilaktige. Her gir vi metoder for å forebygge og korrigere slike feil med en teoretisk basis.
Abstract
Væskestrøm er en viktig miljømessige stimulans som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser, som flytende flyt-indusert vasodilatasjon. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar til flytende flyt/skjær styrke ikke er fullt ut forstått, bidra flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk. Derfor, flytende flyt/skjær force sensitivitet ion kanaler har blitt studert ved hjelp av patch-klemme teknikk. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultater og tolkning av data være feilaktige. Her presenterer vi eksperimentelle og teoretiske bevis for flytende flyt-relaterte feil og tilby metoder for beregning, forebygge og korrigere feilene. Endringer i krysset potensielle mellom Ag/AgCl referanse elektrode og bading væske ble målt med et åpent pipette fylt med 3 M KCl. strømning kan deretter flytte væske/metal krysset potensielle til ca 7 mV. Omvendt, ved å måle spenning skiftet indusert av strømning, beregnet vi konsentrasjonen i unstirred grensen laget. Statisk tilstanden, kan de virkelige ion konsentrasjonene tilstøtende i Ag/AgCl referanse elektrode eller ion kanal innløpet på cellemembranen overflaten nå så lav som ca 30% av strømmen til tilstanden. Plassere en agarose 3 M kan KCl bro mellom bading væske og referanse elektroden ha forhindret dette problemet med junction potensielle skiftende. Men kan unstirred lageffekten ved siden av cellemembranen overflaten ikke løses på denne måten. Her gir vi en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget med en åpen patch-klemme pipette, understreker viktigheten av å bruke en agarose salt-bro mens han studerte flytende flyt-indusert regulering av ion strøm. Derfor kan denne romanen tilnærming, som tar hensyn til de virkelige konsentrasjonene av ioner i den unstirred grenselag, gi nyttig innsikt på eksperimentell design og data tolkning relatert til flytende skjæring stress regulering av ionekanaler .
Introduction
Væskestrøm er en viktig miljømessige kø som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser som flytende flyt-indusert vasodilatasjon og flytende skjær kraft-avhengige vaskulære remodeling og utvikling1,2, 3,4,5. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar strømning skjær kraft ikke er fullt ut forstått, antas det at flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk kan bidra til flytende flyt-indusert svar5 , 6 , 7 , 8. For eksempel aktivering av endothelial innover likeretter Kir2.1 og Ca2 +-aktivert K+ (KCa2,3, KCNN3) kanaler etter Ca2 + tilstrømningen av væskestrøm har blitt foreslått for å bidra til væske flyt-indusert vasodilatasjon6,7,8. Derfor mange ionekanaler, særlig mekanisk aktivert eller -hemmet kanaler, har vært undersøkt i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme teknikk6,9,10 , 11. avhengig av eksperimentelle protokollen under oppdateringen-klemme opptak, resultater og tolkning av dataene på flytende flyt-regler ion kanaler kan imidlertid være feilaktige10,11.
En kilde til flytende flyt-indusert gjenstander i patch-klemme innspillingen er fra krysset potensielle mellom bad væske og Ag/AgCl referanse elektrode11. Det er generelt antatt at væske/metal krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl elektrode er konstant som Cl- konsentrasjonen av bading væsken holdes konstant, vurderer den kjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl elektrode skal:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (Formel 1)
Men i tilfeller der samlet elektrokjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode (Formel 1) fortsetter fra venstre til høyre Cl- konsentrasjonen av bading væsken tilstøtende Ag/AgCl referanse elektroden (unstirred grenselag12,13,14,15) kan være mye lavere enn i hoveddelen av bading løsning, med mindre nok convectional transport er sikret. Bruker en gammel eller ikke-ideelle Ag/AgCl elektrode med utilstrekkelig klorering AG kan øke slik risiko. Denne flytende flyt-relaterte gjenstand på referanse elektrode, faktisk kan ekskluderes ved å plassere en vanlig agarose-salt bro mellom bading væske og referanse elektrode, siden gjenstand er basert på endringer i ekte Cl- konsentrasjon tilstøtende Ag/AgCl elektrode11. Protokollen presentert i denne studien beskriver hvordan forebygge flyt-relaterte krysset mulige endringer og måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget.
Etter å ha en agarose KCl bro mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode, det er en annen viktig faktor som bør vurderes: bare som referanse Ag/AgCl elektrode fungerer som en Cl- -elektrode, ion kanalene kan også fungere som en ion-selektiv elektrode. Situasjonen for en unstirred grenselag mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode oppstår under flytting av ioner mellom den ekstracellulære og intracellulær løsninger gjennom membranen ionekanaler. Dette innebærer at forsiktighet bør brukes når tolke regulering av ion kanaler av væskestrøm. Som nevnt i vår forrige studie11, bevegelsen av ioner gjennom en løsning der en elektrokjemisk gradering er til stede kan oppstå via tre forskjellige mekanismer: diffusjon, overføring og konveksjon, hvor spredningen er bevegelsen indusert av konsentrasjon gradient, overføringen er bevegelsen drevet av elektrisk gradering og konveksjon er bevegelsen gjennom væske-flow. Blant disse tre transportmekanismer bidrar konveksjon modus mest til bevegelsen av ioner11 (> 1000 ganger større enn spredning eller migrering under vanlige patch-klemme innstillinger). Dette danner teoretiske grunnlaget for krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode kan veldig under ulike statisk og væske-flow forhold11.
Som hypotesen foreslått ovenfor noen facilitatory effekter av væskestrøm på ion kanalen gjeldende kan utledes fra konvektive restaurering av ekte ion konsentrasjoner ved kanalen innløp på membran overflaten (unstirred grenselag) 10. I dette tilfellet, flytende flyt-indusert virkningene på ion kanal strømmer har bare oppstått fra elektrokjemiske hendelser, ikke fra regulering av ion kanal gating. En lignende idé ble tidligere foreslått av Barry og kolleger12,13,14,15 basert på strenge teoretiske og eksperimentelle bevis, også kjent som unstirred laget eller transport nummer effekt. Hvis noen ionekanaler har tilstrekkelig kan enkeltkanals konduktans og lenge nok åpne-tid å skaffe tilstrekkelig transport priser gjennom kanaler (transport raskere i membranen enn i unstirred membran overflaten), en grenselag effekt oppstå . Dermed kan konveksjon-avhengige transport bidra til de endelige væske-flyt-indusert facilitations ion gjeldende10,12,13,14,15.
I denne studien vi understreke viktigheten av bruker en agar agarose salt-broen mens han studerte væske-flyt-indusert regulering av ion strøm. Vi tilbyr også en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget ved Ag/AgCl referanse elektrode og membran ion kanalene. Videre kan teoretisk tolkningen av flytende flyt-indusert modulering av ion kanal strøm (dvs. konveksjon hypotesen eller unstirred transport nummer effekt) gi verdifull innsikt for utforming og tolke studier på Skjær kraft-regulering av ionekanaler. Ifølge unstirred grenselag transport nummer effekten forutsi vi at ion kanal strømmer gjennom alle typer membran ionekanaler kan ordnes av strømning, uavhengig av deres biologiske følsomhet strømning skjær force, men bare hvis ion kanalene har tilstrekkelig enkeltkanals konduktans og åpen-lenge. Høyere ion kanal gjeldende tettheter kan øke unstirred grenselag effekten på cellemembranen overflaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til institusjonelle veiledning Konkuk University.
1. Agarose Salt broer mellom bad løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode
Merk: Agarose 3M KCl salt broer produseres som tidligere beskrevet12 med mindre variasjoner.
- Dannelsen av broer
- Bøy brann glass kapillær rør for å danne en U-form etter behov. Den indre diameteren på kapillærene bør være store nok for å redusere serien motstand når store ion strøm. Rør med en diameter på 2-5 mm er vanligvis akseptable.
- Utarbeidelse av agarose 3 M KCl løsning
- Forberede 100 mL 3 M KCl løsning (1 M eller 2 M er også akseptabelt).
- Veie 3 g av agarose.
- Oppløse agarose i 100 mL KCl (dvs. 3% agarose) på en stekeplate mellom 90 og 100 ° C.
- Lasting broer med 3 M KCl agarose
- For lett lasting, fordype U-formet glass broene i agarose-KCl-løsningen.
Merk: Det er lett å grave ut glass broer hvis agarose-KCl løsningen er inneholdt i en grunne og bred beholder. - Holde dem over natten i romtemperatur (RT) for agarose og stivne.
- Nøye grave ut agarose-KCl-lastet glass broene fra sett/herdet agarose-salt.
- For lett lasting, fordype U-formet glass broene i agarose-KCl-løsningen.
- Lagre broene
- Forberede nok volum (dvs. 500 mL) av 3 M KCl løsningen i en wide-necked flaske.
- Lagre forberedt agarose-salt broene i flasken i kjøleskap.
2. Bruk av væskestrøm skjær kraft til celler i en Patch-klemanordning kammer
Merk: En skjematisk diagram av oppdateringen-klemme eksperimentelle set-up er vist i figur 1.
- Stedet en beholder lastet med bading løsning (volum og høyde bør allerede være målt) over patch-klemme kammeret.
- Fyll patch-klemme kammeret med bading løsningen av suctioning røret.
- For å stoppe strømning, klipp røret på beholderens side å blokkere flytende flyt, og deretter klippet røret på sugesiden stoppe inntaks samtidig. Dette er "stillestående" kontroll tilstanden.
- Du kan bruke strømning skjæring kraft ved åpne begge rør på beholderen og sug sidene samtidig.
- Før eller etter søknad strømning skjær styrken til cellen, måle infusjonshastigheten i mL/min.
- Beregne infusjonshastigheten ved måling reduksjon i væske volum over gangen.
- Fra målt strømningshastighet og geometri (struktur) av bading kammer, bør skjær kraften til cellen som strømning anslått (se drøftingen).
- Også bestemme flow rate (for trinn 2.3-2.6), bruke en perfusjonsmåling pumpe. I dette tilfellet bli forsiktig å sikre konstant i stedet for en pulsatile flyt.
3. måle endringer i flytende-metallisk Junction potensialet av væskestrøm mellom bad løsning og Ag/AgCl referanse elektrode (figur 3A)
- Bruk Ag/AgCl elektrode eller pellets, som er tilgjengelig fra de ferdige produktene, uten agarose salt broen.
- Forberede en normale fysiologiske salt saline bading kammeret (f.eks143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukose, pH justert 7,4 med NaOH).
- Plass en patch pipette inneholder en 3 M KCl løsning i kammeret å minimere krysset potensielle skiftet mellom pipette og bading løsninger.
- Fastsette spenning-klemme forsterkeren til gjeldende klemme modus ("jeg = 0" eller "CC").
- Etter oppheve første offset potensial, måle endringer i spenning forårsaket av ulike strømningshastigheter.
- Kontroller at endringene i spenning er væske/metal krysset potensialene, revurdere effekten av væskestrøm på krysset potensialet ved hjelp av agarose-salt broen mellom bad løsningen og Ag/AgCl elektroden.
4. eksperimentelle estimering av ekte Cl- konsentrasjon i Unstirred laget ved Ag/AgCl elektrode Under statisk tilstand (figur 3B)
- Fra resultatene av trinn 3, tegne krysset potensial-flyt relasjoner og beregne maksimal (mette) verdien av krysset potensielle Skift av supra-fluid flow rate.
- Utarbeide løsninger med ulike konsentrasjoner av Cl (dvs. 50, 99, 147, 195 og 288 mM NaCl).
- Ved å endre Cl- konsentrasjon i bading væsken, tegne krysset potensielle-[Cl-] forholdet. Merk at væske prisen skal være konstant og tilstrekkelig høy (> 30 mL / min) å forhindre reduksjon av Cl- konsentrasjon som tilstøtende Ag/AgCl referanse elektroden.
- Fra to forhold kurvene, anslå endringer i Cl- konsentrasjon med målte krysset potensielle SKIFT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele cellen spenning-avhengige L-type Ca2 + kanal (VDCCL) strøm ble innspilt i enzymatisk spredt rotte hvem arteriell myocytter, som beskrevet tidligere11. De arteriell myocytter var dialyzed med en Cs-rik pipette løsning under konfigurasjonen nystatin-perforert divalent kasjon-fri bading løsning å forenkle gjeldende flyt gjennom VDCCL11,16. Kort depolarizing spenning ramper eller spenning trinn, på et holdingselskap potensial på-70 mV, ble brukt til å lokke fram VDCCL strøm. En representant nåværende-spenning (jeg-V) forhold i VDCCL i fravær og tilstedeværelsen av væskestrøm (5 mL/min eller ca 0.004 m/s), med en agarose KCl bro, er vist i figur 2A. Strømning økt litt VDCCL gjeldende i en spenning-uavhengig måte. Denne rette effekten av væskestrøm på VDCCL gjeldende summeres i figur 2B.
Spenning-uavhengig tilrettelegging av VDCCL gjeldende av væskestrøm er et skikkelig svar av VDCCL til flytende eller skjær force. 5 mL/min eller ca 0.004 m/s av Bente Blom i gjeldende eksperimentelle oppsett ble anslått for å representere ca 0,1 dyn/cm2 i form av skjæring kraft (se diskusjon). Men når Ag/AgCl referanse var elektrode direkte knyttet til bading væske uten en agarose KCl bro, jeg-V forholdet i nærvær av væskestrøm skiftet til høyre sammenlignet med VDCCL strøm under en statisk tilstand (figur 2C og 2D). Dette resulterte i Hemming av VDCCL gjeldende på negative spenninger og tilrettelegging av VDCCL gjeldende ved flere depolarized eller positiv potensialer. Dette eksemplifiserer flytende flyt-indusert gjenstand patch-klemme innspillingen som en spenning forskyvning av jeg-V forholdet var ikke på grunn av endring av kanal gating men faktisk skyldes et veikryss potensielle skifte mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode11. Direkte bevis for flytende flyt-indusert krysset potensielle forskyvningen er vist i Figur 3.
Krysset potensielle Skift ble målt etter trinn 3. Endringene på grunn av strømning, ble målt ved hjelp av en åpen pipette fylt med 3 M KCl, som beskrevet tidligere11. En åpen pipette fylt med 3 M KCl, krysset potensielle mellom pipette og bading løsninger kan minimeres og potensielle endringene på grunn av væskestrøm var hovedsakelig fra bading løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode. Uten en agarose 3 M KCl bro mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode, strømning skiftet krysset potensielle mellom væsken og Ag/AgCl elektroden på en strømning rate-avhengige måte (figur 3A). Maksimal krysset potensielle endringen var ekstrapolert skal ~ 7 mV fra krysset potensial-fluid flyt forholdet (figur 3A, bunnen). I kontrast, når agarose 3 M KCl broen ble brukt, strømning ikke endre krysset potensielle mellom bading væske og referanse elektroden (oppsummert i bunnen grafen til figur 3A, bunn).
For å måle konsentrasjon forskjeller mellom den statiske og væske strømningsforhold, som nok konveksjon moduser handling er funksjonelle, undersøkte vi effekten av skiftende Cl- konsentrasjoner på bading væske-Ag/AgCl elektroden krysset potensielle etter trinn 4. Øker konsentrasjonen Cl- flyttet krysset i en konsentrasjon-avhengige måte (figur 3B, topp) bare som strømning krysset i en rate-avhengige måte. Bruker en KCl agarose bro, var krysset potensialet hindret fra å endre i en Cl- konsentrasjon-avhengige måte (Figur 3 c), som indikerer at krysset potensielle endringen skjedde mellom bad løsning og referanse elektrode, ikke mellom bad og pipette løsningene. Semi logger handlingen av krysset potensial-[Cl-] forholdet vises i det nedre panelet i figur 3B. Ifølge resultatene i finne 3Bekstrapolert maksimal verdien av ~ 7 mV i krysset potensielle Skift (fra figur 3A) antyder at Cl- konsentrasjonen tilstøtende til Ag/AgCl referanse elektroden reduserer ~ 70% av den gjennomsnittlig konsentrasjon av bulk bading væske når væskestrøm er fraværende (figur 3B, bunnen).
I vår forrige undersøkelse, ble Kir2.1 strømmer rapportert til bli lettere strømning ved å gjenopprette convectively (økende) [K+] på kanalen innløp10. Denne ideen stammer fra fenomener som forekommer mellom bading væske og Ag/AgCl elektrode, som Kir2.1 kanalen kan fungere som en K+ elektrode like den Ag/AgCl elektrode fungerer som en elektrode Cl- . Denne ideen er skjematisk illustrert i figur 4A og 4B. Et representativt eksempel på flytende flyt-indusert tilrettelegging av Kir2.1 strøm er vist i figur 4C. Kir2.1 strøm ble brakt frem av et hyperpolarizing spenning skritt fra et holde potensial 0-100 mV i rotte basophilic leukemi (RBL) celler. Anvendelse av væskestrøm (5 mL/min eller 0.004 m/s) økt lett Kir2.1 gjeldende (figur 4C). Denne tilrettelegging av væskestrøm ble tidligere foreslått å være formidlet av mobilnettet signalering men av elektrokjemiske effekten konvektive transportations K+ ioner til unstirred grenselag10.
Figur 1: skjematisk viser oppsettet for bading kammeret for væske-flow regulering av ionekanaler i patch-klemme innspillingen. Nedre panel er side (sagittal inndelingen) oppdateringen-klemme kammeret. Det oppsummerer banen til strømning og plasseringen av studerte cellen, elektroder, og inn-/ utløp av væsken. Fordi væsken er kontinuerlig pumpet ut gjennom uttaket røret ved å suge, er høyden av væske i kammeret opprettholdt på et relativt konstant nivå. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Effekter av væske flyt på L-type spenning avhengig av Ca2 + kanal (VDCCL) strømmer med og uten agarose 3 M KCl bridge. VDCCL strøm ble registrert i enzymatisk spredt rotte hvem arteriell myocytter med nystatin perforert patch-klemme opptak. Normal tyrode fysiologisk saltløsning med 4,2 mM EDTA uten divalent kasjoner ble brukt som bading løsning11. Pipetter løsningen finnes CsCl, 140 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0.05 mM; pH justert til 7,2 med CsOH. (A og B) Med agarose 3M KCl-broen. (A) en representant jeg-V relasjon for VDCCL gjeldende og effekten av væskestrøm. (B) Sammendrag av væske virkningene på jeg-V forholdet mellom VDCCL strømninger. (C og D) Uten agarose 3M KCl broen. (C) jeg-V relasjoner VDCCL strøm. (D) oppsummerte jeg-V relasjoner av peak VDCCL strøm i fravær og tilstedeværelsen av væskestrøm. Former av spenning trinnene for fremlokkende VDCCL strøm er vist i figur innfelt. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effekter av væskestrøm på flytende-metallisk krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode og estimering av ekte Cl- konsentrasjon i unstirred laget ved referanse elektroden fra målt krysset potensial. (A) A representant sporing av krysset mulige endringer på grunn av ulike priser av flytende strøm (øvre panel). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon11. Krysset potensial-fluid flow rate forholdet (n = 5). (B) øvre panel: representant opptak av krysset mulige endringer på grunn av ulike konsentrasjoner av NaCl løsninger. Nedre panel: semi logger handlingen av krysset potensial-[Cl-] forholdet (n = 5). Den rette linjen i rødt representerer beste tilpassing av en modifisert han-ligningen for likevekt potensial med en tidoble skråning på 49 mV. Grunn av begrenset selektivitet av Na+, sammenlignet med Cl-, for å generere væske/metal krysset potensial, slope-verdien av 49 mV, i stedet for 58 mV, produsert beste tilpassing i krysset potensial-[Cl-] forhold på rommet temperatur. 49-FV skråningen angir Cl- avhengighet (eller selektivitet) på Ag/AgCl referanse elektrode > 95% over andre ion (i dette tilfellet Na+), ifølge Goldman-Hodgkin-Katz spenning ligningen. En endring av 7 mV på en Cl- konsentrasjon av 150 mM angir en nedgang på ~ 30% i Cl- konsentrasjon. (C) en representant sporing av krysset potensialet i ulike konsentrasjoner av NaCl løsninger med bruk av 3 M KCl agarose bridge (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk av virkningene av konveksjon modell av væskestrøm på ion konsentrasjonen ved de åpne kanalene under ion nåværende fluks. (A) under statisk forhold med lite konvektive transport av ioner i løsningen med elektrisk felt, K+ ion flux gjennom K+-selektiv ionekanaler kan føre til en nedgang i K+ konsentrasjoner i microdomain ved siden av kanal innløpet. (B) strømning kan convectively gjenopprette nedgangen i K+ konsentrasjon tilstøtende i åpen kanal innløpet. (C) effekten av væskestrøm på innover likeretter Kir2.1 kanal strøm. Strømning økt øyeblikkelig Kir2.1 strøm. Form av spenning trinnet vises i figur-senket. Kir2.1 strøm ble spilt inn med høy K+-bading og -pipette løsninger. Bading løsning: 148.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukose; pH justert 7,4 med NaOH. Pipetter løsning: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM ethyleneglycol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic syre (EGTA), pH 7.2 (justert med KOH). Siden RBL - 2H 3 celler er svært utsatt for hypo-osmotisk hevelse og påfølgende utløser av volum-aktivert Cl- strøm, 38 mM sukrose ble lagt til bading løsning å justere for osmolaritet og hindre celle hevelse. Videre ble en Cl- kanal blokker [4, 4'-diisothiocyano-2, 2-stilbenedisulfonic acid (DIDS, 30 µM)] lagt til pipette løsningen å eliminere enhver kontaminering av Cl- strømninger. Panelet C er endret fra en tidligere publikasjon10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien viste vi en metode for å måle virkelige Cl- konsentrasjon i unstirred laget ved den Ag/AgCl referanse elektroden ved å bestemme flytende-metallisk krysset potensial med en åpen patch-klemme pipette fylt med en høy KCl konsentrasjon. Endringen i Cl- konsentrasjon i grenselag kan resultere i et skifte av krysset potensialet når du bytter fra statiske til væske-strømningsforhold. Å bruke en agarose KCl bro mellom referanse elektrode og bading væske kan hindre Cl- konsentrasjon-relaterte feil eller gjenstander under oppdateringen-klemme opptak.
Foruten understreker viktigheten av et agar eller agarose salt bridge, er et annet program av denne metoden ved estimering virkelige konsentrasjon i unstirred grenselag som følger. Fordi plasmalemmal ionekanaler kan fungere som ion-selektiv elektroder (like Ag/AgCl elektrode funksjonene som en Cl- -elektrode), den virkelige konsentrasjonen i unstirred grensen lag ved kanalen innløp på cellemembranen overflaten kan være forskjellig fra gjennomsnittet konsentrasjonen av bulk væsken. Denne forskjellen i konsentrasjon mellom hoveddelen flytende og unstirred lag tilstøtende celle membran er den virkelige under klinisk innstillinger og bør skilles fra biologiske modulering av kanalen gating flytende flyt/skjær kraft. Dessverre, i motsetning til unstirred lageffekten mellom Ag/AgCl referanse elektrode og bading væske, vi kan ikke fikse unstirred lageffekten ved siden av cellemembranen overflaten når studere regulering av ionekanaler med flytende flyt/skjær makt.
Men vurderer observasjon at ekte konsentrasjon i unstirred laget er ca 70% av det i bulk væske (Figur 3), kan vi gjøre noen endringer i eksperimentelle data å skille biologiske modulering av ionekanaler fra "elektrokjemiske fenomenet av unstirred effekt". Den virkelige konsentrasjonen i unstirred laget på cellemembranen overflaten var forventet å være ca 70% av gjennomsnittlig konsentrasjonen av bulk bading løsningen i en fersk studie10. Siden strømning gjenopprettet den redusert konsentrasjonen, tilrettelagt det Kir2.1 gjeldende uavhengig av mobilnettet signalering10. I vår forrige studien nåværende tetthet var stor (2.5 et / m2) med en høy ekstracellulære K+ konsentrasjon og høy uttrykk for Kir2.1 i RBL celler10. Men når det gjelder ekte cellemembraner med ulike ion kanalen nåværende tetthet amplituder, kan unstirred lageffekten på cellemembranen overflaten avhenger av amplituden til ion kanalen nåværende tetthet. Dessuten, dette kan føre noen ion kanal strøm (spesielt de med relativt lavere gjeldende tettheter) for å være ufølsom for væske-flow regulering; selv unstirred lageffekten reguleres electrochemically og ikke biologisk. Dette kan derfor påvirke teknikken beskrevet her. Derfor undersøkt muligheten for å utvikle en kvantitativ metode som er tilstrekkelig for korrigere eksperimentelle resultater skal være i fremtiden studier.
I Figur 3observerte vi at flytende-metallisk kryss potensial mellom Ag/AgCl referanse elektrode og bading væske var sterkt avhengig av tilstanden til Ag/AgCl elektroden. Faktisk, når Ag/AgCl elektroden var perfekt i stand, endringer i krysset potensial på grunn av væskestrøm var minimal (data ikke vist). Men forårsaket dårlig klorering av Ag/AgCl elektroden en større endring i krysset potensielle. Siden Ag/AgCl referanse elektrode er svært utsatt for forskjellige eksterne stimuli, som ultrafiolett lys og oksidativt stress, er bruker en agar agarose KCl bridge alltid anbefalt. Selv om endringer i krysset potensialet av væske flyte mellom bading væske og referanse elektroden er en potensiell feilkilde, beregnet vi er de virkelige ion konsentrasjonene i den unstirred grensen lag ved å måle skifte av veikryss potensial under ulike væske-flow PR (figur 3A og 3B).
Det kritiske punktet i trinn 4 for å forberede standardkurven for estimering av ekte Cl- konsentrasjon i unstirred grensen lag med SKIFT krysset potensial er at standardkurven skal registreres under en tilstrekkelig flow rate (30 mL / min i dette eksperimentet). Selv om denne infusjonshastigheten er veldig fort, i praktisk tilfeller raskere væsken, mindre konsentrasjon drop er grensen lag (Figur 3). Den åpne pipette må i tillegg fylles med høy KCl, i stedet for en vanlig pipette-løsning, for at en patch-klemme studie for å forhindre endring i krysset potensielle mellom en pipette og bading løsning.
Skjær kraften i innstillingen patch-klemme kan estimeres fra følgende forhold11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (ligning 2)
Hvor: τ er skjæring stress (N/cm2); Μ er viskositet (0,001 N m/s2 for vann ved 20 ° C); Q er væske flow rate (m3/s); b er i bredde (m). h er kammer høyde (m). Når væske infusjonshastigheten er 30 mL/min, er skjær kraften i patch-kammeret vist i figur 1 anslått til ~0.75 dyn/cm2 i henhold til ovenstående ligningen. Dette er et lite skjær force nivå sammenlignet med fysiologiske skjær force; endotelceller i blodårene kan bli utsatt for skjær krefter opptil 40 dyn/cm18,19. Derfor, forutsatt at ion kanalene ikke er følsom for skjær krefter mindre enn 0,75 dyn/cm2, kan vi studere flytende flyt/skjær force sensitivitet ion kanaler etter eksklusive unstirred grenselag effekten ved å angi betingelsen kontroll 0,75 dyn/cm2. Men synes noen ionekanaler, inkludert Kir2.1, å være følsomme for skjær krefter mindre enn 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
Unstirred lageffekten ble opprinnelig foreslått av Barry og kolleger12,13,14,15. Her gir vi en metode for å beregne virkelige konsentrasjon i unstirred laget ved å måle endringer i krysset potensial med åpne patch-klemme pipette. Vi foreslår også at denne unstirred grenselag effekten kan bidra til flytende flyt-indusert regulering av ion kanal strømninger og bør vurderes mens han studerte flytende flyt-mechanosensitivity ion kanaler. Imidlertid kan basert på denne hypotesen, det bli spurt hvorfor noen ion kanal strøm er ikke følsom for flytende flyt-avhengige regulering hvis unstirred grenselag effekten er en elektrokjemisk i stedet for biologisk kontroll. Som kort adressert ovenfor er dette sannsynligvis fordi bare ion strøm gjennom kanaler med stor nok enkanals konduktans og lenge nok åpne-tid kan være tilrettelagt av væskestrøm. Dvs for etableringen av det unstirred laget som konsentrasjonen er forskjellig fra gjennomsnittet i bulk løsning, flux i membranen fase bør være raske nok i forhold til at i den vandige fasen14. Vi nylig har foreslått at gjeldende gjennom Kir2.1 kanaler, som konduktans og åpne tid er tilstrekkelig høy, er tilrettelagt av væskestrøm via mekanismer konvektive restaurering av konsentrasjon i unstirred grensen laget av cellemembranen overflaten11.
I konklusjonen, presenterer vi en metode for å måle konsentrasjon i unstirred grensen laget ved siden av referanse elektrode og cellemembranen overflaten med en åpen patch-klemme pipette. Foruten understreker viktigheten av et agarose KCl bro, gir denne metoden også en måte å gjøre rede for unstirred lageffekten mens tolke flytende flyt/skjær force kontroll av ionekanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Pioneer Research Center programmet (2011-0027921), av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammer (2015R1C1A1A02036887 og NRF-2016R1A2B4014795) gjennom National Research Foundation av Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT & Fremtiden planlegging, og av en bevilgning av Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom Korea helse industri Development Institute (KHIDI), finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
