Summary
Mechanosensitive आयन चैनल अक्सर पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के साथ द्रव प्रवाह/कतरनी बल संवेदनशीलता के संदर्भ में अध्ययन कर रहे हैं । हालांकि, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, द्रव प्रवाह पर परिणाम-आयन चैनलों के नियमों गलत हो सकता है. यहां, हम रोकने और एक सैद्धांतिक आधार के साथ ऐसी त्रुटियों को दूर करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं ।
Abstract
द्रव प्रवाह एक महत्वपूर्ण पर्यावरणीय उत्तेजना है कि नियंत्रण कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं, द्रव प्रवाह प्रेरित vasodilation के रूप में है । हालांकि द्रव प्रवाह/कतरनी बल के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं कर रहे हैं, तरल पदार्थ प्रवाह आयन चैनल गेटिंग के मध्यस्थता नियमन महत्वपूर्ण योगदान कर सकते हैं । इसलिए, द्रव प्रवाह/आयन चैनलों के कतरनी बल संवेदनशीलता पैच-दबाना तकनीक का उपयोग कर अध्ययन किया गया है । हालांकि, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, परिणाम और डेटा की व्याख्या गलत हो सकता है । यहां, हम तरल प्रवाह से संबंधित त्रुटियों के लिए प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक सबूत पेश करते हैं और इन त्रुटियों का आकलन करने, रोकने, और सही करने के तरीके प्रदान करते हैं । एजी/AgCl के बीच जंक्शन क्षमता में परिवर्तन संदर्भ इलेक्ट्रोड और स्नान द्रव 3 एम KCl के साथ भरा एक खुला पिपेट के साथ मापा गया. द्रव प्रवाह तो तरल/धातु जंक्शन क्षमता लगभग 7 एमवी शिफ्ट सकता है । इसके विपरीत, वोल्टेज द्रव प्रवाह द्वारा प्रेरित बदलाव को मापने के द्वारा, हम उभारा सीमा परत में आयन एकाग्रता का अनुमान है । स्थिर हालत में, असली आयन AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड या कोशिका झिल्ली की सतह पर आयन चैनल प्रवेश करने के लिए आसंन सांद्रता प्रवाह हालत में है कि लगभग 30% के रूप में कम के रूप में पहुंच सकते हैं । स्नान द्रव और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच एक agarose 3 मीटर KCl पुल रखकर जंक्शन संभावित स्थानांतरण की इस समस्या को रोका हो सकता है. हालांकि, इस तरह से कोशिका झिल्ली की सतह से सटे उभारी परत प्रभाव को ठीक नहीं किया जा सका । यहां, हम एक खुले पैच के साथ उभारा सीमा परत में वास्तविक आयन सांद्रता को मापने के लिए एक विधि प्रदान-क्लैंप पिपेट, एक agarose नमक का उपयोग कर के महत्व पर बल-पुल जबकि आयन धाराओं के द्रव प्रवाह प्रेरित विनियमन का अध्ययन । इसलिए, इस उपंयास दृष्टिकोण है, जो ध्यान में एक उभारा सीमा परत में आयनों के असली सांद्रता लेता है, प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा व्याख्या पर उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है आयन चैनलों के द्रव कतरनी तनाव विनियमन से संबंधित .
Introduction
द्रव प्रवाह एक महत्वपूर्ण पर्यावरणीय क्यू है कि कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है जैसे द्रव प्रवाह प्रेरित vasodilation और द्रव कतरनी बल पर निर्भर संवहनी रिमॉडलिंग और विकास1,2, 3,4,5. हालांकि द्रव प्रवाह कतरनी बल के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं कर रहे हैं, यह माना जाता है कि तरल पदार्थ प्रवाह आयन चैनल गेटिंग के मध्यस्थ नियमन गंभीर रूप से द्रव प्रवाह में योगदान कर सकते हैं-प्रेरित प्रतिक्रियाएं5 , 6 , 7 , 8. उदाहरण के लिए, endothelial आवक दिष्टकारी कीर 2.1 और ca2 +-सक्रिय k+ (kca२.३, KCNN3) चैनलों के सक्रियण के बाद ca2 + द्रव प्रवाह द्वारा आमद द्रव में योगदान करने के लिए सुझाव दिया गया है प्रवाह प्रेरित vasodilation6,7,8। इसलिए, कई आयन चैनल, विशेष रूप से यांत्रिक रूप से सक्रिय या-बाधित चैनलों, द्रव प्रवाह के संदर्भ में अध्ययन किया गया है/कतरनी बल पैच के साथ-क्लैंप तकनीक6,9,10 , 11. हालांकि, प्रायोगिक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है पैच दबाना रिकॉर्डिंग, परिणाम और तरल प्रवाह पर डेटा की व्याख्या-आयन चैनलों के नियमों के आधार पर गलत हो सकता है10,11.
पैच में द्रव प्रवाह प्रेरित कलाकृतियों का एक स्रोत-दबाना रिकॉर्डिंग स्नान द्रव और एजी के बीच जंक्शन क्षमता से है/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड11. यह आम तौर पर माना जाता है कि स्नान द्रव और एजी/AgCl इलेक्ट्रोड के बीच तरल/धातु जंक्शन की क्षमता निरंतर है , स्नान द्रव की सीएल एकाग्रता के रूप में लगातार रखा जाता है, स्नान समाधान के बीच रासायनिक प्रतिक्रिया पर विचार और एजी/AgCl इलेक्ट्रोड होने के लिए:
Ag + Cl-↔ AgCl + इलेक्ट्रॉन (e-) (समीकरण 1)
हालांकि, एक मामले में जहां स्नान समाधान और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड (समीकरण 1) के बीच समग्र विद्युत प्रतिक्रिया बाईं ओर से सही करने के लिए आय, सीएल स्नान तरल पदार्थ एजी करने के लिए आसंन/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड (उभारा सीमा परत12,13,14,15) स्नान समाधान के थोक में है कि तुलना में बहुत कम हो सकता है, जब तक पर्याप्त convectional परिवहन सुनिश्चित किया जाता है. एजी के अपर्याप्त chlorination के साथ एक पुराने या गैर आदर्श एजी/AgCl इलेक्ट्रोड का उपयोग कर इस तरह के एक जोखिम बढ़ सकता है । संदर्भ इलेक्ट्रोड पर यह द्रव प्रवाह से संबंधित विरूपण साक्ष्य, वास्तव में, बस एक पारंपरिक agarose स्नान द्रव और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच नमक पुल रखने के द्वारा बाहर रखा जा सकता है, के बाद से विरूपण साक्ष्य असली सीएल में परिवर्तन पर आधारित है- एकाग्रता एजी के निकटवर्ती/AgCl इलेक्ट्रोड11. इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे प्रवाह संबंधी जंक्शन संभावित परिवर्तनों को रोकने और उभार सीमा परत में वास्तविक आयन सांद्रता को मापने के लिए ।
स्नान द्रव और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच एक agarose KCl पुल रखने के बाद, वहां एक और महत्वपूर्ण कारक है कि विचार किया जाना चाहिए: बस के रूप में संदर्भ एजी/AgCl इलेक्ट्रोड एक सीएल इलेक्ट्रोड की तरह कार्य करता है, आयन चैनल भी समारोह कर सकते है एक आयन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड की तरह. स्नान द्रव और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच एक उभार सीमा परत की स्थिति झिल्ली आयन चैनलों के माध्यम से extracellular और intracellular समाधान के बीच आयनों के आंदोलन के दौरान उत्पन्न होती है । इसका मतलब यह है कि सावधानी जब तरल प्रवाह द्वारा आयन चैनलों के विनियमन की व्याख्या इस्तेमाल किया जाना चाहिए । के रूप में हमारे पिछले अध्ययन11में चर्चा की, एक समाधान है जिसमें एक विद्युत ढाल मौजूद है के माध्यम से आयनों का आंदोलन तीन अलग तंत्र के माध्यम से हो सकता है: प्रसार, प्रवास, और संवहन, जहां प्रसार आंदोलन है एकाग्रता ढाल द्वारा प्रेरित, प्रवास बिजली के ढाल से प्रेरित आंदोलन है, और संवहन द्रव प्रवाह के माध्यम से आंदोलन है । इन तीन परिवहन तंत्र के अलावा, संवहन मोड आयनों11 के आंदोलन के लिए सबसे अधिक योगदान देता है (> १,००० बार सामान्य पैच-क्लैंप सेटिंग्स के तहत प्रसार या प्रवास से अधिक). इस के सैद्धांतिक आधार रूपों क्यों स्नान द्रव और एजी के बीच संभावित जंक्शन/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड बहुत अलग स्थिर और तरल पदार्थ प्रवाह की स्थिति11के तहत कर सकते हैं ।
ऊपर प्रस्तावित परिकल्पना के अनुसार, आयन चैनल पर द्रव प्रवाह के कुछ facilitatory प्रभाव वर्तमान में झिल्ली की सतह पर चैनल प्रवेश करने के लिए आसंन वास्तविक आयन सांद्रता की संवहनी बहाली से आस्थगित किया जा सकता है (उभारा सीमा परत) 10. इस मामले में, द्रव प्रवाह आयन चैनल धाराओं पर प्रेरित प्रभाव बस विद्युत घटनाओं से उत्पंन किया है, आयन चैनल गेटिंग के विनियमन से नहीं । इसी तरह का विचार पहले बैरी और सहयोगियों द्वारा सुझाए गए12,13,14,15 कठोर सैद्धांतिक विचार और प्रयोगात्मक सबूत के आधार पर, यह भी हड़कंप परत के रूप में जाना जाता है या परिवहन संख्या प्रभाव । यदि कुछ आयन चैनल पर्याप्त एक चैनल कंडक्टर है और लंबे समय पर्याप्त खुला-चैनल के माध्यम से पर्याप्त परिवहन दर प्रदान करने के लिए बार (एक तेज झिल्ली में एक तेजी से परिवहन की सतह की तुलना में), एक सीमा परत प्रभाव पैदा हो सकता है . इस प्रकार, संवहन पर निर्भर परिवहन अंतिम द्रव-प्रवाह-प्रेरित सुविधा आयन वर्तमान10,12,13,14,15के लिए योगदान कर सकते हैं ।
इस अध्ययन में, हम एक आगर या agarose नमक पुल का उपयोग करते हुए आयन धाराओं के द्रव प्रवाह प्रेरित विनियमन का अध्ययन करने के महत्व पर जोर दिया । हम भी एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड और झिल्ली आयन चैनल के लिए आसंन सीमा से सटे परत में असली आयन सांद्रता को मापने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । इसके अलावा, तरल पदार्थ प्रवाह आयन चैनल धाराओं (यानी, संवहन परिकल्पना या उभारा परत परिवहन संख्या प्रभाव) के मॉडुलन प्रेरित मॉड्यूलेशन की सैद्धांतिक व्याख्या डिजाइन और पर अध्ययन की व्याख्या के लिए बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कतरनी बल-आयन चैनलों का विनियमन । उभारा सीमा परत परिवहन संख्या प्रभाव के अनुसार, हम झिल्ली आयन चैनलों के सभी प्रकार के माध्यम से आयन चैनल धाराओं द्रव प्रवाह कतरनी बल के लिए उनके जैविक संवेदनशीलता के स्वतंत्र, द्रव प्रवाह द्वारा सुविधा हो सकती है कि भविष्यवाणी, लेकिन केवल अगर आयन चैनल पर्याप्त एक चैनल कंडक्टर और लंबे समय खुला है । उच्च आयन चैनल वर्तमान घनत्व कोशिका झिल्ली की सतह पर क्रियाशील सीमा परत प्रभाव बढ़ा सकते हैं ।
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Protocol
कोनकुक विश्वविद्यालय के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया ।
1. Agarose स्नान समाधान और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच नमक पुल
नोट: Agarose 3m KCl नमक पुलों का उत्पादन कर रहे है के रूप में पहले बताया मामूली विविधताओं के साथ12 ।
- पुलों का हुआ गठन
- एक U-आकार के रूप में उपयुक्त बनाने के लिए आग कांच केशिका ट्यूबों मोड़ । केशिकाओं के भीतरी व्यास बड़ी आयन धाराओं जब रिकॉर्डिंग श्रृंखला प्रतिरोध को कम करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए. 2-5 mm के एक भीतरी व्यास के साथ ट्यूबों आमतौर पर स्वीकार्य हैं ।
- agarose 3 मीटर KCl समाधान की तैयारी
- 3 मीटर KCl सॉल्यूशन (1 मीटर या 2 मीटर) की १०० मिलीलीटर तैयार करना भी स्वीकार्य है ।
- agarose के 3 जी वजन ।
- ९० और १०० डिग्री सेल्सियस के बीच एक गर्म थाली पर KCl के १०० मिलीलीटर (यानी, 3% agarose) में agarose भंग ।
- पुलों के साथ लोड हो रहा है 3 M KCl agarose
- आसान लदान के लिए, agarose-KCl समाधान में यू के आकार का गिलास पुलों विसर्जित कर दिया ।
नोट: agarose-KCl समाधान एक उथले और व्यापक कंटेनर में निहित है अगर यह कांच पुलों खुदाई करने के लिए आसान है । - उन्हें कमरे के तापमान पर रात भर रखें (RT) agarose के लिए सेट और कठोर.
- ध्यान से बाहर खुदाई agarose-KCl-सेट से भरा हुआ ग्लास पुलों/
- आसान लदान के लिए, agarose-KCl समाधान में यू के आकार का गिलास पुलों विसर्जित कर दिया ।
- पुलों का भंडारण
- एक व्यापक गर्दन की बोतल में 3 मीटर KCl समाधान की पर्याप्त मात्रा (यानी, ५०० मिलीलीटर) तैयार करें ।
- एक फ्रिज में बोतल में तैयार agarose-नमक पुलों की दुकान ।
2. एक पैच-clamping चैंबर में कोशिकाओं को द्रव प्रवाह कतरनी बल के आवेदन
नोट: पैच का एक योजनाबद्ध आरेख-दबाना प्रयोगात्मक सेट-अप चित्रा 1में दिखाया गया है.
- एक स्नान समाधान के साथ भरी हुई कंटेनर प्लेस (मात्रा और ऊंचाई पहले से ही मापा जाना चाहिए) पैच-क्लैंप चैंबर के ऊपर ।
- ट्यूब सक्शन द्वारा स्नान समाधान के साथ पैच-क्लैंप चैंबर भरें ।
- द्रव प्रवाह को रोकने के लिए, कंटेनर की ओर से ट्यूब को तरल प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए क्लिप करें, फिर एक ही समय में सक्शन को रोकने के लिए सक्शन साइड पर ट्यूब क्लिप । यह "स्टेशनरी" नियंत्रण शर्त है ।
- द्रव प्रवाह कतरनी बल लागू करने के लिए, एक ही समय में कंटेनर और चूषण पक्षों पर दोनों ट्यूबों खुला ।
- इससे पहले या कोशिका के लिए द्रव प्रवाह कतरनी बल लगाने के बाद, मिलीलीटर में प्रवाह की दर को मापने/
- एक निश्चित समय पर द्रव की मात्रा में कमी को मापने के द्वारा प्रवाह की दर की गणना ।
- मापी प्रवाह दर और स्नान कक्ष की ज्यामिति (संरचना) से, कतरनी बल द्रव प्रवाह द्वारा सेल के लिए लागू अनुमानित (चर्चा अनुभाग देखें) होना चाहिए ।
- वैकल्पिक रूप से, प्रवाह की दर को नियंत्रित करने के लिए (2.3-2.6 चरणों के लिए), एक छिड़काव पंप का उपयोग करें । इस मामले में, एक स्थिर के बजाय एक गुणवाला प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहना ।
3. स्नान समाधान और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड (चित्रा 3ए) के बीच द्रव प्रवाह द्वारा तरल धातु जंक्शन क्षमता में परिवर्तन को मापने
- एजी/AgCl इलेक्ट्रोड या गोली, जो agarose नमक पुल के बिना तैयार उत्पादों से उपलब्ध है का उपयोग करें ।
- स्नान कक्ष के लिए एक सामांय शारीरिक नमक खारा तैयार (जैसे, १४३ mm NaCl, ५.४ mm KCl, ०.३३ mm2पीओ4, 5 मिमी HEPES, ०.५ मिमी MgCl2, १.८ मिमी CaCl2, 11 मिमी डी-ग्लूकोज; NaOH के साथ ७.४ को समायोजित पीएच) ।
- पिपेट और स्नान समाधान के बीच जंक्शन संभावित बदलाव को कम करने के लिए चैंबर में 3 मीटर KCl सॉल्यूशन युक्त एक पैच पिपेट रखें ।
- वोल्टेज दबाना वर्तमान दबाना मोड के लिए एम्पलीफायर ("मैं = 0" या "CC") को ठीक करें.
- प्रारंभिक ऑफसेट क्षमता nullifying के बाद, विभिंन प्रवाह दर से प्रेरित वोल्टेज में परिवर्तन को मापने ।
- यह सत्यापित करने के लिए कि वोल्टेज में परिवर्तन तरल/धातु जंक्शन क्षमता, फिर से जंक्शन की क्षमता पर द्रव प्रवाह के प्रभाव की जांच agarose-स्नान समाधान और एजी के बीच नमक पुल/AgCl इलेक्ट्रोड का उपयोग कर ।
4. स्थिर हालत (चित्र3 बी ) के तहत एजी/AgCl इलेक्ट्रोड के निकट उभारा परत में वास्तविक सीएल एकाग्रता का प्रायोगिक आकलन
- चरण 3 के परिणामों से, जंक्शन संभावित प्रवाह दर संबंधों को ड्रा और ऊपर अर्थ का उपसर्ग-द्रव प्रवाह दर से जंक्शन संभावित बदलाव के अधिक से अधिक (संतृप्ति) मूल्य का अनुमान है ।
- सीएल के विभिंन सांद्रता के साथ समाधान तैयार (यानी, ५०, ९९, १४७, १९५, और NaCl के २८८ मिमी) ।
- स्नान द्रव में सीएल- एकाग्रता बदलकर, जंक्शन संभावित-[सीएल-] संबंध ड्रा । ध्यान दें कि द्रव की दर लगातार और पर्याप्त उच्च होना चाहिए (> 30 मिलीलीटर/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड की है कि करने के लिए सीएल- एकाग्रता की कमी को रोकने के लिए ।
- दो रिलेशनशिप curves से, मापा जंक्शन संभावित बदलाव से सीएल एकाग्रता में परिवर्तन का अनुमान है ।
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Representative Results
पूरे सेल वोल्टेज-निर्भर एल प्रकार Ca2 + चैनल (VDCCएल) धाराओं enzymatically फैलाया चूहे mesenteric धमनी myocytes में दर्ज किया गया, के रूप में पहले11वर्णित है । धमनी myocytes dialyzed divalentएल11,16के माध्यम से वर्तमान प्रवाह की सुविधा के लिए नि: शुल्क स्नान समाधान के साथ nystatin-छिद्रित विंयास के तहत एक सीएस संपंन पिपेट समाधान के साथ थे । संक्षिप्त ध्रुवीकरण वोल्टेज रैंप या वोल्टेज कदम, की एक पकड़ क्षमता में-७० एमवी, VDCCएल धाराओं में लाने के लिए आवेदन किया गया. एक प्रतिनिधि वर्तमान-वोल्टेज (I-V) संबंध में VDCCL में और द्रव प्रवाह की उपस्थिति (5 मिलीलीटर/मिनट या लगभग ०.००४ मी.), एक agarose KCl पुल के साथ दर्ज की गई, चित्र 2aमें दिखाया गया है । द्रव प्रवाह थोड़ा एक वोल्टेज में VDCCएल वर्तमान बढ़-स्वतंत्र तरीके से । VDCCएल वर्तमान पर द्रव प्रवाह के इस सुविधा का प्रभाव चित्रा बीमें संक्षेप है ।
वोल्टेज-द्रव प्रवाह द्वारा VDCCएल वर्तमान के स्वतंत्र सुविधा द्रव या कतरनी बल के लिए VDCCएल का एक उचित प्रतिक्रिया है । 5 मिलीलीटर/मिनट या वर्तमान प्रयोगात्मक सेटअप में द्रव प्रवाह के लगभग ०.००४ मी/कतरनी बल के संदर्भ में लगभग ०.१ dyn/मुख्यमंत्री2 का प्रतिनिधित्व करने का अनुमान था (चर्चा देखें) । हालांकि, जब एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड सीधे एक agarose KCl पुल के बिना स्नान द्रव से जुड़ा हुआ था, द्रव प्रवाह की उपस्थिति में I-V संबंध सही करने के लिए एक स्थिर के तहत VDCCएल धाराओं की तुलना में स्थानांतरित शर्त (चित्रा 2c और 2d) । यह VDCCएल वर्तमान के निषेध में नकारात्मक वोल्टेज और VDCC की सुविधा पर वर्तमान और अधिक ध्रुवीकरण या सकारात्मक क्षमता पर मौजूदा के परिणामस्वरूप । इस मिसाल तरल प्रवाह में प्रेरित विरूपण साक्ष्य पैच-दबाना रिकॉर्डिंग जिसमें I-V संबंध का एक वोल्टेज शिफ्ट चैनल गेटिंग के संशोधन के कारण नहीं था, लेकिन वास्तव में स्नान द्रव और एजी के बीच एक जंक्शन संभावित बदलाव की वजह से था/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड11. द्रव प्रवाह प्रेरित जंक्शन संभावित बदलाव के लिए प्रत्यक्ष सबूत चित्रा 3में दिखाया गया है ।
जंक्शन संभावित शिफ्टों को चरण 3 के अनुसार मापा गया । परिवर्तन, द्रव प्रवाह के कारण, 3 मीटर KCl से भरा एक खुला पिपेट का उपयोग कर मापा गया, के रूप में पहले11वर्णित. एक खुले 3 मीटर KCl से भरा पिपेट के साथ, पिपेट और स्नान समाधान के बीच जंक्शन क्षमता को कम किया जा सकता है, और संभावित द्रव प्रवाह के कारण परिवर्तन स्नान समाधान और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड से मुख्य रूप से थे । स्नान द्रव और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच एक agarose 3 मीटर KCl पुल के बिना, द्रव प्रवाह एक द्रव प्रवाह दर पर निर्भर तरीके (3 ए) में तरल पदार्थ और एजी/AgCl इलेक्ट्रोड के बीच जंक्शनक्षमता स्थानांतरित कर दिया । अधिकतम जंक्शन संभावित परिवर्तन जंक्शन संभावित द्रव प्रवाह रिश्ता (3ए, नीचे) से ~ 7 एमवी होना extrapolated था । इसके विपरीत, जब agarose 3 एम KCl पुल का इस्तेमाल किया गया था, द्रव प्रवाह स्नान द्रव और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच जंक्शन की क्षमता में परिवर्तन नहीं किया ( चित्रा 3ए, नीचे के नीचे ग्राफ में संक्षेप) ।
आदेश में स्थिर और तरल पदार्थ प्रवाह की स्थिति है, जिसमें कार्रवाई की पर्याप्त संवहन मोड कार्यात्मक है के बीच एकाग्रता मतभेदों को मापने के लिए, हम सीएल स्नान द्रव पर सांद्रता बदलने के प्रभाव की जांच-एजी/AgCl इलेक्ट्रोड चरण 4 के अनुसार जंक्शन संभावित । सीएल एकाग्रता में वृद्धि एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से जंक्शन क्षमता स्थानांतरित (चित्र बी, ऊपर) बस द्रव प्रवाह के रूप में एक दर पर निर्भर तरीके से जंक्शन की क्षमता में बदलाव । एक KCl agarose पुल का उपयोग कर, जंक्शन संभावित एक सीएल- एकाग्रता पर निर्भर तरीके से बदलने से रोका गया था (चित्रा 3सी), यह दर्शाता है कि जंक्शन संभावित परिवर्तन स्नान समाधान और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच हुई, नहीं नहाने और पिपेट समाधान के बीच । जंक्शन संभावित-[Cl-] संबंध के अर्द्ध लॉग भूखंड चित्र बीके निचले पैनल में दिखाया गया है । चित्रा 3 बीमें परिणाम के अनुसार, जंक्शन संभावित शिफ्ट में ~ 7 एमवी की extrapolated अधिकतम मूल्य ( चित्राएक से) पता चलता है कि सीएल- एकाग्रता के लिए आसंन एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए कम हो जाती है ~ ७०% द्रव प्रवाह अनुपस्थित है जब थोक स्नान द्रव की औसत एकाग्रता (चित्र बी, नीचे).
हमारे पिछले अध्ययन में, कीर 2.1 धाराओं convectively बहाल (बढ़ती) [K+] द्वारा द्रव प्रवाह द्वारा सुविधा होने की सूचना दी गई चैनल प्रवेश10पर । कीर 2.1 चैनल एक K+ इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य कर सकते हैं के रूप में यह विचार स्नान द्रव और एजी/AgCl इलेक्ट्रोड के बीच होने वाली घटना से उपजा है, बस के रूप में एजी/ AgCl इलेक्ट्रोड एक सीएल इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य करता है । यह विचार योजनाबद्ध रूप से चित्र 4a और 4Bमें सचित्र है. कीर 2.1 धाराओं के द्रव प्रवाह प्रेरित सुविधा का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4cमें दिखाया गया है । कीर 2.1 धाराओं के एक होल्डिंग क्षमता से एक hyperpolarizing वोल्टेज कदम से उठाया गया था 0 करने के लिए-१०० एमवी में चूहा basophilic ल्यूकेमिया (RBL) कोशिकाओं. तरल पदार्थ का प्रवाह (5 मिलीलीटर/) आसानी से बढ़ाएं कीर 2.1 वर्तमान (फिगर 4c) । द्रव प्रवाह द्वारा यह सुविधा पहले से नहीं सेलुलर संकेतन द्वारा मध्यस्थता हो सुझाव दिया गया था, लेकिन K के संवहनी परिवहन के विद्युत प्रभाव से unstirr सीमा परत10करने के लिए आयनों.
चित्रा 1: योजनाबद्ध पैच-दबाना रिकॉर्डिंग में आयन चैनलों के द्रव प्रवाह विनियमन के लिए स्नान कक्ष के सेटअप दिखा । निचले पैनल पैच-क्लैंप चैंबर की ओर देखने (sagittal अनुभाग) है । यह तरल पदार्थ का प्रवाह और एक अध्ययन सेल के स्थानों, इलेक्ट्रोड, और प्रवेश के पथ summarizes/ क्योंकि तरल पदार्थ लगातार चूषण द्वारा आउटलेट ट्यूब के माध्यम से बाहर पंप है, चैंबर में तरल पदार्थ की ऊंचाई एक अपेक्षाकृत स्थिर स्तर पर बनाए रखा है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: L-प्रकार वोल्टेज पर निर्भर Ca2 + चैनल पर द्रव प्रवाह के प्रभाव (VDCCL) धाराओं के साथ और बिना agarose 3 मीटर KCl पुल. VDCCएल धाराओं nystatin छिद्रित पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के साथ enzymatically फैलाया हुआ चूहे mesenteric धमनी myocytes में दर्ज किया गया । divalent cations बिना ४.२ mM EDTA के साथ सामान्य tyrode शारीरिक नमक समाधान स्नान समाधान11के रूप में इस्तेमाल किया गया था । पिपेट समाधान CsCl, १४० मिमी निहित; MgCl2, 1 मिमी; HEPES, 5 मिमी; EGTA ०.०५ मिमी; CsOH के साथ ७.२ के लिए समायोजित पीएच । (A और B) agarose 3m KCl-पुल के साथ । (क) VDCCएल वर्तमान और द्रव प्रवाह के प्रभाव के लिए एक प्रतिनिधि I-V संबंध । (ख) VDCCL स्वरुपात के I-V संबंध पर द्रव प्रभाव का सारांश । (सी और डी) बिना agarose 3m KCl पुल । (ग) VDCCL स्वरुपात के I-V संबंध । (घ) तरल प्रवाह की अनुपस्थिति और उपस्थिति में पीक VDCCL धाराओं के I-V संबंधों का सार. VDCCएल धाराओं के लिए वोल्टेज कदम के आकार आंकड़ा इनसेट में दिखाया गया है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: तरल-धातु जंक्शन क्षमता पर द्रव प्रवाह के प्रभाव के बीच स्नान द्रव और एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड और मापा जंक्शन से संदर्भ इलेक्ट्रोड के बगल में उभारा परत में वास्तविक सीएल एकाग्रता का आकलन संभावित. (एक) जंक्शन के संभावित द्रव प्रवाह (ऊपरी पैनल) के विभिंन दरों के कारण परिवर्तन के एक प्रतिनिधि अनुरेखण । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन11से संशोधित किया गया है । जंक्शन संभावित-द्रव प्रवाह दर संबंध (n = 5) । (ख) अपर पैनल: जंक्शन की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग NaCl समाधानों के विभिंन सांद्रता के कारण संभावित परिवर्तन । निचला फलक: जंक्शन संभावित-[Cl-] संबंध के अर्द्ध-लॉग प्लॉट (n = 5) । लाल रंग में सीधी रेखा एक संशोधित ताकि नेर्ंस्ट द्वारा सबसे अच्छा फिट का प्रतिनिधित्व करता है-४९ एमवी की एक दस गुना ढलान के साथ संतुलन क्षमता के लिए समीकरण । एनए के परिमित selectivity के कारण+, की तुलना में सीएल-, तरल के उत्पादन के लिए/धातु जंक्शन क्षमता, ४९ एमवी की ढलान मूल्य, बजाय ५८ एमवी, जंक्शन संभावित में सबसे अच्छा फिट का उत्पादन-[सीएल-] कमरे में संबंध तापमान. ४९-एमवी ढलान सीएल-निर्भरता (या selectivity ) एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के अंय आयन पर ९५% > (इस मामले में, Na+), गोल्डमैन-Hodgkin-Katz वोल्टेज समीकरण के अनुसार इंगित करता है । १५० mM की एक सीएल- एकाग्रता में 7 एमवी की एक पारी सीएल- एकाग्रता में ~ 30% की कमी को इंगित करता है । (ग) 3 एम KCl agarose ब्रिज (n = 3) के एक प्रयोग के साथ NaCl समाधान के विभिंन सांद्रता में जंक्शन की क्षमता का एक प्रतिनिधि अनुरेखण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: आयन वर्तमान प्रवाह के दौरान खुले चैनलों से सटे आयन सांद्रता पर द्रव प्रवाह के संवहन मॉडल के प्रभाव के योजनाबद्ध । (क) बिजली के क्षेत्र के साथ समाधान में आयनों के थोड़ा संवहनी परिवहन के साथ स्थिर शर्तों के तहत , कश्मीर + के माध्यमसे आयन प्रवाह-चुनिंदा आयन चैनलों के बगल में microdomain में कश्मीर+ सांद्रता में कमी पैदा कर सकता है चैनल प्रवेश । (ख) द्रव प्रवाह में कमी convectively बहाल कर सकते है कश्मीर+ एकाग्रता खुला चैनल प्रवेश करने के लिए आसंन । (ग) आवक दिष्टकारी कीर 2.1 चैनल धाराओं पर द्रव प्रवाह का प्रभाव । द्रव प्रवाह तुरन्त कीर 2.1 धाराओं में वृद्धि हुई । वोल्टेज स्टेप की आकृति का आंकड़ा इनसेट में दिखाया गया है । कीर 2.1 धाराओं उच्च K+-स्नान और-पिपेट समाधान का उपयोग कर दर्ज किया गया । स्नान समाधान: १४८.४ मिमी KCl, ०.३३ मिमी णः2पीओ4, 5 मिमी HEPES, ०.५ मिमी MgCl2, १.८ मिमी CaCl2, 11 मिमी डी-ग्लूकोज; NaOH के साथ ७.४ के लिए समायोजित पीएच । पिपेट समाधान: १३५ मिमी KCl, 5 मिमी NaCl, 5 मिमी मिलीग्राम-एटीपी, 10 मिमी HEPES, 5 मिमी ethyleneglycol-बीआईएस (2-aminoethyl)-एन, एन, एन ', एन ',-tetraacetic एसिड (EGTA), पीएच ७.२ (KOH के साथ समायोजित) । चूंकि RBL-2H3 कोशिकाओं अत्यधिक hypo-आसमाटिक सूजन और मात्रा सक्रिय सीएल- धाराओं के फलस्वरूप ट्रिगर करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, ३८ mM सुक्रोज स्नान समाधान के लिए जोड़ा गया था osmolarity के लिए समायोजित करने और कोशिका सूजन को रोकने के । इसके अलावा, एक सीएल चैनल ब्लॉकर [4, 4 '-diisothiocyano-2, 2 '-stilbenedisulfonic एसिड (DIDS, 30 µ एम)] सीएल धाराओं द्वारा किसी भी संक्रमण को खत्म करने के लिए पिपेट समाधान के लिए जोड़ा गया था । कक्ष C पिछले प्रकाशन10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस अध्ययन में, हम एक उच्च KCl से भरा एक खुला पैच -क्लैंप पिपेट के साथ तरल धातु जंक्शन क्षमता का निर्धारण करके एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए आसंन परत में वास्तविक सीएल एकाग्रता को मापने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया एकाग्रता. सीमा परत में सीएल- एकाग्रता में परिवर्तन जंक्शन क्षमता की एक पारी में परिणाम कर सकते है जब स्थैतिक से द्रव प्रवाह की स्थिति के लिए स्विचन । बस संदर्भ इलेक्ट्रोड और स्नान द्रव के बीच एक agarose KCl पुल का उपयोग कर पैच- दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान सीएल एकाग्रता से संबंधित त्रुटियों या कलाकृतियों को रोका जा सकता है ।
एक आगर या agarose नमक पुल के महत्व पर बल देने के अलावा, इस विधि का एक और unstirr सीमा परत में वास्तविक आयन एकाग्रता का आकलन करने में इस प्रकार है । क्योंकि plasmalemmal आयन चैनल आयन के रूप में कार्य कर सकते हैं-चुनिंदा इलेक्ट्रोड (बस के रूप में एजी/AgCl इलेक्ट्रोड एक सीएल- इलेक्ट्रोड की तरह कार्य करता है), unstirr सीमा में असली आयन एकाग्रता चैनल प्रवेश करने के लिए आसंन परत कोशिका झिल्ली पर सतह थोक द्रव की औसत एकाग्रता से अलग हो सकता है । थोक तरल पदार्थ और कोशिका झिल्ली के निकट उभारा परत के बीच आयन एकाग्रता में यह अंतर नैदानिक सेटिंग्स के तहत वास्तविक परिदृश्य है और द्रव प्रवाह द्वारा चैनल गेटिंग के जैविक मॉडुलन से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए/कतरनी बल । दुर्भाग्य से, एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड और स्नान तरल पदार्थ के बीच असमान परत प्रभाव के विपरीत, हम जब द्रव प्रवाह द्वारा आयन चैनलों के विनियमन का अध्ययन कोशिका झिल्ली की सतह के निकट उभारा परत प्रभाव को ठीक नहीं कर सकते/कतरनी बल ।
हालांकि, अवलोकन है कि भारी मात्रा में असली आयन एकाग्रता विचार के लगभग ७०% है कि थोक द्रव में (चित्रा 3), हम प्रयोगात्मक डेटा में कुछ संशोधन करने के लिए आयन चैनलों के जैविक मॉडुलन भेद कर सकते हैं "विद्युत घटना से उभारा परत प्रभाव" । सेल झिल्ली की सतह पर उभारा परत में असली आयन एकाग्रता के लिए लगभग ७०% थोक स्नान समाधान के औसत एकाग्रता के एक हाल के अध्ययन में10की उंमीद थी । के बाद से द्रव प्रवाह कम आयन एकाग्रता बहाल, यह कीर 2.1 सेलुलर संकेतन के वर्तमान स्वतंत्र10की सुविधा । हमारे पिछले अध्ययन में, वर्तमान घनत्व काफी अधिक था (२.५ a/एम2) एक उच्च extracellular K+ एकाग्रता और RBL कोशिकाओं10में कीर 2.1 की उच्च अभिव्यक्ति के साथ. हालांकि, विभिन्न आयन चैनल वर्तमान घनत्व आयाम के साथ वास्तविक कोशिका झिल्ली के मामले में, कोशिका झिल्ली सतह पर उभारा परत प्रभाव आयन चैनल वर्तमान घनत्व के आयाम पर बहुत निर्भर हो सकता है. इसके अलावा, यह कुछ आयन चैनल धाराओं कारण हो सकता है (विशेष रूप से अपेक्षाकृत कम वर्तमान घनत्व के साथ उन) को द्रव प्रवाह विनियमन के प्रति असंवेदनशील; हालांकि, हड़कंप परत प्रभाव विनियमित electrochemically है और नहीं जैविक रूप से । इस प्रकार, यह यहां वर्णित तकनीक को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, एक मात्रात्मक तरीका है कि प्रयोगात्मक परिणाम सही करने के लिए पर्याप्त है के विकास की संभावना भविष्य के अध्ययन में जांच की जानी चाहिए ।
चित्रा 3में, हमने देखा है कि तरल-धातु जंक्शन के बीच संभावित एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड और स्नान द्रव एजी/AgCl इलेक्ट्रोड की स्थिति पर बहुत निर्भर था । वास्तव में, जब एजी/AgCl इलेक्ट्रोड हालत में सही था, जंक्शन द्रव प्रवाह के कारण क्षमता में परिवर्तन कम (दिखाया डेटा) था । हालांकि, एजी/AgCl इलेक्ट्रोड के गरीब chlorination जंक्शन क्षमता में एक बड़ा बदलाव का कारण बना । के बाद से एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड बहुत विभिंन बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अतिसंवेदनशील है, जैसे पराबैंगनी प्रकाश और ऑक्सीडेटिव तनाव, एक आगर या agarose KCl पुल का उपयोग हमेशा की सिफारिश की है । हालांकि स्नान तरल पदार्थ और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच द्रव प्रवाह की संभावित जंक्शन में परिवर्तन त्रुटि का एक संभावित स्रोत है, हम सफलतापूर्वक जंक्शन की पाली को मापने के द्वारा उभारा सीमा परत में वास्तविक आयन सांद्रता का अनुमान विभिंन द्रव प्रवाह दरों के तहत संभावित (3 ए और बी) ।
जंक्शन संभाव्यता की पाली से उभारी सीमा परतों में अचल सीएल- एकाग्रता के आकलन के लिए मानक वक्र तैयार करने के लिए चरण 4 में महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि मानक वक्र एक sufficent प्रवाह दर के तहत दर्ज किया जाना चाहिए (30 एमएल/ इस प्रयोग में मिन). हालांकि इस प्रवाह की दर बहुत तेजी से है, व्यावहारिक मामलों में तेजी से तरल पदार्थ, छोटे एकाग्रता ड्रॉप सीमा परतों (चित्रा 3) पर है. इसके अलावा, खुले पिपेट उच्च KCl से भरा जाना चाहिए, बजाय एक नियमित रूप से पिपेट समाधान के लिए आदेश में एक पिपेट और स्नान समाधान के बीच जंक्शन की क्षमता में परिवर्तन को रोकने के लिए एक पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए ।
कतरनी बल पैच-क्लैंप सेटिंग में निम्न संबंध11से अनुमान लगाया जा सकता:
τ = (6μQ)/(bh2) (समीकरण 2)
कहां: τ कतरनी तनाव है (N/ μ चिपचिपापन (०.००१ N मी2 में पानी के लिए 20 ° c) है; क्यू द्रव प्रवाह दर (एम3/ b चैंबर चौड़ाई (एम) है; और एच चैंबर ऊंचाई (एम) है । जब द्रव प्रवाह दर है 30 मिलीलीटर/मिनट, पैच में कतरनी बल 1 चित्रा में दिखाया गया है ~ ०.७५ dyn/सेमी2 उपरोक्त समीकरण के अनुसार होने का अनुमान है । यह शारीरिक कतरनी बल की तुलना में एक कम कतरनी बल स्तर है; रक्त वाहिकाओं में endothelial कोशिकाओं ४० dyn/सेमी18,19तक की कतरनी बलों के अधीन किया जा सकता है । इसलिए, बशर्ते कि आयन चैनलों के प्रति संवेदनशील नहीं है कतरनी बलों से कम ०.७५ dyn/cm2, हम द्रव प्रवाह का अध्ययन कर सकते हैं/नियंत्रण शर्त सेट करके उभारा सीमा परत प्रभाव को छोड़कर के बाद आयन चैनलों के कतरनी बल संवेदनशीलता to ०.७५ dyn/मुख्यमंत्री2. हालांकि, कुछ आयन चैनल, कीर 2.1 सहित, ०.७५ dyn/cm2,3,4,5,6से कम कतरनी बलों के प्रति संवेदनशील होने लगते हैं ।
उभारा परत प्रभाव मूल रूप से बैरी और सहकर्मियों12,13,14,15द्वारा सुझाव दिया गया था । यहां, हम एक विधि प्रदान करने के लिए खुला पैच-क्लैंप पिपेट के साथ जंक्शन क्षमता में परिवर्तन को मापने के द्वारा उभारा परत में वास्तविक आयन एकाग्रता का अनुमान है । हम यह भी सुझाव है कि इस उभारा सीमा परत प्रभाव आयन चैनल धाराओं के द्रव प्रवाह प्रेरित नियमन के लिए योगदान कर सकते हैं और आयन चैनलों के द्रव प्रवाह-mechanosensitivity अध्ययन करते समय विचार किया जाना चाहिए. हालांकि, इस परिकल्पना के आधार पर, यह पूछा जा सकता है क्यों कुछ आयन चैनल धाराओं के प्रति संवेदनशील नहीं है द्रव प्रवाह पर निर्भर विनियमन यदि हड़कंप सीमा परत प्रभाव एक विद्युत बजाय जैविक नियंत्रण है । के रूप में संक्षेप में ऊपर संबोधित किया, यह शायद इसलिए है क्योंकि केवल बड़े पर्याप्त एकल चैनल के संचालन के साथ चैनल के माध्यम से आयन धाराओं और लंबे समय तक पर्याप्त खुला बार द्रव प्रवाह द्वारा सुविधा हो सकती है । यही कारण है कि, की स्थापना के लिए unstirr परत जिसमें आयन एकाग्रता थोक समाधान में औसत से अलग है, झिल्ली चरण में प्रवाह पर्याप्त है कि जलीय चरण14में तुलना में तेजी से होना चाहिए. हमने हाल ही में सुझाव दिया है कि कीर 2.1 चैनलों, जिनके कंडक्टर और खुले समय पर्याप्त रूप से उच्च रहे है के माध्यम से वर्तमान, के उभारा सीमा परत में आयन एकाग्रता की संवहनी बहाली के तंत्र के माध्यम से द्रव प्रवाह द्वारा की सुविधा है कोशिका झिल्ली सतह11.
अंत में, हम एक खुला पैच-क्लैंप पिपेट के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड और कोशिका झिल्ली सतह के बगल में उभारा सीमा परत में आयन एकाग्रता को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । एक agarose KCl पुल के महत्व पर बल के अलावा, इस विधि भी एक तरह से उभारा परत प्रभाव के लिए खाते में प्रदान करता है, जबकि द्रव प्रवाह की व्याख्या/
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अनुसंधान पायनियर रिसर्च सेंटर प्रोग्राम (2011-0027921) द्वारा समर्थित किया गया था, बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम (2015R1C1A1A02036887 और एनआरएफ-2016R1A2B4014795) द्वारा कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से वित्त पोषित विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी द्वारा & भविष्य की योजना बना, और कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI), स्वास्थ्य & कल्याण, कोरिया गणराज्य (HI15C1540) के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से डी परियोजना के एक अनुदान के द्वारा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
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