Summary
Canali ionici mechanosensitive sono spesso studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con registrazione di patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, l'esito il fluidi flusso-regolamenti dei canali ionici possa essere errata. Qui, forniamo metodi per prevenire e correggere tali errori con una base teorica.
Abstract
Flusso del fluido è un importante stimolo ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici, quali vasodilatazione indotta da flusso fluido. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di flusso fluido/taglio completamente non sono capiti, fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating può contribuire criticamente. Di conseguenza, sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici è stato studiato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, i risultati e l'interpretazione dei dati può essere errate. Qui, presentiamo la prova sperimentale e teorica per errori relativi al flusso di fluido e fornisce metodi per la stima, la prevenzione e la correzione di questi errori. Cambiamenti nella giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione sono stati misurati con una pipetta aperta riempita con 3M KCl. flusso del fluido potrebbe quindi spostano la giunzione liquido/metallo potenziali per circa 7 mV. Al contrario, misurando lo spostamento di tensione indotto dal flusso del fluido, abbiamo stimato la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred. In condizioni statiche, le concentrazioni di ione reale adiacente all'ingresso di canale Ag/AgCl riferimento elettrodo o ione alla superficie della membrana cellulare possono raggiungere come basso come approssimativamente il 30% di quello nella condizione di flusso. Ponendo un'agarosi 3M ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione può impedire questo problema di spostamento potenziale di giunzione. Tuttavia, l'effetto di unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare non poteva essere risolto in questo modo. Qui, forniamo un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred con una pipetta aperta patch-clamp, sottolineando l'importanza dell'utilizzo di un sale di agarosio-ponte mentre studiava fluido regolamento indotta da flusso di correnti di ioni. Pertanto, questo nuovo approccio, che prende in considerazione le reali concentrazioni di ioni nello strato limite unstirred, può fornire la comprensione utile il disegno sperimentale ed interpretazione di dati legate alla sollecitazione di taglio fluido regolazione dei canali ionici .
Introduction
Flusso del fluido è un importante segnale ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici come la vasodilatazione indotta da flusso fluida e fluido shear forza-dipendente vascolare rimodellamento e sviluppo1,2, 3,4,5. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di taglio di flusso del fluido completamente non sono capiti, si ritiene che fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating criticamente può contribuire alle risposte indotta da flusso fluido5 , 6 , 7 , 8. ad esempio, l'attivazione del raddrizzatore inward endoteliale Kir 2.1 e Ca2 +-attivato K+ (KCa2.3, KCNN3) canali dopo l'afflusso di Ca2 + di flusso del fluido è stata suggerita per contribuire al fluido vasodilatazione indotta da flusso6,7,8. Di conseguenza, molti canali ionici, soprattutto meccanicamente attivato o - inibiti canali, sono stati studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con il patch-clamp tecnica6,9,10 , 11. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale eseguito durante la registrazione di patch-clamp, risultati e interpretazione dei dati sul flusso fluidi-regolamenti delle scanalature dello ione può essere erronea10,11.
Dallo svincolo di potenziale tra il liquido del bagno e riferimento Ag/AgCl elettrodi11è una fonte di fluidi indotta da flusso artefatti nella registrazione di patch-clamp. Si ritiene generalmente che la giunzione di liquido/metallo potenziale tra il fluido di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl è costante come la concentrazione di Cl– del fluido balneazione viene mantenuta costante, considerando la risposta chimica tra la soluzione di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl per essere:
AG + Cl–↔ AgCl + elettrone (e–) (equazione 1)
Tuttavia, in un caso dove la reazione elettrochimica nel complesso tra la soluzione di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (equazione 1) procede da sinistra a destra, la concentrazione di Cl– del fluido balneare adiacente di Ag/AgCl fare riferimento elettrodo (strato limite unstirred12,13,14,15) può essere molto inferiore a quello nella maggior parte dei balneari soluzione, a meno che non sufficiente convezione trasporto è assicurato. Utilizzando un elettrodo Ag/AgCl vecchio o non ideale con insufficiente clorazione di Ag può aumentare tale rischio. Questo artefatto correlate a flusso fluido presso l'elettrodo di riferimento, infatti, possa essere esclusi semplicemente posizionando un ponte convenzionale dell'agarosi-sale tra il fluido di balneazione e riferimento dell'elettrodo, dal momento che il manufatto si basa sulle alterazioni nella real Cl– concentrazione adiacente l' elettrodo Ag/AgCl11. Il protocollo presentato in questo studio viene descritto come impedire i cambiamenti di potenziale di giunzione correlate a flusso e misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred.
Dopo aver posizionato un'agarosi ponte di KCl tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl, c'è un altro fattore cruciale da considerare: proprio come il riferimento Ag/AgCl elettrodi agisce come un elettrodo Cl– , scanalature dello ione possono funzionare anche come un elettrodo iono-selettivi. La situazione di uno strato di contorno unstirred tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl si verifica durante il movimento di ioni tra le soluzioni extracellulare e intracellulare attraverso i canali ionici di membrana. Ciò implica che l'attenzione dovrebbe essere usato quando interpretare il regolamento dello ione di canali di flusso del fluido. Come discusso nel nostro precedente studio11, il movimento di ioni attraverso una soluzione in cui è presente un gradiente elettrochimico può verificarsi tramite tre meccanismi distinti: convezione, dove la diffusione è il movimento, la migrazione e diffusione indotta da gradiente di concentrazione, migrazione è il movimento guidato dal gradiente elettrico, e la convezione è il movimento attraverso il flusso di fluido. Tra questi meccanismi di tre trasporto, modalità convezione contribuisce la maggior parte al movimento di ioni11 (> 1.000 volte maggiore diffusione o migrazione sotto impostazioni solite patch-clamp). Questo costituisce la base teorica del perché giunzione potenziali tra la balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl può molto sotto diverse condizioni statiche e flusso fluido11.
Secondo l'ipotesi proposta sopra, alcuni effetti facilitatory del flusso del liquido sul canale dello ione corrente possono essere dedotta dal restauro convettivo di concentrazioni di ioni reale adiacente all'ingresso del canale sulla superficie di membrana (strato di contorno unstirred) 10. In questo caso, gli effetti indotta da flusso fluidi sulle correnti di canale ionico sono semplicemente sorti da eventi elettrochimici, non dal regolamento di ioni canale gating. Un'idea simile è stata suggerita in precedenza da Barry e colleghi12,13,14,15 basato su considerazioni teoriche rigorose e la prova sperimentale, anche conosciuto come lo strato unstirred o trasporto numero effetto. Se alcuni canali ionici hanno sufficiente conduttanza del singolo canale e abbastanza a lungo tempo aperto per fornire sufficiente trasporto velocità attraverso i canali (un più veloce tasso di trasporto nella membrana che in superficie della membrana unstirred), un effetto di strato di contorno possono sorgere . Quindi, il trasporto di convezione-dipendente può contribuire alle eventuali agevolazioni indotta da fluido-flusso di ioni corrente10,12,13,14,15.
In questo studio, sottolineiamo l'importanza di utilizzare un agar o agarosio sale-ponte mentre studiava regolamento indotta da fluido-flusso di correnti di ioni. Forniamo anche un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred adiacente per i canali di ioni Ag/AgCl elettrodi e membrana di riferimento. Inoltre, l'interpretazione teorica di fluido modulazione indotta da flusso di correnti di canale ionico (vale a dire, ipotesi di convezione o effetto numero di unstirred livello trasporto) possa fornire informazioni preziose per la progettazione e interpretare gli studi su il taglio forza-regolamento dei canali ionici. Secondo l'effetto numero di trasporto unstirred strato di contorno, prevediamo che le correnti del canale ionico attraverso tutti i tipi di canali ionici di membrana possono essere facilitate dal flusso del fluido, indipendente della loro sensibilità biologica a forza di taglio di flusso del fluido, ma solo se i canali ionici sono sufficienti monocanale conduttanza e lungo tempo aperto. Maggiore densità di corrente del canale di ioni può aumentare l'effetto di unstirred strato limite sulla superficie della membrana cellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Konkuk University.
1. agarosio sale ponti tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl
Nota: Agarosio 3M KCl sale ponti sono prodotte come precedentemente descritto12 con variazioni minori.
- Formazione di ponti
- Piegare i tubi capillari di vetro fuoco per formare una forma a U come appropriato. Il diametro interno dei capillari dovrebbe essere abbastanza grande per ridurre la resistenza in serie durante la registrazione correnti di grandi ioni. Tubi con un diametro interno di 2-5 mm sono solitamente accettabili.
- Preparazione della soluzione di KCl 3M agarosio
- Preparare 100 mL di soluzione di KCl 3M (1m o 2m è anche accettabile).
- Peso 3 g di agarosio.
- Sciogliere l'agarosio in 100 mL di KCl (cioè, 3% di agarosio) su una piastra calda tra 90 e 100 ° C.
- I ponti con 3M KCl agarosio di caricamento
- Per facilitare il carico, immergere i ponti di vetro a forma di U nella soluzione di agarosio-KCl.
Nota: È facile da scavare i ponti di vetro se la soluzione di agarosio-KCl è contenuta in un contenitore poco profondo e largo. - Tenerli durante la notte a temperatura ambiente (TA) per l'agarosio impostare e indurire.
- Accuratamente di scavare i ponti di agarosio-KCl-caricato vetro dal set/indurito dell'agarosi-sale.
- Per facilitare il carico, immergere i ponti di vetro a forma di U nella soluzione di agarosio-KCl.
- Memorizzare i ponti
- Preparare abbastanza volume (cioè, 500 mL) della soluzione di KCl 3M in un flacone a collo largo.
- Memorizzare i ponti di agarosio-sale preparati in bottiglia in frigorifero.
2. applicazione della forza di taglio di flusso del fluido alle cellule in una camera di Patch di bloccaggio
Nota: Un diagramma schematico della disposizione sperimentale patch clamp è illustrato nella Figura 1.
- Posto in un contenitore caricato con soluzione di balneazione (volume e l'altezza dovrebbe già essere misurati) sopra la camera di patch-clamp.
- Riempire la camera di patch-clamp con la soluzione di balneazione di suctioning il tubo.
- Per interrompere il flusso del fluido, il tubo di clip a lato del contenitore di bloccare il flusso del fluido, quindi il tubo di clip sul lato aspirazione per interrompere l'aspirazione allo stesso tempo. Questa è la condizione di controllo "stazionario".
- Per applicare la forza di taglio di flusso del fluido, aprire entrambi i tubi sul lato aspirazione e contenitore allo stesso tempo.
- Prima o dopo aver applicato la forza di taglio di flusso del fluido alla cella, misura della portata in mL/min.
- Calcolare la portata misurando la diminuzione nel volume del liquido in un dato tempo.
- Dalla portata misurata e la geometria (struttura) della camera di balneazione, la forza di taglio applicata alla cella di flusso di liquido dovrebbe essere stimata (Vedi sezione discussione).
- In alternativa, per controllare il tasso di flusso (per la procedura 2.3-2.6), è possibile utilizzare una pompa di perfusione. In questo caso, fare attenzione a garantire una costante anziché un flusso pulsatile.
3. misurare i cambiamenti nel potenziale di giunzione metallo liquido di flusso del fluido tra soluzione del bagno ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl (Figura 3A)
- Utilizzare l'elettrodo Ag/AgCl o pellet, che è disponibile dai prodotti già pronti, senza il ponte salino dell'agarosi.
- Preparare una soluzione salina fisiologica sale per la camera di balneazione (ad es., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucosio; pH regolato a 7.4 con NaOH).
- Posizionare una pipetta patch contenente una soluzione di KCl 3M in aula per ridurre al minimo lo spostamento potenziale di giunzione tra la pipetta e soluzioni di balneazione.
- Difficoltà l'amplificatore di tensione-morsetto per la modalità corrente del morsetto ("io = 0" o "CC").
- Dopo annullando il potenziale di offset iniziale, misurare le variazioni di tensione indotte da varie portate.
- Per verificare che le variazioni di tensione sono potenziali di giunzione liquido/metallo, ri-esaminare l'effetto del flusso del fluido sul potenziale di giunzione utilizzando il bridge di agarosio-sale tra la soluzione del bagno e un elettrodo Ag/AgCl.
4. sperimentale stima della concentrazione reale Cl– nello strato Unstirred adiacente all'elettrodo Ag/AgCl sotto condizione statica (Figura 3B)
- Dai risultati del passaggio 3, disegnare le relazioni di potenziale-portata di giunzione e stimare il valore massimo (saturazione) di MAIUSC potenziale di giunzione dalla portata supra-fluido.
- Preparare soluzioni con varie concentrazioni di Cl (cioè, 50, 99, 147, 195 e 288 mM di NaCl).
- Modificando il Cl– concentrazione nel liquido bagnarsi, disegnare la giunzione potenziali-[Cl–] relazione. Si noti che il tasso di liquido deve essere costante e sufficientemente elevata (> 30 mL / min) per evitare la diminuzione della concentrazione di Cl– a quello dell'elettrodo di riferimento Ag/AgCl adiacente.
- Le curve di due rapporti, stimare i cambiamenti nella concentrazione di Cl– dal turno di potenziale di giunzione misurato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A cellula intera tensione-dipendente tipo L Ca2 + canale (VDCCL) correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto, come descritto in precedenza11. I miociti arteriosi sono stati dializzati con una soluzione di pipetta Cs-ricco sotto la configurazione nistatina-perforato con soluzione di balneazione privo di cationi bivalenti per facilitare il flusso di corrente attraverso VDCCL11,16. Breve depolarizzazione rampe di tensione o di passaggi di tensione, a un potenziale di holding di -70 mV, sono stati applicati per suscitare le correnti VDCCL . Un rappresentante corrente-tensione (I-V) rapporto a VDCCL in assenza e in presenza di flusso del fluido (5 mL/min o circa 0.004 m/s), registrato con un'agarosi ponte di KCl, è mostrato nella Figura 2A. Flusso del fluido leggermente aumentato il VDCCL attuale in modo indipendente dalla tensione. Questo effetto facilito di flusso del fluido sulla VDCCL attuale è riassunto nella Figura 2B.
La facilitazione di tensione-indipendente VDCCL corrente di flusso del fluido è una risposta adeguata del VDCCL per la forza di fluido o di taglio. 5 mL/min o circa 0.004 m/s di flusso del fluido nel setup sperimentale corrente è stato stimato per rappresentare circa 0,1 dyn/cm2 in termini di forza di taglio (vedi discussione). Però, quando fa riferimento Ag/AgCl elettrodi era legato direttamente al fluido di balneazione senza un'agarosi ponte di KCl, il rapporto -V ioin presenza di flusso del fluido spostato a destra rispetto a quella delle correnti VDCCL sotto una statica condizione (Figura 2 e 2D). Ciò ha provocato l'inibizione di VDCCL attuale alle tensioni negative e facilitazione del VDCCL attuale a più potenziali depolarizzati o positivi. Ciò esemplifica l'artefatto indotta da flusso fluido nella registrazione di patch-clamp in cui un cambiamento di tensione della relazione io-V non era a causa della modifica di gating del canale ma era in realtà dovuto uno spostamento potenziale di giunzione tra il fluido di balneazione e Ag/AgCl fare riferimento a elettrodo11. Prova diretta per lo spostamento del potenziale di giunzione indotta da flusso fluido è illustrata nella Figura 3.
I potenziali cambiamenti di giunzione sono stati misurati secondo la fase 3. Le modifiche, a causa di flusso del fluido, sono state misurate utilizzando una pipetta aperta riempita con 3M KCl, come descritto in precedenza11. Con una pipetta aperta riempita con 3M KCl, svincolo potenziale fra la pipetta e bagnarsi soluzioni potrebbe essere ridotto al minimo, e le potenziali modifiche a causa di flusso del fluido erano principalmente dalla soluzione di balneazione ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl. Senza un'agarosi 3M KCl ponte tra la balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl, flusso del fluido spostato il potenziale di giunzione tra il fluido e l'elettrodo Ag/AgCl in modo di tasso-dipendente di flusso del fluido (Figura 3A). Il cambiamento del potenziale di giunzione è stato estrapolato per essere ~ 7 mV dal rapporto di flusso potenziale-fluido di giunzione (Figura 3A, in basso). Al contrario, quando l'agarosio 3M KCl ponte è stato utilizzato, flusso del fluido non ha alterato la giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione (riassunte nel grafico inferiore della Figura 3A, inferiore).
Al fine di misurare le differenze di concentrazione tra le condizioni di flusso statico e fluido, in cui sufficiente convezione modi di azione sono funzionali, abbiamo esaminato l'effetto della modifica le concentrazioni di Cl– dell'elettrodo di balneazione fluido-Ag/AgCl giunzione potenziali secondo passaggio 4. L'aumento della concentrazione di Cl– ha spostato la giunzione potenziale in modo concentrazione-dipendente (Figura 3B, top) proprio come il flusso del fluido spostato la giunzione potenziale in un modo dipendente dalla frequenza. Utilizzando un ponte di agarosio di KCl, il potenziale di giunzione è stato impedito di cambiare in un Cl– modo dipendente dalla concentrazione (Figura 3), che indica che si è verificato il cambiamento del potenziale di giunzione tra l'elettrodo di riferimento e soluzione di vasca, non tra le soluzioni bagno e pipetta. La trama del rapporto potenziale-[Cl–] giunzione semi-log viene visualizzata nel pannello inferiore della Figura 3B. Secondo i risultati in Figura 3B, il massimo valore estrapolato di ~ 7 mV in turno potenziale di giunzione (da Figura 3A) suggerisce che la concentrazione di Cl– adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl diminuisce di circa il 70% dei concentrazione media di massa bagno fluido quando è assente il flusso del fluido (Figura 3B, in basso).
Nel nostro studio precedente, Kir 2.1 correnti sono state segnalate per essere agevolata dalla fluidodinamica ripristinando masse (crescente) [K+] al canale ingresso10. Questa idea nasce dai fenomeni che si verificano tra il fluido di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl, come il canale di Kir 2.1 può funzionare come un elettrodo K+ proprio come le funzioni di elettrodo Ag/AgCl come elettrodo Cl– . Questa idea è illustrata schematicamente in Figura 4A e 4B. Un esempio rappresentativo di facilitazione indotta da flusso fluido di Kir 2.1 correnti è illustrato nella Figura 4. Le correnti di Kir 2.1 sono state suscitate da un passaggio iperpolarizzante di tensione da un potenziale di detenzione di 0 a -100 mV in cellule di leucemia basophilic (RBL) del ratto. Applicazione di flusso del fluido (5 mL/min o 0,004 m/s) aumentata prontamente la corrente di Kir 2.1 (Figura 4). Questa facilitazione di flusso del fluido precedentemente è stata suggerita per essere mediata non di segnalazione cellulare ma dall'effetto elettrochimico di trasporto convettivo di ioni K+ al unstirred strato limite10.
Figura 1: schematico mostrando l'installazione della camera del bagno per la regolazione di flusso fluido dei canali ionici nella registrazione patch clamp. Pannello inferiore è la vista laterale (sezione sagittale) della camera di patch-clamp. Essa riassume il percorso di flusso del fluido e le posizioni di una cella ha studiata, elettrodi e ingresso/uscita del fluido. Perché il liquido viene pompato continuamente fuori attraverso il tubo di aspirazione, l'altezza del fluido nella camera è mantenuta ad un livello relativamente costante. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti del fluido flusso su L-tipo tensione-dipendente Ca2 + canale (VDCCL) correnti con e senza l'agarosio 3M ponte di KCl. VDCCL correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto con registrazione di nistatina perforato patch clamp. Soluzione salina fisiologica normale tyrode con 4,2 mM EDTA senza cationi bivalenti è stato utilizzato come la soluzione di balneazione11. La soluzione di pipetta contenuta CsCl, 140 mM; MgCl2, 1mm; HEPES, 5mm; EGTA 0,05 mM; pH regolato a 7,2 con CsOH. (A e B) Con agarosio 3M KCl-ponte. (A) un rappresentante ho-V rapporto per la corrente VDCCL e gli effetti del flusso del fluido. (B) sintesi degli effetti fluidi sul rapporto -V hodelle correnti VDCCL . (C e D) Senza dell'agarosi 3M KCl ponte. (C) ho-V relazioni delle correnti VDCCL . (D) ricapitolato Irapporti -V delle correnti VDCCL picco in assenza e in presenza di flusso del fluido. Le forme di passaggi di tensione per suscitare VDCCL correnti sono mostrate nella figura rientranza. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti del flusso del fluido sulla giunzione metallo liquido potenziale tra il fluido di balneazione e Ag/AgCl riferimento elettrodo e stima di real Cl– concentrazione nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento dallo svincolo misurato potenziale. (A) analisi rappresentativa A dei potenziali cambiamenti di giunzione a causa dei diversi tassi di flusso del fluido (pannello superiore). Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione11. Il rapporto di tasso di flusso potenziale-fluido giunzione (n = 5). (B) superiore Pannello: rappresentante registrazione di potenziali modifiche di giunzione a causa di varie concentrazioni di NaCl soluzioni. Pannello inferiore: la trama del rapporto potenziale-[Cl–] giunzione semi-log (n = 5). La linea retta in rosso rappresenta la misura migliore di un'equazione del Nernst modificata per equilibrio potenziale con un pendio dieci volte di 49 mV. A causa della selettività finita di Na+, rispetto a quella di Cl-, per la generazione di potenziale, allo svincolo liquido/metallo il valore di pendenza di 49 mV, invece di 58 mV, prodotta la misura migliore nel rapporto potenziale-[Cl–] giunzione a camera temperatura. La pendenza di 49-mV indica la Cl– dipendenza (o selettività) dell'elettrodo di riferimento Ag/AgCl > 95% sopra gli altri ioni (in questo caso, Na+), secondo l'equazione di tensione di Goldman-Hodgkin-Katz. Uno spostamento di 7 mV a una concentrazione di Cl– di 150 mM indica una diminuzione di circa il 30% della concentrazione di Cl– . L'analisi rappresentativa (C) un potenziale di giunzione in varie concentrazioni di NaCl soluzioni con un uso del ponte di agarosio M KCl 3 (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: schematica degli effetti di convezione di modello di flusso del fluido sulle concentrazioni dello ione adiacente le scanalature aperte durante l'attuale flusso ionico. (A) in condizioni statiche con piccolo trasporto convettivo di ioni nella soluzione con campo elettrico, lo ione K+ di flusso attraverso K+-canali ionici selettivi possono causare una diminuzione nelle concentrazioni di K+ nel microdomain adiacente il imbocco del canale. (B) fluidodinamica masse può ripristinare la diminuzione nella concentrazione di K+ adiacente all'ingresso del canale aperto. (C) effetto di flusso del fluido sulle correnti di canale Kir 2.1 raddrizzatore. Flusso del fluido aumentato istantaneamente le correnti di Kir 2.1. La forma del passo tensione è mostrata nella figura rientranza. Le correnti di Kir 2.1 sono state registrate usando alta K+-soluzioni di bagnarsi e - pipetta. Soluzione di balneazione: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucosio; pH regolato a 7.4 con NaOH. Pipettare soluzione: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5mm etilenglicole-bis (2-amminoetil)-N, N, N', N',-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH 7,2 (regolato con KOH). Poiché le cellule RBL - 2H3 sono altamente suscettibili di IPO-osmotico gonfiore e conseguente innesco di volume-attivato Cl– correnti, 38mm saccarosio è stato aggiunto alla soluzione di balneazione regolare per osmolarità e prevenire il gonfiore delle cellule. Inoltre, un bloccante dei canali del Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic acido (DIDS, 30 µM)] è stato aggiunto alla soluzione di pipetta per eliminare eventuali contaminazioni da correnti Cl– . Pannello C è stato modificato da una precedente pubblicazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare la concentrazione reale di Cl– nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl determinando la giunzione metallo liquido potenziale con una pipetta di patch-clamp aperto riempita con un alta KCl concentrazione. Il cambiamento nella concentrazione di Cl– nello strato limite può causare uno spostamento del potenziale di giunzione quando si passa da statico a condizioni di flusso fluido. Semplicemente utilizzando un'agarosi ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e la balneazione fluido può impedire gli errori relativi alla concentrazione di Cl– o artefatti durante la registrazione di patch-clamp.
Oltre a sottolineare l'importanza di un ponte salino agar o agarosio, un'altra applicazione di questo metodo nella stima di concentrazione di ioni reale nello strato limite unstirred è come segue. Perché i canali ionici plasmalemmal possono funzionare come elettrodi iono-selettivi (proprio come le funzioni di elettrodo Ag/AgCl come un elettrodo Cl– ), la concentrazione di ioni reale nel contorno unstirred strato adiacente all'entrata del canale alla membrana delle cellule superficie può essere diverso dalla concentrazione media del fluido alla rinfusa. Questa differenza nella concentrazione di ioni tra la massa fluido e unstirred strato adiacente alla membrana cellulare è lo scenario reale sotto regolazioni cliniche e dovrebbe essere distinto dalla modulazione biologica del canale gating di attrito flusso fluido. Purtroppo, a differenza dell'effetto di unstirred strato tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione, non possiamo risolvere l'effetto unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare quando si studia la regolazione dei canali ionici di attrito flusso fluido.
Tuttavia, considerando l'osservazione che la concentrazione di ioni reale nello strato unstirred è circa il 70% di quello nel liquido di massa (Figura 3), possiamo fare alcune modifiche nei dati sperimentali per distinguere la modulazione biologica dei canali ionici dal "fenomeno elettrochimico di effetto unstirred strato". La concentrazione di ioni reale nello strato unstirred sulla superficie della membrana cellulare doveva essere circa il 70% della concentrazione media di massa soluzione in un recente studio10di balneazione. Poiché il flusso del fluido restaurato la concentrazione di ioni in diminuzione, ha facilitato il Kir 2.1 corrente indipendentemente dal10di segnalazione cellulare. Nel nostro studio precedente, era notevolmente alta densità di corrente (2,5 A / m2) con un alta K extracellulare+ concentrazione e alta espressione di Kir 2.1 in RBL cellule10. Tuttavia, nel caso di membrane cellulari reali con ampiezze diverse di densità di corrente canale ionico, l'effetto di unstirred strato sulla superficie della membrana cellulare può dipendere notevolmente l'ampiezza di densità di corrente del canale ionico. Inoltre, ciò potrebbe causare alcuni ioni correnti di canale (soprattutto quelli con relativamente più basse densità di corrente) insensibili alla regolazione della quantità di fluido; anche se l'effetto di strato unstirred è regolata elettrochimicamente e non biologicamente. Così, questo può influenzare la tecnica qui descritta. Di conseguenza, la possibilità di sviluppare un metodo quantitativo è sufficiente per correggere i risultati sperimentali dovrebbe essere studiato in futuro studi.
In Figura 3, abbiamo osservato che potenziale di giunzione metallo liquido tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e balneazione fluido dipendeva notevolmente la condizione dell'elettrodo Ag/AgCl. Infatti, quando l'elettrodo Ag/AgCl era perfetto in condizioni, modifiche nella giunzione potenziale a causa di flusso del fluido è stato minimi (dati non mostrati). Tuttavia, scarsa clorazione dell'elettrodo Ag/AgCl provocato uno spostamento maggiore nella giunzione potenziale. Poiché l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl è molto suscettibile ai vari stimoli esterni, come lo stress ossidativo e luce ultravioletto, sempre è consigliabile utilizzare un agar o agarosio ponte di KCl. Anche se i cambiamenti nel potenziale di giunzione da fluido il flusso tra balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento è una potenziale fonte di errore, abbiamo stimato correttamente le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred misurando lo spostamento della giunzione potenziale sotto i vari tassi di flusso fluido (Figura 3A e 3B).
Il punto critico nel passaggio 4 per la preparazione della curva standard per la stima della concentrazione di Cl– reale in strati limite unstirred dallo spostamento del potenziale di giunzione è che la curva standard deve essere registrata sotto una portata sufficiente (30 mL / min in questo esperimento). Anche se la portata è molto veloce, in casi pratici più velocemente il fluido, più piccolo il calo di concentrazione è a strati limite (Figura 3). Inoltre, la pipetta aperta deve essere riempita con KCl alta, invece di una soluzione di pipetta regolari, in ordine per uno studio di patch-clamp per impedire la modifica nella giunzione potenziali tra una pipetta e soluzione di balneazione.
La forza di taglio nell'impostazione del patch-clamp può essere calcolata con la seguente relazione11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (equazione 2)
Dove: τ è la sollecitazione di taglio (N/cm2); Μ è la viscosità (0.001 N m/s2 per acqua a 20 ° C); Q è la portata del fluido (m3/s); b è la larghezza della camera (m); e h è l'altezza della camera (m). Quando il tasso di flusso del fluido è di 30 mL/min, la forza di taglio nella camera di patch illustrata nella Figura 1 è stimata in ~0.75 dyn/cm2 secondo l'equazione di cui sopra. Si tratta di un livello di forza di taglio basso rispetto alla forza di taglio fisiologico; cellule endoteliali nei vasi sanguigni possono essere sottoposti per inclinare le forze fino a 40 dyn/cm18,19. Pertanto, purché i canali ionici non sono sensibili alle elevate forze di taglio inferiore a 0,75 dyn/cm2, possiamo studiare la sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici dopo aver escluso l'effetto di strato di contorno unstirred impostando la condizione di controllo a 0,75 dyn/cm2. Tuttavia, alcuni canali ionici, tra cui Kir 2.1, sembrano essere sensibili alle forze di taglio inferiore a 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
L'effetto di strato unstirred originalmente è stato suggerito da Barry e colleghi12,13,14,15. Qui, forniamo un metodo per stimare la concentrazione di ioni reale nello strato unstirred misurando i cambiamenti nel potenziale di giunzione con pipetta aperta patch clamp. Suggeriamo inoltre che questo effetto di strato di contorno unstirred può contribuire alla regolazione indotta da flusso fluido delle correnti di canale ionico e dovrebbe essere considerato mentre studiava fluido flusso-mechanosensitivity dei canali ionici. Tuttavia, basato su questa ipotesi, può essere richiesto perché alcune correnti del canale ionico non sono sensibili a fluido regolazione di flusso-dipendente se l'effetto di strato di contorno unstirred è un elettrochimico anziché controllo biologico. Come brevemente richiamata sopra e questo è probabilmente perché solo correnti di ioni attraverso canali con grande abbastanza conduttanza del singolo canale e lungo abbastanza tempo aperto può essere facilitata dal flusso del fluido. Cioè, per l'istituzione del livello unstirred in cui la concentrazione di ioni è diversa dalla media in soluzione di massa, flusso in fase di membrana dovrebbe essere abbastanza veloce rispetto al che in acquoso fase14. Recentemente abbiamo suggerito che la corrente attraverso canali KIR 2.1, cui conduttanza e tempo aperto sono sufficientemente elevato, è facilitata dal flusso del fluido tramite meccanismi di restauro convettivo di concentrazione di ioni nello strato limite unstirred di 11di superficie della membrana cellulare.
In conclusione, vi presentiamo un metodo per misurare la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred adiacente alla superficie dell'elettrodo e della membrana cellulare di riferimento con una pipetta di patch-clamp aperto. Oltre a sottolineare l'importanza di un'agarosi ponte di KCl, questo metodo fornisce anche un modo per rappresentare l'effetto di strato unstirred interpretandone fluido flusso/taglio forza controllo dei canali ionici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma Pioneer Research Center (2011-0027921), di base scienza ricerca programmi (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795 NRF) attraverso la National Foundation ricerca di Corea finanziato dal Ministero della scienza, ICT & Pianificazione del futuro e da una sovvenzione del Corea Health Technology R & D Project attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
