Summary
يستخدم التصوير البهوي البثري غير المقيد لقياس نمط التنفس في الفئران المستيقظة. نظهر أن 15 شريحة s في إطار بروتوكول موحد تعرض قيمًا مماثلة لفترة طويلة من التنفس الهادئ. تسمح هذه المنهجية أيضًا بالقياس الكمي لانقطاع النفس والأنفاس المعززة خلال الساعة الأولى في الغرفة.
Abstract
التصوير البهوي البُقيّمي غير المقيّد (UBP) هو طريقة لقياس نمط التنفس لدى الفئران، حيث يتم الإبلاغ بشكل روتيني عن تواتر التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن جمع المعلومات المتعلقة بالناتج العصبي للتنفس، بما في ذلك وجود انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. أحد الاعتبارات الهامة لUBP هو الحصول على شريحة التنفس مع الحد الأدنى من تأثير السلوكيات القلقة أو النشطة ، لتوضيح الاستجابة لتحديات التنفس. هنا، نقدم بروتوكول يسمح بالحصول على خطوط أساس قصيرة وهادئة في الفئران القديمة، مقارنة بالانتظار لنوبات أطول من التنفس الهادئ. استخدام شرائح زمنية أقصر أمر قيم ، حيث أن بعض سلالات الفئران قد تكون متحمسة أو قلقة بشكل متزايد ، وقد لا يتم تحقيق فترات أطول من التنفس الهادئ في غضون إطار زمني معقول. وضعنا فئرانعمرها 22 شهرًا في غرفة UBP وقارننا أربعة أجزاء تنفس هادئة من 15 ثانية بين دقائق 60-120 بفترة تنفس هادئة أطول مدتها 10 دقائق استغرقت 2-3 ساعات للحصول عليها. كما حصلنا على عدد من انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة قبل أجزاء التنفس الهادئة ، بعد فترة تعريف 30 دقيقة. نظهر أن 10 دقيقة من التنفس الهادئ مماثلة لاستخدام أقصر بكثير 15 سنة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الوقت المؤدي إلى هذه الأجزاء التنفس 15 s هادئة لجمع البيانات المتعلقة انقطاع النفس من المنشأ المركزي. يسمح هذا البروتوكول للمحققين بجمع بيانات نمط التنفس في فترة زمنية محددة ويجعل تدابير خط الأساس الهادئة ممكنة للفئران التي قد تظهر كميات متزايدة من السلوك المنفعل. توفر منهجية UBP نفسها طريقة مفيدة وغير باضعة لجمع بيانات نمط التنفس وتسمح باختبار الفئران عبر عدة نقاط زمنية.
Introduction
UBP هو تقنية شائعة لتقييم أنماط التنفس1،2،3،4. في هذه الطريقة ، يتم وضع الفئران في غرفة مغلقة حيث اختلافات الضغط بين الغرفة الرئيسية (حيث يتم إيواء الحيوان) وغرفة مرجعية يتم تصفيتها من خلال pneumotachograph للحصول على القيم. إعداد UBP الناتج غير جراحي وغير مقيد ويسمح بتقييم التدابير التنفسية دون الحاجة إلى التخدير أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية مناسبة للدراسات التي تتطلب قياسات متعددة في نفس الماوس مع مرور الوقت. يمكن قياس المتغيرات مثل تردد التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة باستخدام هذه الطريقة، أثناء تجربة واحدة أو عبر عدة تجارب. كما يوفر برنامج برمودا المتحد في الجسم كله مقاييس لذروة التدفقات ومدة الدورة التنفسية. معا، هذه المعلمات تحديد نمط التنفس. كما أن آثار التنفس المسجلة تجعل من الممكن استعراض البيانات وحساب عدد انقطاع النفس المركزي المعروض في غضون فترة زمنية معينة. يمكن استخدام هذا العد جنبا إلى جنب مع تحليل حجم المد والجزر وأوقات ملهمة لقياس التغيرات الأخرى في نمط التنفس.
في حين أن العديد من تقنيات التصوير بالجنب غير الغازية موجودة للتقييم المباشر للمعلمات الفسيولوجية الرئوية ، فإن UBP كامل الجسم يسمح بوسيلة لفحص وظيفة الجهاز التنفسي مع الحد الأدنى من الإجهاد غير المبرر للفأر. ويعتمد التصوير بالجنب، الذي يستخدم مقاييس تدفق المد والجزر المتوسطة المنهية وغير الباضعة أيضاً، على ضبط النفس، مثل العديد من الأنواع الأخرى من التصوير بالبليسيوم (على سبيل المثال، التصوير بالحجرة المزدوجة). في حين تم استخدام هذه الأساليب في نماذج القوارض لقياس استجابة مجرى الهواء5، فإن استخدام أطواق الرقبة أو أنابيب ضبط النفس الصغيرة قد يستغرق الفئران (مقابل الأنواع الأخرى) لفترة أطول للتأقلم مع التنفس وإعادته إلى مستويات الراحة.
يعد الحصول على الجزء الأمثل من تنفس الهواء اعتبارًا مهمًا للمقارنات الأساسية. زيادة استخدام نظم التصوير بالبليسيوم المتاحة تجاريا يجعل جمع بيانات نمط التنفس ممكن في العديد من المختبرات. الأهم من ذلك ، نمط التنفس متغير طوال فترة الجمع ، وخاصة بالنسبة للفئران. ومع ذلك، من الضروري توحيد التحليل الأساسي كوسيلة لضمان ألا يؤدي مستوى تدريب المجربين إلى إرباك النتائج. هناك العديد من الطرق لجمع جزء تنفس الهواء، بمثابة منطقة واحدة من الاختلاف بين التصاميم التجريبية. ومن الأمثلة على ذلك متوسط البيانات النهائية التي تتراوح بين 10 و30 دقيقة بعد مجموعة زمنية محددة مسبقًا داخل الغرفة1، في حين تتضمن طريقة أخرى الانتظار حتى يكون الماوس هادئًا بشكل واضح لمدة 5-10 دقيقة6. يمكن أن يستغرق هذا الأخير 2-3 ساعة لتحقيق وفي بعض الحالات ، قد تحتاج إلى التخلي عن المحاكمة إذا لم يكن الماوس هادئًا لفترة كافية. هذا القلق هو اعتبار مهم بشكل خاص لسلالات الفئران حيث السلوكيات الملاحظة هي أكثر قلقا ومثيرة7. قد تستغرق هذه الفئران وقتًا أطول للتكيف مع بيئة الغرفة وتظل هادئة فقط لرشقات نارية قصيرة من الوقت. يحد من الوقت المخصص لجمع خط الأساس يوحد وقت الغرفة لكل فأرة.
من الأهمية بمكان أن يحصل المجرّبون على خط أساس مناسب يشمل قيم سلوك الراحة في الماوس ولكن يحدث أيضًا في الوقت المناسب. وبالتالي ، فإن الهدف من هذا التقرير هو تقديم وصف للطرق المستخدمة للحصول على قيم خط الأساس الهادئة القصيرة لمعلمات التنفس في الفئران. وعلاوة على ذلك، فإننا نبلغ بأن انقطاع النفس والأنفاس المعززة يمكن قياسها كميا خلال الساعة الأولى في القاعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية لكلية لو موين على جميع الإجراءات. وكان جميع استخدام الحيوانات بالاتفاق مع السياسات المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية8.
ملاحظة: (حرجة) قبل التجريب، والحصول على جميع الموافقات اللازمة والتدريب اللازم ة للاستخدام الحيواني. من المهم أن يتم التعرف على التجارب مع سلوكيات الماوس ومستويات النشاط ، بما في ذلك علامات النوم والضيق و / أو حركة القطع الأثرية مقابل الشم العادي والتنفس.
1. كامل الجسم البارومتر ية غرفة التصوير البليسيوم
- قراءة أدلة المستخدم المناسبة لغرفة التصوير الجنبي البارومترية، بما في ذلك الموصلات، حلقات O، وما إلى ذلك، وإنشاء ملف بروتوكول قياسي لتحديد محللات (مثل الأيض) والمعلمات الخاصة بالبرنامج.
- تأكد من توصيل جميع الخراطيم والأنابيب بالغرفة. قم بتوصيل أنبوب تدفق الغاز (التدفق) وأنبوب فراغ (تدفق التدريجي) مباشرة إلى غرفة التصوير البُنى البارومتري.
ملاحظة: يجب إرفاق التدفق الداخلي بتدفق التحيزالمميز لفتح. - إرفاق CO2،O2،وN2 خزانات الغاز إلى خلاط الغاز. تأكد من أن جميع خزانات الغاز في وضع مفتوح قبل التجريب.
2- معايرة غرفة البريثيسموغراف البارومترية
- معايرة تدفق عالية ومنخفضة من الغاز عن طريق تحديد الإعداد 7700 مكبر للصوت تحت علامة التبويب الأجهزة من برنامج التصوير بالجنب ة البارومترية.
- تعيين فراغ (تدفق من الغرفة) مناسبة للتصميم التجريبي ومحللات الغاز (~ 0.1 لتر / دقيقة).
ملاحظة: يجب أن يظل معدل التدفق إلى الخارج كما هو طوال المعايرة والتجربة للحصول على تسجيلات استقلابية دقيقة. - تعيين تدفق منخفض من الهواء عن طريق إزالة أنبوب تدفق من الغرفة وإيقاف الفراغ.
- تسجيل التدفق صفر بإدخال 0 في خلية وحدة منخفضة للغرفة المقابلة. انقر نقرا مزدوجا على خلية كال منخفضة، وتغيير الوقت إلى 3 s، وضرب قياس.
- إعادة ربط أنبوب تدفق والسماح للغاز (20.93٪ O2، متوازنة N2)لتدفق من خلال غرفة الجنبية البارومترية من خلاط الغاز.
- تحويل التدفق من لتر / دقائق إلى ملليلتر / ثانية. انقر فوق خلية الوحدة العليا للغرفة المقابلة وأدخل القيمة بالملليلتر/الثانية. انقر نقرا مزدوجا عالية كال،وتغيير الوقت إلى 3 s، وانقر فوق قياس.
- اترك علامة التبويب إعداد 7700-Amplifier مفتوحة لمعايرة محللات التمثيل الغذائي إلى برنامج التصوير البُعد يُعد بمقياس الجنب.
3. معايرة محلل التمثيل الغذائي
- في برنامج خلاط الغاز، تعيين خلاط الغاز لإطلاق تدفق الغاز الذي يحتوي على 20.93٪ O2 و 79.07٪ N2.
- على محللات التمثيل الغذائي، تعيين مستوى معايرة O2 إلى 20.93٪ وCO2 لقراءة 0٪. أعد الاتصال الهاتفي إلى نموذج بمجرد إدخال القيم المناسبة.
- تعيين نسبة O2 عالية. انقر على علامة التبويب ABCD-4 من برنامج التصوير بالجنب ة البارومترية ثم أدخل 20.93 تحت الوحدة العالية لخط C2. تحت كال عالية،وتغيير الوقت إلى 3 s وضرب التدبير.
- تعيينالنسبة المئوية المنخفضة لثاني أكسيد الكربون. أدخل 0 تحت كال منخفض من خط C3، ثم قم بتغيير الوقت إلى 3 s وانقر فوق قياس تحت كال منخفض.
- في برنامج خلاط الغاز، قم بتغيير قيمة O2 إلى 10% وقيمة ثاني أكسيد الكربونإلى 5%. انتظر عدة دقائق حتى يتكيف تدفق الغاز مع هذه القيم. على محللات التمثيل الغذائي، بدوره مقابض التكيف لمعايرة CO2 يساوي 5٪. تأكد من إعادة تشغيل الطلب إلى العينة بمجرد معايرة القيم.
- تعيينالنسبة المئوية العالية لثاني أكسيد الكربون. تأكد من استقرار قراءات المحلل قبل إدراج القيم المناسبة في O2 و CO2 على برنامج التصوير بالجنبة البارومترية. انقر فوق الوحدة العالية تحت C3 وأدخل 5. تغيير كال عالية إلى 3 s وضرب التدبير.
- تعيين النسبة المئوية المنخفضة O2. انقر فوق وحدة منخفضة تحت الخيار C2 وأدخل 10. انقر فوق كال منخفض،إدخال 3 ق، وانقر فوق قياس.
- تغيير قيم الغاز على خلاط الغاز مرة أخرى إلى 20.93٪ O2 و 79.07٪ N2. انتظر عدة دقائق حتى تتكيف الغرفة مع هذه القيم. كرر الخطوات 3.1\u20123.7 إذا لم تقرأ محللات التمثيل الغذائي تلقائيًا 20.93٪ O2 و 0% CO2، لضمان المعايرة المناسبة. تأكيد المعايرة المناسبة بشكل روتيني مع خزانات الغاز المعتمدة.
- إعادة فحص متر التدفق المتصلة بغرفة التصوير البُطفيب البارومتري. ضبط تدفق الهواء من وإلى الغرفة إلى معدلات مناسبة للتجربة (عادة، 0.1-0.3 لتر / دقيقة).
- بمجرد تطبيق جميع الإعدادات على برنامج التصوير بالبُنى البُنى البارومتري، انقر فوق موافق لبدء التسجيل.
4- التصوير البُقيّم البُرّيّ غير المقيّد
- تسجيل وزن الماوس ودرجة حرارة الجسم الأولية. انتظر 10 دقيقة قبل وضع الماوس في الغرفة، لجمع بيانات O2 و CO2 من غرفة فارغة. العمل في منطقة هادئة مألوفة للفئران حتى الضوضاء والروائح لا تتداخل مع جمع البيانات. تجنب أي أعطال محتملة، بما في ذلك فتح وإغلاق الأبواب أو الموظفين الذين ينتقلون إلى غرفة جمع البيانات أو خارجها.
ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول المحدد 22 شهرا من العمر ذكر C57BL/6J الماوس. - خلال الساعة الأولى، قم بتوثيق سلوكيات الماوس وتدوين ملاحظات مفصلة، بما في ذلك قيم محددة للتدفق في/خارج الغرفة.
- بعد 60 دقيقة من اعتياد الغرفة، ومشاهدة لشرائح من التنفس الهادئ لل60 دقيقة التالية. قائمة أي شرائح. تستمر ما لا يقل عن 15 سنة في الطول دون شم والاستمالة. اتخاذ تدابير درجة حرارة الجسم كل 10 دقيقة عند استخدام جهاز قابل للزرع.
- في نهاية التجربة، قم بإزالة الماوس من الغرفة ووضعه مرة أخرى في قفصه. وينبغي تنظيف جميع المعدات ومسحها تماما. إذا بقيت قطرات الماء، فاستخدم الهواء المضغوط لإزالتها.
5. تحليل نمط التنفس والتمثيل الغذائي
- افتح ملف مراجعة البُثومتر البُنى وراجع الملاحظات المسجلة للرفقب الذي يهم.
- فتح لوحة التمثيل الغذائي في البرنامج واتخاذ متوسط أول 10 دقيقة من O2 و CO2، عندما كانت الغرفة فارغة. سجل هذه القيم كـ FiO2 و FiCO2.
- عرض لوحة التدفق لبرنامج التصوير البُنى البارومتري. انقر بزر الماوس الأيمن تحليل السمات وتعيين المعلمات المناسبة. تحت علامة التبويب ميتا 1، أدخل FiO2 و FiCO2 من الخطوة 5.2، فضلا عن تدفق إلى الغرفة تحت ميتا 2،لحساب VO2 و VCO2.
- لنمط من تحليل التنفس، تأكد من الأوقات لمدة 15 ثانية من التنفس الهادئ باستخدام ملاحظات حول سلوك الحيوان، فضلا عن تتبع لوحة التدفق. أدخل الأوقات لفترات 15 s من التنفس الهادئ تحت حوار محلل البيانات المفتوح من علامة التبويب محلل البيانات. انقر فوق وضع عرض بارزر لإظهار شرائح 15 s المحددة ذات الاهتمام فقط.
- انقر فوق حفظ البيانات المشتقة المنقّبة. افتح ملف البيانات في جدول بيانات للحصول على البيانات المنقّبة.
6. تحليل ابينياس والأنفاس المعززة
- في ملف المراجعة المفتوحة، إنهاء وضع عرض محلل. انتقل إلى خيار إعداد الرسم البياني ضمن الإعداد > إعداد P3 وحدد عرض الصفحة تحت النوع. حدد 5 لعدد الأجزاء. أدخل -2 في المربع المسمى منخفض و 2 في المربع المسمى عالية لتدابير التدفق في ملليلتر / الثانية. تطبيق التغييرات.
- انتقل إلى علامة 30 دقيقة على لوحة تتبع التدفق.
- عد انقطاع النفس والأنفاس المعززة لمدة 30-60 دقيقة بعد وضع الماوس في الغرفة. تحديد فترات التنفس المعلق ة التي تدوم لفترة أطول من أو تساوي 0.5 سنة، مما يدل على انقطاع النفس. ويشار إلى الأنفاس المعززة من خلال ارتفاع حاد في تتبع التنفس فوق 1.25 مل / سنة يليه انخفاض حاد أقل من -0.75 مل / سنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الإبلاغ عن نتائج UBP كتقييم لنمط التنفس في 16 فأرًا يبلغ عمره ما يبلغ من العمر 22 شهرًا ويتم إجراؤها تحت غاز الهواء العادي (20.93٪ O2 مع N2متوازنًا). تضمن التحليل أولاً مقارنة شريحة التنفس الهادئ ة الأطول بـ 10 دقائق (والتي استغرق الحصول عليها أكثر من 2 ساعة) مقابل متوسط أربعة أجزاء قصيرة من 15 s (تم قياسها كمياً في غضون دقائق 60-120). يتم توفير تتبع تدفق تمثيلي للتنفس الهادئ ، حيث يكون التنفس متسقًا مع عدم وجود سلوكيات تنفس نشطة ، في الشكل 1A. عندما يتم جمع تتبع مماثلة من الحيوانات، 100٪ من الأنفاس يجب أن تكون مقبولة من قبل البرنامج. ومع ذلك ، يمثل الشكل 1B التنفس من شريحة أكثر نشاطًا ، حيث تستكشف الفئران الغرفة ، واستنشاقها ، و / أو الاستمالة. التتبع مماثلة لتلك المبينة في الشكل 1باء هي أقل احتمالا أن تكون مقبولة من قبل البرنامج وليست مثالية لنوع جمع التنفس المستخدمة وشرحه من قبل هذه المنهجية. وكانت البارامترات المختارة لتقييم الاختلافات المحتملة في نمط التنفس بين النقطتين الزمنيتين هي تردد التنفس(الشكل 2ألف)،وحجم المد والجزر (VT، الشكل 2B)،التهوية الدقيقة (VE، الشكل 2C)،نسبة حجم المد والجزر/الملهمة (VT/Ti، الشكل 2D)،ونسبة التهوية/ثاني أكسيد الكربون المطرودة (VE/VCO2/g، الشكل 2E)،والتي تم حسابها جميعها باستخدام برنامج التصوير بالبُطي ومعادلة دروبو وفين. القيم المبلغ عنها لهذه التدابير هي ضمن نطاق ما أبلغنا عنه سابقا لنموذج الماوس6،9. ولم يتم توضيح أي اختلافات كبيرة بين المجموعات؛ تم حساب التصحيحات المحددة للمقارنات المتعددة لتردد التنفس وبيانات VT مع Bonferroni(p < 0.025 تعتبر كبيرة). وتبين هذه النتائج أن استخدام بروتوكول مبسط باستخدام خطوط الأساس 15 s يوفر نتائج مماثلة لنتائج بروتوكول خط الأساس الأطول.
تم إجراء مزيد من التحليل مع كل من أربعة قطاعات خط الأساس 15 s للتردد، VT، VE، VT / Ti، وVE/VCO2/g(الشكل 3). لم يتم العثور على اختلافات كبيرة(p > 0.05) بين أي من النقاط الزمنية. كما لم تكن هناك فروق في التباين بين أي من الأجزاء الزمنية الأربعة لأي مقياس لنمط التنفس. بالإضافة إلى ذلك، اختبرنا تباين الجزء من مجموعة 15 s مقابل مجموعة 10 دقيقة ولم نجد اختلافات كبيرة باستخدام اختبار ليفين عند مقارنة بيانات المجموعة المتوسطة.
يتم عرض عدد انقطاع النفس والأنفاس المعززة التي لوحظت لكل الحيوان خلال دقائق 30-60 من بروتوكول UBP في الشكل 4. تظهر هذه النتائج أن الحيوانات المسنة تعرض عددًا كبيرًا من انقطاع النفس ووجود أنفاس معززة في غضون 30 دقيقة (التتبع المبين في الشكل 1C). وتشير البيانات إلى التغيرات التي حدثت أثناء عملية الشيخوخة، حيث لوحظت هذه النتائج في الفئران التي يبلغ عمرها 22 شهراً. لتأكيد موثوقية interrater لتحليلات انقطاع النفس وزيادة التنفس ، تم حساب ارتباط Pearson لمحققين مختلفين. تم العثور على درجة عالية من الاتفاق بين معدل، كما هو مبين من قيمة r =.99 لانقطاع النفس وص =.86 للأنفاس المعززة. في الدراسات المستقبلية، فإن زيادة عدد انقطاع النفس مقارنة بمجموعة التحكم سوف تكون بمثابة قول عن خلل في التنفس نابع من مكون عصبي.
الشكل 1: تتبع التدفق التمثيلي. (أ)تتبع التدفق من خط أساس هادئ ، حيث لا يعرض الماوس أي سلوكيات نشطة مثل الشم أو الاستمالة. (ب)تتبع التدفق من فترة التنفس النشطة غير المدرجة في تحليلاتنا، حيث تتحرك الفئران حول الغرفة والعديد من الأنفاس لا يتم قبولها بشكل روتيني. (C)تتبع التدفق عرض التنفس المعزز تليها فترة انقطاع النفس. يتم عرض نافذة 5 s لجميع الآثار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معلمات التنفس متشابهة لأجزاء التنفس الهادئة من 10 دقيقة و 15 سنة في الفئران البالغة من العمر 22 شهرًا. تم استخدام التصوير البُمتري البُنى لجمع بيانات التنفس في الفئران المسنّة(ن = 16، 22 شهرًا). تم حساب بيانات التنفس للفئران خلال نقطتين زمنيتين مختلفتين، وهما متوسط فترات الهدوء الأربعة 15 ق داخل علامة 60-120 دقيقة للفأر ة يجري في الغرفة ولمدة 10 دقيقة من التنفس الهادئ المستمر. (أ)تردد التنفس (التنفس / الدقيقة). (ب)حجم المد والجزر (VT؛ ملليلتر / التنفس). (C)التهوية دقيقة (VE; ملليلتر / دقيقة). (D)نسبة حجم المد والجزر إلى وقت الإلهام (VT/ Ti; ملليلتر/ثانية). (E)نسبة التهوية الدقيقة إلى ثاني أكسيد الكربون المطرود، وتطبيعها إلى الوزن (VE/VCO2/g). لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات بعد التصحيحات بعد انتهاء المخصصة(p > 0.025). اعتبرت قيم > 3 SD فوق المتوسط القيم المتطرفة وإزالتها من مجموعة البيانات. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين أربع فترات 15 s. تم حساب بيانات التنفس في فئران التنفس الهادئة(n = 16، 22 شهرًا) لأربعة فواصل منفصلة 15 ق داخل 60-120 دقيقة من موضع الغرفة. (أ)تردد التنفس (التنفس / الدقيقة). (ب)حجم المد والجزر (VT؛ ملليلتر / التنفس). (C)التهوية دقيقة (VE; ملليلتر / دقيقة). (D)نسبة حجم المد والجزر إلى وقت الإلهام (VT/ Ti; ملليلتر/ثانية). (E)نسبة التهوية الدقيقة إلى ثاني أكسيد الكربون المطرود، وتطبيعها إلى الوزن (VE/VCO2/g). لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين الشرائح الزمنية(p > 0.05). يتم تعريف القيم المتطرفة على أنها > 3 SD فوق المتوسط وإزالتها. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Apnea والتنفس المعزز التهم في الفئران. تم احتساب اكنا (≥ 0.5 ق دون تنفس) والأنفاس المعززة (ABs؛ زيادة حادة في الاستنشاق أكثر من 1.25 مل /ث تليها زفير حاد أقل من -0.75 مل /ث) في الفئران القديمة(ن = 16، 22 شهرا من العمر) بين 30-60 دقيقة. تم تحليل الأعداد على مدى 30 دقيقة ويتم الإبلاغ عن الإجمالي لتلك الفترة الزمنية. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التخطيطي لإعداد التصوير البهومتري غير المقيد (UBP). يجب أن يكون إعداد UBP الإجمالي مشابهًا للإعداد الموصوف في الشكل. يجب قياس قياسات التدفق للغازات الداخلة والمغادرة من الغرفة، ويجب أن يكون تكوين الغاز معروفًا بتفسير البيانات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر البروتوكول معلومات حول خط أساس التنفس الهادئ في الفئران ، بالإضافة إلى جمع البيانات حول انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. تظهر النتائج التمثيلية أن خط الأساس الهادئ لمدة 10 دقيقة يحتوي على نمط مماثل من التنفس بالمقارنة مع متوسط أربع نوبات 15 s لفوج من الفئران القديمة. الأهم من ذلك، فإن نوبات 15 ق ليست مختلفة إحصائيا، ولا هذه المجموعات لديها اختلافات في الاختلاف من بعضها البعض باستخدام اختبار ليفين. وتبين هذه البيانات أنه حتى نوبة واحدة قصيرة كافية لرصد التنفس الهادئ. ومع ذلك ، فمن الممكن تماما أن تحليل الاختلاف الفردي داخل الماوس في 15 s مقابل 10 دقيقة قد يؤدي إلى نتائج مختلفة ، كما يمكن أن تشمل نوبة 10 دقيقة الحد الأدنى من أنشطة الشم والاستمالة. ومع ذلك، باستخدام اختبار Levene لمقارنة شرائح خط الأساس الماوس الفردية يوفر تحليل مختلف عن واحد وصفها في هذا البروتوكول. بشكل عام ، يستخدم تصميم هذه المنهجية 15 شريحة تنفس يمكن الحصول عليها خلال دقائق 60-120 في الغرفة ، مقابل الانتظار حتى يحقق كل فأر فترات أطول من خط الأساس الهادئ.
تسمح المدة الأقصر المطلوبة لخط الأساس باختبار سلالات الفئران الأكثر قلقًا / هياجًا للتنفس الهادئ. يؤدي استخدام جزء التنفس الأطول (أي 10 أو 2 دقيقة) إلى إطالة مدة البروتوكول ، إلى درجة قد تحتاج فيها التجربة إلى التخلي عنها إذا لم تعرض الفئران تتبع تنفس هادئ في غضون 3 ساعات. وبما أن العديد من التصاميم التجريبية تتضمن أيضاً تحديات تنفسية (أي نقص الأكسجة)، فإن الوقت الممتد المخصص للغازات الأخرى يسلط الضوء على الحاجة إلى توحيد وقت جمع خط الأساس. استخدام نوبة واحدة من 15 ق من التنفس الهادئ يساعد على تخفيف القلق من العمل مع الفئران (وسلالات الفئران) التي قد تكون منفعلة بشكل خاص في الغرفة. أثناء العمل مع التصوير البُجري البُمتري، وجدنا أن ~ 10٪ من الفئران لكل دراسة كان لا بد من استبعادها بسبب عدم قدرتها على أداء أقل من 2 دقيقة من التنفس الهادئ المستمر داخل الغرفة. فشل تنفيذ تجارب التعرّف السابقة في حمل الفئران على الهدوء بشكل أسرع عند وضعها في الغرفة في يوم التجريب. ومع ذلك ، لأن سلالات مختلفة ، والجنسين ، وأعمار الفئران قد تتفاعل جميعها بشكل مختلف مع بيئة الغرفة10،11، فمن الممكن أن تقنيات التعود قد تكون مفيدة12،13 لبعض الأفواج. تألفت تجاربنا على التعرّف على الفئران في غرفة UBP في غرفة الاختبار لمدة 1-2 ساعة لعدة أيام قبل التجريب. في حين لاحظنا أي تغييرات في سلوك الحيوان بعد هذا الإجراء ، فقد أظهرت دراسة سابقة أن هناك حاجة إلى 24 ساعة من التعود للقضاء على آثار الجدة مما أدى إلى النشاط البدني التلقائي في الفئران12. بالإضافة إلى ذلك، وجد كبير وآخرون أن وضع اسطوانات بلاستيكية مماثلة في الحجم لغرفة التصوير البُطفي في القفص المنزلي كان مفيدًا في حمل الجرذان على التعرف على الإعدادات قبل التجريب13.
هذا البروتوكول يكشف أيضا خلل محتمل في الجهاز التنفسي في الفئران عن طريق القياس الكمي لانقطاع النفس المركزي، مما يدل على قضايا السيطرة العصبية. وأظهرت ثلاثون دقيقة من الملاحظة قبل مجموعة نمط التنفس الأساسية أن جميع الفئران الـ 16 التي تبلغ من العمر 16 عاماً عرضت عدداً كبيراً من نوبات انقطاع النفس والأنفاس المعززة (ممثلة في الشكل 1جيم). انقطاع النفس العديدة في هذه الفوج الماوس الذين تتراوح أعمارهم بين تسليط الضوء على قدرة هذا البروتوكول لقياس آخر قياس التنفس الهامة دون إضافة وقت إضافي للتجريب. تجدر الإشارة إلى أن التقدم في السن والمرض (إن وجد) يمكن أن يؤثر على وجود وعدد نوبات انقطاع النفس.
من أجل توصيف التنفس الهادئ ، من المهم مراقبة غرفة التصوير البسمة البسمة البارومترية والفأرة باستمرار طوال مدة البروتوكول. للقياس الكمي للتنفس الهادئ ، يجب أن تكون الفئران مستيقظة ولكن لا تشارك في أي سلوكيات نشطة مثل الشم أو الاستمالة أو الاستكشاف (ممثلة في الشكل 1A). منذ أنماط التنفس أثناء النوم يمكن أن تختلف عن تلك الموجودة في الحيوان مستيقظا14,15, جمع التنفس الهادئ خلال الحالة مستيقظا أمر بالغ الأهمية. من الممكن أن تتضمن أجزاء أطول من التنفس الهادئ فترات من النوم ، والتي قد لا تكون مرغوبة اعتمادًا على التصميم التجريبي. في هذه الحالة، تكون أجزاء أقصر من التنفس الهادئ مثالية لتوثيق، حيث يتم تقليل احتمال جمع البيانات أثناء النوم عندما تحيط الشرائح النشطة بشرائح التنفس الهادئة القصيرة (15 ق). لقد لاحظنا أن أجزاء أطول من التنفس الهادئ يمكن أن يكون تحديا للحصول على في نموذج الماوس، كما سلوك الماوس في الغرفة يبدو أن تكون مختلفة جدا بالمقارنة مع الفئران. من المهم على حد سواء لمراقبة الحرجة تدفق التنفس الماوس لشرائح التنفس المناسبة وتوثيق سلوك الحيوان. في حالات انخفاض التهوية أو التنفس غير المستقر ، لا يزال من الممكن استخدام هذه الطريقة. في هذه الحالات ، من الضروري أن يكون المجرب أعمى للفوج عند اختيار شرائح 15 s. يجب أن يميز البرنامج الأنفاس ، مع معدل قبول 100٪ خلال فترة 15 s. ننصح بأخذ ملاحظة عن عمليات تتبع التنفس بالإضافة إلى ضمان استيفاء الحيوانات للمعايير السلوكية لخط الأساس لأنه من الممكن أن الفئران الثابتة قد تكون لا تزال قلقة. أفادت دراسة سابقة أنه على الرغم من أن الفئران أظهرت سلوكًا هادئًا ، إلا أنها لا تزال تظهر أنماط تنفس متغيرة (أي زيادة التردد) استجابة للمحفزات الخاضعة للرقابة داخل غرفة الاختبار13.
مقاييس التردد، VT، VE، inspiratory ووقت الانقضاء، وVE/VCO2 يتم قياسها كميا باستخدام أجهزة تحليل وبرنامج UBP وغالبا ما يتم الإبلاغ عنها في الأدبيات. على وجه الخصوص، تستخدم حسابات VT و VE معادلة Drorbaugh و Fenn16، والتي تتطلب قيمًا معروفة لدرجة حرارة الجسم ودرجة حرارة الغرفة المحيطة والرطوبة والضغط البارومتري. من المستحسن جمع هذه التدابير طوال التجربة لقيم VT و VE الأكثر دقة. يجب استخدام المتغيرات الأخرى التي يتم حسابها بواسطة النظام بحذر. UBP ليس مقياسا مباشرا للميكانيكا الرئوية; وبالتالي، يجب تفسير المتغيرات المتعلقة بمقاومة مجرى الهواء (على سبيل المثال، وقفة محسنة [بنه]) مع وضع هذا التحذير في الاعتبار5. تتضمن المكونات الإضافية لإعداد UBP التي يمكن أن تؤثر على المتغيرات التي يحسبها البرنامج معدلات التدفق والمعايرة العامة للنظام. تأكيد الأختام والحشايا تعمل بشكل صحيح (لا تسرب) وضمان الاتصال السليم لجميع المعدات إلى غرفة التصوير بالجنبية البارومترية(الشكل 5). وينبغي أن تظل معدلات التدفق الداخلة والخروج من القاعة متسقة. يمكن أن تختلف معدلات التدفق المطلوبة بين إعدادات UBP، لذلك من المهم التحقق من هذه القيم قبل التجريب. وينبغي أن يكون معدل التدفق إلى الغرفة كافيا لتوفير تحديات الهواء النقي أو الغاز في الوقت المناسب. وينبغي أن يكون معدل التدفق كافياً أيضاً للسماح للمحللات الأيضية بقياس O2 وCO2 دون تراكم ثاني أكسيد الكربونفي بيئة الغرفة، مما يشكل خطر تغير نمط التنفس. وبالمثل، يلزم تنفيذ معايرات خلاط/محلل الغاز بانتظام لضمان قياس المعلمات الأيضية بدقة.
وتشمل الاعتبارات الأخرى لUBP واعية الحد من الانحرافات داخل الغرفة التجريبية في حين يجري اختبار الحيوانات. الضوضاء الصاخبة ، والروائح المختلفة ، ووجود الموظفين غير الضروريين في الغرفة يمكن أن تضيف إلى السلوكيات القلقة التي تظهرها الفئران. قد يساعد استخدام غرف أصغر كمناطق اختبار ، ولكن إذا لم يكن ذلك ممكنًا ، يمكن إعداد جدران من الورق المقوى (مع نافذة عرض صغيرة) المحيطة بالغرفة لتقليل الانحرافات للفئران. يجب الحفاظ على النشاط الكهربائي داخل الغرفة عند الحد الأدنى لمنع الضوضاء الإضافية داخل تتبع البُثوغرافيا البُرَجية. لذلك ، من المهم أن تأخذ علما بتتبع التدفق خلال فترة 10 دقيقة عندما يقوم البرنامج بجمع البيانات من غرفة فارغة. وينبغي أن تظل هذه التعقبات مسطحة، وأي انقطاع أو موجات طفيفة هي علامات على الضوضاء وينبغي معالجتها. يمكن أن تؤدي تغيرات الضغط من فتح وإغلاق الأبواب أو من أداء التكييف إلى زيادة التقلبات الخاطئة، كما أن ضمان حدوث هذه الإجراءات في الحد الأدنى (والإشارة إليها عند حدوثها) أمر بالغ الأهمية. الرطوبة يمكن أن تؤثر أيضا على حجم المد والجزر محسوبة والتهوية الدقيقة، مما يجعل من المهم جدا للتأكد من أن يتم تجفيف الغرفة وأنابيب الاتصال قبل الاستخدام. إذا لزم الأمر ، فإن استخدام حبات Drierite في التسلسل مع أنابيب التدفق في يمكن أن تساعد في إزالة جميع التكثيف في الهواء قبل مدخل الغرفة. سيتم إنشاء هذه الخطوة في الحالات التي تكون فيها الرطوبة أعلى بشكل روتيني من المستويات المدرجة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات8 (30٪-70٪، من الناحية المثالية ضمن 10٪ من نقطة الإعداد). الرطوبة يمكن أيضا أن تتراكم في الغرفة بسبب وجود الحيوان. على الرغم من أن بعض الرطوبة أمر طبيعي ، إلا أنه قد يستمر في البناء إذا كان الحيوان نشطًا بشكل مفرط أو يوضع في الغرفة لفترات أطول. إذا وصلت مستويات الرطوبة إلى أقصى مستويات (99.99٪) ، فقد تحتاج الغرفة إلى فتحها ومسحها أثناء التجريب للحفاظ على مقاييس تنفس مماثلة. البرنامج يفسر التغيرات في الضغط البارومتري، ودرجة الحرارة المحيطة، ودرجة حرارة الحيوان، والرطوبة. أفضل الممارسات هي الحفاظ على القيم ضمن نطاق معقول بحيث يتم مقارنة "التفاح إلى التفاح" عبر الأعمار والسلالات والجنسين. وعلاوة على ذلك، فإن دورة circadian من الفئران والنطاق الزمني للاختبار، فضلا عن ظروف الإضاءة المحددة للغرفة، هي تفاصيل هامة للنظرفي 13،,17. على سبيل المثال ، نحن عادة اختبار الفئران في الإضاءة مماثلة لغرفة السكن (إما دورة الضوء أو الظلام) وضمن نطاق 3 ح18. وينبغي أيضا أن يظل المجرّبون عمياء عن مجموعات الحيوانات أثناء جمع البيانات وتحليلها لمنع الاختلافات في اختيار خط الأساس. يجب على نفس المجرب، عند الإمكان، جمع كافة البيانات و/أو تحليل جميع التعقبات في تجربة معينة. خطوات للحفاظ على التجارب أعمى لمجموعات الحيوانات، فضلا عن العشوائية والاختبار خلال أوقات مماثلة من اليوم، هي حاسمة لصرامة التحقيق. في نهاية المطاف ، هناك عوامل دخيلة قد تغير تتبع التدفق ، وينبغي النظر في هذه المخاوف عند تنفيذ UBP.
طريقة UBP هي تقنية تستخدم لتوصيف نمط التنفس في الفئران. يمكن جمع مقاييس خط الأساس في غضون 2 ساعة عند استخدام شريحة التنفس 15 s. هنا نبلغ عن طريقة يمكن إجراؤها مع الفئران المسنة ، التي غالبًا ما تكون أكثر هياجًا في الغرفة من الفئران الأصغر سناً ، مما يشير إلى أنه يمكن أيضًا اختبار سلالات الفئران القلقة أو النشطة الأخرى مع هذا البروتوكول. البيانات التي تم جمعها من UBP غير الغازية ويسمح للاختبار على مدى نقاط زمنية متعددة، وهو أمر مفيد للدراسات حول الشيخوخة، والعلاج بالعقاقير، وتطور المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفان أن يشكرا أنجيلا لو وسارة روبي وماريسا ميكي على عملهم في الحفاظ على مستعمرات الحيوانات. تم تمويل هذا العمل من قبل 1R15 HD076379 (L.R.D.) ، 3R15 HD076379 (L.R.D. لدعم CNR) ، وزمالة أبحاث ماكديفيت الجامعية في العلوم الطبيعية (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
