Summary
A pletimografia barométrica desenfreada é usada para quantificar o padrão de respiração em camundongos acordados. Mostramos que 15 segmentos s sob um protocolo padronizado exibem valores semelhantes a uma longa duração de respiração silenciosa. Essa metodologia também permite a quantificação de apnéia e respiração aumentada durante a primeira hora na câmara.
Abstract
A pletimografia barométrica desenfreada (UBP) é um método para quantificar o padrão de respiração em camundongos, onde a frequência respiratória, o volume das marés e a ventilação minuciosa são rotineiramente relatados. Além disso, informações podem ser coletadas sobre a saída neural da respiração, incluindo a existência de apnéias centrais e respirações aumentadas. Uma consideração importante para a UBP é a obtenção de um segmento respiratório com um impacto mínimo de comportamentos ansiosos ou ativos, para elucidar a resposta aos desafios respiratórios. Aqui, apresentamos um protocolo que permite que linhas de base curtas e silenciosas sejam obtidas em camundongos idosos, comparáveis à espera de crises mais longas de respiração tranquila. O uso de segmentos de tempo mais curtos é valioso, pois algumas cepas de ratos podem ser cada vez mais excitantes ou ansiosas, e períodos mais longos de respiração silenciosa podem não ser alcançados dentro de um prazo razoável. Colocamos ratos de 22 meses em uma câmara ubp e comparamos quatro segmentos de respiração tranquila de 15 s entre os minutos 60-120 para um período de respiração mais longo de 10 minutos que levou de 2 a 3 h para adquirir. Também obtivemos contagem de apnéias centrais e respirações aumentadas antes dos segmentos respiratórios silenciosos, após um período de familiarização de 30 min. Mostramos que 10 min de respiração silenciosa é comparável ao uso de uma duração muito menor de 15 s. Além disso, o tempo que leva a esses 15 segmentos de respiração silenciosa pode ser usado para coletar dados sobre apnéias de origem central. Este protocolo permite que os investigadores coletem dados de padrão de respiração em um período de tempo definido e torna viável medidas de linha de base silenciosas para ratos que podem exibir quantidades aumentadas de comportamento excitável. A própria metodologia da UBP fornece uma maneira útil e não invasiva de coletar dados de padrão de respiração e permite que os camundongos sejam testados ao longo de vários pontos de tempo.
Introduction
UBP é uma técnica comum para a avaliação de padrões respiratórios1,2,3,4. Neste método, os camundongos são colocados em uma câmara fechada onde as diferenças de pressão entre a câmara principal (onde o animal está alojado) e uma câmara de referência são filtradas através de um pneumotacógrafo para obter valores. A configuração resultante da UBP é não invasiva e desenfreada e permite que as medidas respiratórias sejam avaliadas sem a necessidade de anestesia ou cirurgia. Além disso, esta técnica é adequada para estudos que requerem múltiplas medidas no mesmo mouse ao longo do tempo. Variáveis como frequência respiratória, volume de maré e ventilação minuciosa podem ser quantificadas com este método, durante um único ensaio ou em vários ensaios. A UBP de corpo inteiro também fornece medidas de pico de fluxos e duração do ciclo respiratório. Juntos, esses parâmetros quantificam o padrão de respiração. Os traços respiratórios registrados também possibilitam a revisão dos dados e a contagem do número de apnéias centrais exibidas dentro de um determinado período de tempo. Esta contagem pode ser usada juntamente com uma análise do volume das marés e tempos inspiradores para medir outras alterações no padrão de respiração.
Embora existam várias técnicas de pletimografia não invasiva para a avaliação direta dos parâmetros fisiológicos pulmonares, a UBP de corpo inteiro permite uma maneira de testar a função respiratória com o mínimo de estresse indevido ao camundongo. A pletimismografia da cabeça, que utiliza medidas de fluxo midexpiratório de marés e também não invasiva, depende da contenção, como muitos outros tipos de plethysmografia (por exemplo, pletimismografia de câmara dupla). Embora esses métodos tenham sido usados em modelos de roedores para medir a capacidade de resposta das vias aéreas5, o uso de coleiras de pescoço ou pequenos tubos de contenção pode levar os camundongos (vs. outras espécies) mais tempo para se adaptar e retornar sua respiração a níveis de repouso.
A obtenção de um segmento de respiração de ar ideal é uma consideração importante para as comparações de linha de base. O aumento do uso de sistemas de plethysmografia comercialmente disponíveis torna possível a coleta de dados de padrão de respiração em muitos laboratórios. É importante ressaltar que o padrão de respiração é variável durante todo o período de coleta, particularmente para camundongos. Dito isso, é necessário padronizar a análise da linha de base como forma de garantir que o nível de treinamento dos experimentadores não confunda resultados. Existem inúmeras maneiras de coletar um segmento de respiração do ar, servindo como uma área de variação entre projetos experimentais. Um exemplo inclui a média dos 10-30 min finais de dados seguindo um conjunto de tempo previamente definido dentro da câmara1, enquanto outro método envolve esperar até que o mouse esteja visivelmente calmo por 5-10 min6. Este último pode levar de 2 a 3 h para conseguir e, em alguns casos, um julgamento pode precisar ser abandonado se o mouse não estiver calmo por tempo suficiente. Essa preocupação é uma consideração especialmente importante para cepas de camundongos onde os comportamentos observados são mais ansiosos e excitáveis7. Esses ratos podem demorar mais tempo para se adaptar ao ambiente da câmara e permanecer apenas calmos por curtos períodos de tempo. Limitar o tempo dedicado à coleta de linha de base padroniza o tempo de câmara para cada mouse.
É crucial que os experimentadores obtenham uma linha de base adequada que engloba valores de comportamento de repouso no camundongo, mas também ocorre em tempo hábil. Assim, o objetivo deste relatório é fornecer uma descrição dos métodos utilizados para obter valores de linha de base curtos e silenciosos para parâmetros respiratórios em camundongos. Além disso, relatamos que apneias e respirações aumentadas podem ser quantificadas durante a primeira hora na câmara.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso De Animais Institucionais do Le Moyne College. Todo o uso de animais estava de acordo com as políticas descritas no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório8.
NOTA: (Crítico) Antes da experimentação, obtenha todas as aprovações e treinamentonecessários necessários para o uso animal. É importante que os experimentadores estejam familiarizados com os comportamentos do rato e os níveis de atividade, incluindo sinais de sono, angústia e/ou artefato de movimento versus cheiro e respiração normais.
1. Câmara de Plethysmografia Barométrica de corpo inteiro
- Leia os manuais de usuário apropriados para a câmara de pletimografia barométrica, incluindo conectores, anéis O, etc., e crie um arquivo de protocolo padrão para definir analisadores (por exemplo, metabólicos) e parâmetros específicos para o software.
- Certifique-se de que todas as mangueiras e tubos estão conectados à câmara. Conecte um tubo de fluxo de gás (flow-in) e um tubo de vácuo (flow-out) diretamente à câmara de pletimografia barométrica.
NOTA: O fluxo de entrada deve ser anexado ao fluxo de viésmarcado de abertura . - Coloque os tanques de gás CO2,O2e N2 na batedeira de gás. Certifique-se de que todos os tanques de gás estão em posição aberta antes da experimentação.
2. Calibração da Câmara Depletilógrafo Barométrico
- Calibrar um alto e um baixo fluxo de gás selecionando a configuração do amplificador 7700 sob a guia Hardware do software de pletimografia barométrica.
- Defina um vácuo (fluxo para fora da câmara) apropriado para o projeto experimental e analisadores de gás (~0,1 L/min).
NOTA: A taxa de saída deve permanecer a mesma durante as calibrações e experimentos para gravações metabólicas precisas. - Defina um baixo fluxo de ar removendo o tubo de fluxo da câmara e desligando o vácuo.
- Registre o fluxo zero digitando um 0 na célula Unidade Baixa para a câmara correspondente. Clique duas vezes na célula Low Cal, altere o tempo para 3 s e aperte Measure.
- Reconecte o tubo de fluxo e permita que o gás (20,93% O2, equilibrado N2) flua através da câmara de pletimografia barométrica a partir do misturador de gás.
- Converta a entrada de litros/minutos em mililitros/segundo. Clique na célula Unidade Alta para a câmara correspondente e digite o valor em mililitros/segundo. Clique duas vezes em High Cal,altere a hora para 3 s e clique em Medir.
- Abra a guia configuração do 7700-Amplifier para calibrar os analisadores metabólicos para o software de pletimografia barométrica.
3. Calibração do analisador metabólico
- No programa de misturador de gás, defina o misturador de gás para liberar um fluxo de gás contendo 20,93% O2 e 79,07% N2.
- Nos analisadores metabólicos, defina o nível de calibração de O2 para 20,93% e o CO2 para ler 0%. Gire o mostrador de volta para Sample assim que os valores apropriados forem inseridos.
- Defina a alta porcentagem de O2. Clique na guia ABCD-4 do software de pletimografia barométrica e, em seguida, digite 20,93 em Unidade Alta da linha C2. Em High Cal,mude o tempo para 3 s e aperte Measure.
- Defina a baixa porcentagem de CO2. Digite 0 em Low Cal da linha C3 e, em seguida, altere o tempo para 3 s e clique em Medir em Low Cal.
- No programa de misturador de gás, altere o valor de O2 para 10% e o valor de CO2 para 5%. Aguarde vários minutos para que o fluxo de gás se ajuste a esses valores. Nos analisadores metabólicos, gire os botões de ajuste para calibrar CO2 igual a 5%. Certifique-se de girar o mostrador de volta para Amostra uma vez que os valores estejam calibrados.
- Defina a alta porcentagem de CO2. Certifique-se de que as leituras do analisador estão estáveis antes de inserir valores apropriados no O2 e CO2 no software de pletimografia barométrica. Clique em Unidade Alta em C3 e digite 5. Mude high cal para 3 s e aperte Measure.
- Defina a baixa porcentagem de O2. Clique em Unidade Baixa na opção C2 e digite 10. Clique em Low Cal, entrada 3 s e clique em Medir.
- Alterar os valores do gás na mistura de gás de volta para 20,93% O2 e 79,07% N2. Aguarde vários minutos para que a câmara se ajuste a esses valores. Repita as etapas 3.1\u20123.7 se os analisadores metabólicos não lerem automaticamente 20,93% O2 e 0% CO2,para garantir a calibração adequada. Confirme rotineiramente a calibração adequada com tanques de gás certificados.
- Verifique novamente os medidores de fluxo conectados à câmara de pletimografia barométrica. Ajuste o fluxo de ar para dentro e para fora da câmara para taxas apropriadas para o experimento (tipicamente, 0,1-0,3 L/min).
- Uma vez que todas as configurações tenham sido aplicadas ao software de pletimografia barométrica, clique em OK para começar a gravar.
4. Plethysmografia barométrica desenfreada
- Registre o peso do rato e a temperatura inicial do corpo. Aguarde 10 min antes de colocar o mouse na câmara, para coletar os dados de O2 e CO2 de uma câmara vazia. Trabalhe em uma área tranquila familiar aos ratos para que o barulho e os cheiros não interfiram na coleta de dados. Evite possíveis interrupções, incluindo a abertura e o fechamento de portas ou pessoal que entra/sai da sala de coleta de dados.
NOTA: Este protocolo específico utilizou um rato C57BL/6J masculino de 22 meses. - Durante a primeira hora, documente os comportamentos do mouse e faça anotações detalhadas, incluindo valores específicos do fluxo de entrada/saída da câmara.
- Após 60 min de habituação de câmara, observe os segmentos de respiração silenciosa para os 60 min. Liste quaisquer segmentos com duração mínima de 15 s s sem cheirar e preparar. Tome medidas de temperatura corporal a cada 10 min ao usar um dispositivo implantável.
- No final do experimento, remova o rato da câmara e coloque-o de volta em sua gaiola. Todos os equipamentos devem ser limpos e completamente limpos. Se as gotículas de água permanecerem, use ar pressurizado para removê-las.
5. Análise do Padrão de Respiração e Metabolismo
- Abra o arquivo de revisão da pletimografia barométrica e consulte as notas registradas para o animal de interesse.
- Abra o painel metabólico no software e pegue a média dos primeiros 10 min de O2 e CO2,quando a câmara estava vazia. Registre esses valores como o FiO2 e fico2.
- Exibir o painel Fluxo do software de pletimografia barométrica. Clique com o botão direito do mouse Analisar atributos e defina parâmetros apropriados. Na guia Meta 1, insira o FiO2 e o FiCO2 a partir da etapa 5.2, bem como o fluxo para a câmara em Meta 2, para calcular VO2 e VCO2.
- Para análise padrão de respiração, confirme os tempos para os 15 segundos de respiração silenciosa usando notas sobre o comportamento animal, bem como o rastreamento do painel de fluxo. Digite os horários para os intervalos de 15 s de respiração silenciosa em Diálogo de Analisador de Dados Abertos na guia Data Parser. Clique em Modo de exibição de parser para mostrar apenas os segmentos de interesse específicos de 15 s.
- Clique em Salvar dados derivados analisados. Abra o arquivo de dados em uma planilha para obter os dados binados.
6. Análise de Apnéias e Respirações Aumentadas
- No arquivo de revisão aberto, saia do modo de exibição do analisador. Vá para a opção Configuração de gráficos em Configuração de Configuração > Configuração P3 e selecione Exibição de página em Tipo. Selecione 5 para o número de painéis. Digite -2 na caixa rotulada low e 2 na caixa rotulada Alta para medidas de fluxo em mililitros/segundo. Aplique as mudanças.
- Role até a marca de 30 minutos no painel de traçados de fluxo.
- Conte apnéias e respirações aumentadas para os 30-60 min depois que o rato foi colocado na câmara. Quantifique períodos de respiração suspensa com duração maior ou igual a 0,5 s, indicativo de apnéia. As respirações aumentadas são indicadas por um aumento acentuado no traço respiratório acima de 1,25 mL/s seguido de uma diminuição acentuada abaixo de -0,75 mL/s.
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Representative Results
São relatados os resultados da UBP como avaliação do padrão de respiração em camundongos de 16 anos (22 meses de idade) realizados sob gás ar normal (20,93% O2 com N2equilibrado ). A análise incluiu primeiro uma comparação de um segmento de respiração mais longo de 10 minutos (que levou mais de 2h para obter) em comparação com a média de quatro segmentos curtos de 15 s (quantificados em minutos 60-120). Um traçado representativo de respiração silenciosa, onde a respiração é consistente com nenhum comportamento ativo de respiração, é fornecido na Figura 1A. Quando rastreamentos semelhantes são coletados de animais, 100% das respirações devem ser aceitas pelo software. No entanto, a Figura 1B representa a respiração de um segmento mais ativo, onde os ratos estão explorando a câmara, farejando e/ou preparando. Rastreamentos semelhantes aos mostrados na Figura 1B são menos propensos a serem aceitos pelo software e não são ideais para o tipo de coleta respiratória utilizada e explicada por essa metodologia. Os parâmetros selecionados para a avaliação de possíveis diferenças de padrão de respiração entre os dois pontos de tempo foram a frequência respiratória(Figura 2A),o volume da maré (VT, Figura 2B), ventilação minuciosa (VE, Figura 2C),volume da maré/razão de tempo inspiratória (VT/Ti, Figura 2D), e relação de ventilação minuciosa/dióxido de carbono expelido (VE/VCO2/g, Figura 2E),todos calculados utilizando o software de pletimografia barométrica e a equação de Drorbaugh e Fenn. Os valores relatados para essas medidas estão dentro do intervalo do que já reportamos anteriormente para o mouse modelo6,9. Não foram elucidadas diferenças significativas entre os grupos; correções pós-hoc para múltiplas comparações de frequência respiratória e dados de VT foram contabilizados com Bonferroni (p < 0,025 foi considerado significativo). Esses resultados mostram que o uso de um protocolo simplificado usando linhas de base de 15 s fornece resultados semelhantes aos de um protocolo de linha de base mais longo.
Foram realizadas análises mais aprofundadas com cada um dos quatro segmentos de linha de base de 15 s para frequência, VT, VE, VT/Ti e VE/VCO2/g(Figura 3). Não foram encontradas diferenças significativas(p > 0,05) entre qualquer um dos pontos de tempo. Também não houve diferenças na variabilidade entre qualquer um dos quatro segmentos tempontos para qualquer medida padrão de respiração. Além disso, testamos a variabilidade do segmento do grupo 15 s versus o grupo de 10 min e não encontramos diferenças significativas usando o teste de Levene ao comparar os dados médios do grupo.
O número de apnéias e respirações aumentadas observadas para cada animal durante os minutos 30-60 do protocolo UBP são apresentados na Figura 4. Esses resultados mostram que os animais idosos apresentam um alto número de apneias e a presença de respirações aumentadas dentro de um período de 30 minutos (rastreamento mostrado na Figura 1C). Os dados são indicativos de mudanças durante o processo de envelhecimento, pois esses achados foram observados em camundongos de 22 meses de idade. Para confirmar a confiabilidade do interter para análises de apnéia e respiração aumentada, a correlação de Pearson foi calculada para dois investigadores diferentes. Verificou-se alto grau de concordância entre os avaliadores, indicado por um valor de r = 0,99 para apneias e r = 0,86 para respiração aumentada. Em estudos futuros, um número aumentado de apnéias em comparação com um grupo controle estaria falando de uma disfunção respiratória decorrente de um componente neural.
Figura 1: Traçações de fluxo representativas. (A) Rastreamento de fluxo a partir de uma linha de base silenciosa, onde o mouse não apresenta comportamentos ativos, como farejar ou preparar. (B) Rastreamento de fluxo de um período de respiração ativo não incluído em nossas análises, onde os ratos estão se movendo sobre a câmara e muitas respirações não são rotineiramente aceitas. (C) Rastreamento de fluxo exibindo uma respiração aumentada seguida de um período de apnéia. Uma janela de 5 s é mostrada para todos os traços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os parâmetros respiratórios são semelhantes para segmentos de respiração calma de 10 min e 15 s em ratos de 22 meses de idade. A pletimografia barométrica foi utilizada para coletar dados respiratórios em camundongos idosos (n = 16, 22 meses). Os dados respiratórios foram calculados para camundongos durante dois pontos de tempo diferentes, ou seja, a média de quatro intervalos de calma de 15 s dentro da marca de 60-120 min do rato estar na câmara e por 10 minutos de respiração calma consistente. (A)Frequência respiratória (respirações/minutos). (B) Volume de maré (VT; mililitros/respiração). (C) Ventilação minuciosa (VE; mililitros/minuto). (D) Razão entre o volume das marés e o tempo de inspiração (VT/Ti; mililitros/segundo). (E) Razão entre ventilação minuciosa e dióxido de carbono expelido, normalizado ao peso (VE/VCO2/g). Não há diferenças estatisticamente significativas entre os grupos após correções pós-hoc(p > 0,025). Os valores de >3 SD acima da média foram considerados outliers e removidos do conjunto de dados. Os dados são apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de quatro intervalos de 15 s. Os dados respiratórios foram calculados em camundongos de respiração calma(n = 16, 22 meses) para quatro intervalos separados de 15 s dentro dos 60-120 min de colocação da câmara. (A)Frequência respiratória (respirações/minutos). (B) Volume de maré (VT; mililitros/respiração). (C) Ventilação minuciosa (VE; mililitros/minuto). (D) Razão entre o volume das marés e o tempo de inspiração (VT/Ti; mililitros/segundo). (E) Razão entre ventilação minuciosa e dióxido de carbono expelido, normalizado ao peso (VE/VCO2/g). Não há diferenças estatisticamente significativas entre os segmentos de tempo (p > 0,05). Os outliers são definidos como >3 SD acima da média e removidos. Os dados são apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Apnéia e respiração aumentada conta em camundongos. Apneias (≥0,5 s s sem respiração) e respiração aumentada (ABs; aumento acentuado da inalação acima de 1,25 mL/s seguido de expiração acentuada abaixo de -0,75 mL/s) foram contadas em camundongos idosos(n = 16, 22 meses) entre 30 e 60 min. As contagens foram analisadas ao longo de 30 min e o total desse período é relatado. Os dados são apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquemático da pletimismografia barométrica desenfreada (UBP). A configuração geral do UBP deve ser semelhante à descrita na figura. As medidas de fluxo devem ser medidas para os gases que entram e saem da câmara, e a composição do gás deve ser conhecida pela interpretação dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo fornece informações sobre uma linha de base respiratória tranquila em camundongos, bem como a coleta de dados sobre apnéias centrais e respirações aumentadas. Os resultados representativos mostram que uma linha de base silenciosa de 10 minutos tem um padrão de respiração semelhante quando comparada a uma média de quatro ataques de 15 s para uma coorte de camundongos antigos. É importante ressaltar que os 15 ataques não são estatisticamente diferentes, nem esses grupos têm diferenças de variação entre si usando o teste de Levene. Esses dados demonstram que mesmo uma pequena luta é suficiente para monitorar a respiração silenciosa. No entanto, é inteiramente possível que analisar a variação individual dentro de um mouse em 15 s vs. 10 min pode resultar em diferentes achados, já que o ataque de 10 minutos poderia abranger atividades mínimas de farejamento e preparação. No entanto, o uso do teste de Levene para comparação de segmentos de linha de base individuais do mouse fornece uma análise diferente da descrita neste protocolo. No geral, o desenho desta metodologia utiliza 15 segmentos de respiração que podem ser adquiridos durante os minutos 60-120 na câmara, em vez de ter que esperar que cada rato atinja durações mais longas de linha de base silenciosa.
A duração mais curta necessária para a linha de base permite que cepas mais ansiosas/agitadas de ratos sejam testadas para respiração silenciosa. O uso de um segmento de respiração mais longo (ou seja, 10 ou 2 min) alonga a duração do protocolo, a um ponto em que um ensaio pode precisar ser abandonado se os ratos não apresentarem um traço de respiração silencioso dentro de 3 h. Uma vez que muitos projetos experimentais também incorporam desafios respiratórios (ou seja, hipóxia), o tempo estendido atribuído para outros gases destaca a necessidade de padronização do tempo de coleta de base. O uso de um único ataque de 15 s de respiração tranquila ajuda a aliviar a preocupação de trabalhar com camundongos (e cepas de ratos) que podem ser particularmente excitáveis na câmara. Enquanto trabalhava com pletimografia barométrica, descobrimos que ~10% dos camundongos por estudo tinham que ser excluídos devido à sua incapacidade de realizar apenas 2 minutos de respiração silenciosa contínua dentro da câmara. A implementação de ensaios de familiarização anteriores não foi bem sucedida em fazer com que os ratos se acalmassem mais rapidamente quando colocados na câmara no dia da experimentação. No entanto, como diferentes cepas, sexos e idades de camundongos podem reagir de forma diferente ao ambiente da câmara10,11, é possível que as técnicas de habitação possam ser úteis12,13 para algumas coortes. Nossos ensaios de familiarização consistiram em colocar os ratos na câmara ubp na sala de testes por 1-2 h por vários dias antes da experimentação. Embora não tenha sido observada nenhuma alteração no comportamento animal após este procedimento, um estudo anterior mostrou que foram necessários 24h de habitação para eliminar efeitos de novidade resultando em atividade física espontânea em camundongos12. Além disso, Kabir et al. descobriram que colocar cilindros de plástico semelhantes em tamanho à câmara de pletimografia barométrica na gaiola doméstica foi vantajoso em fazer com que os ratos se familiarizassem com as configurações antes da experimentação13.
Este protocolo também descobre possíveis disfunções respiratórias em camundongos através da quantificação de apnéias centrais, indicativo de problemas de controle neural. Trinta minutos de observação antes da coleção de padrão de respiração da linha de base mostraram que todos os 16 ratos idosos apresentaram um alto número de episódios apneicos e respirações aumentadas (representados na Figura 1C). As numerosas apnéias nesta coorte de ratos envelhecidos destacam a capacidade deste protocolo de quantificar outra medida respiratória importante sem adicionar tempo adicional à experimentação. Deve-se notar que a idade e a progressão da doença (se aplicável) podem afetar a presença e o número de episódios apneicos.
Para caracterizar a respiração silenciosa, é importante observar continuamente a câmara de pletimografia barométrica e o rato durante toda a duração do protocolo. Para a quantificação da respiração silenciosa, os camundongos devem estar acordados, mas não participar de comportamentos ativos, como farejar, aliciar ou explorar (representado na Figura 1A). Uma vez que os padrões de respiração durante o sono podem diferir daqueles em um animal acordado14,15, a coleta de respiração calma durante o estado acordado é crítica. É possível que segmentos mais longos de respiração silenciosa possam incluir períodos de sono, que podem não ser desejados dependendo do projeto experimental. Neste caso, segmentos mais curtos de respiração silenciosa seriam ideais para documentar, pois a probabilidade de coleta de dados durante o sono é reduzida quando segmentos ativos flanqueiam os segmentos de respiração curta (15 s) tranquila. Observamos que segmentos mais longos de respiração silenciosa podem ser desafiadores para adquirir no modelo do mouse, já que o comportamento do rato na câmara parece ser muito diferente em comparação com o dos ratos. É importante tanto observar criticamente o fluxo respiratório do camundongo para segmentos respiratórios adequados quanto documentar o comportamento animal. Em casos de ventilação reduzida ou respiração instável, este método ainda pode ser utilizado. Nesses casos, é essencial que o experimentador esteja cego para a coorte ao selecionar os segmentos de 15 s. O programa de software deve distinguir os suspiros, com uma taxa de aceitação de 100% durante o período de 15 anos. Aconselhamos tomar nota dos rastreamentos respiratórios, além de garantir que os animais atendam aos critérios comportamentais para a linha de base, uma vez que é possível que os ratos estacionários ainda estejam ansiosos. Estudo anterior relatou que, embora os ratos apresentassem comportamento calmo, eles ainda apresentavam padrões de respiração alterados (ou seja, aumento da frequência) em resposta a estímulos controlados dentro da sala de testes13.
Medidas de frequência, VT, VE, tempo inspiratório e expiratório, e VE/VCO2 são quantificadas utilizando analisadores e software ubp e são freqüentemente relatadas na literatura. Particularmente, os cálculos vt e ve usam a equação de Drorbaugh e Fenn16, que requer valores conhecidos para temperatura corporal, temperatura da câmara ambiente, umidade e pressão barométrica. Recomenda-se coletar essas medidas ao longo do experimento para os valores mais precisos de VT e VE. Outras variáveis que são calculadas pelo sistema devem ser usadas com cautela. A UBP não é uma medida direta da mecânica pulmonar; assim, variáveis relacionadas à resistência das vias aéreas (por exemplo, pausa aprimorada [Penh]) devem ser interpretadas com essa ressalva em mente5. Componentes adicionais da configuração ubp que podem impactar variáveis calculadas pelo software incluem taxas de fluxo e a calibração geral do sistema. Confirme selos e juntas estão funcionando corretamente (sem vazamentos) e garanta a conexão adequada de todos os equipamentos à câmara de pletimografia barométrica(Figura 5). As taxas de fluxo dentro e fora da câmara devem ser mantidas consistentes. As taxas de fluxo necessárias podem diferir entre as configurações do UBP, por isso é importante verificar esses valores antes da experimentação. A taxa de fluxo para a câmara deve ser suficiente para fornecer desafios de ar fresco ou gás em tempo hábil. A taxa de fluxo também deve ser suficiente para permitir que os analisadores metabólicos meçam O2 e CO2 sem ter o co2 acumulado no ambiente da câmara, o que representa o risco de uma mudança no padrão de respiração. Da mesma forma, as calibrações do misturador/analisador de gás precisam ser implementadas regularmente para garantir que os parâmetros metabólicos sejam medidos com precisão.
Outras considerações para a UBP consciente incluem a redução de distrações dentro da sala experimental enquanto os animais estão sendo testados. Ruídos altos, cheiros diferentes e a presença de pessoal não essencial na sala podem aumentar os comportamentos ansiosos exibidos pelos ratos. Usar salas menores como áreas de teste pode ajudar, mas se isso não for possível, paredes de papelão (com uma pequena janela de visualização) podem ser criadas ao redor da câmara para diminuir as distrações para os ratos. A atividade elétrica dentro da sala deve ser mantida no mínimo para evitar ruídos adicionais dentro dos traçados de pletimografia barométrica. Portanto, é importante tomar nota dos traçados de fluxo durante o período de 10 min quando o software está coletando dados de uma câmara vazia. Estes traças devem permanecer planos, e quaisquer interrupções ou ondas leves são sinais de ruído e devem ser abordados. Mudanças de pressão de abertura e fechamento de portas ou do funcionamento do HVAC também podem aumentar as flutuações errôneas, e garantir que essas ações ocorram minimamente (e notá-las quando ocorrem) é fundamental. A umidade também pode afetar o volume de maré calculado e a ventilação minuciosa, tornando muito importante confirmar que a câmara e os tubos de conexão são secos antes do uso. Se necessário, o uso de contas drieritas em seqüência com os tubos de fluxo pode ajudar a remover toda a condensação no ar antes da entrada da câmara. Essa etapa seria instituída nos casos em que a umidade tem sido rotineiramente superior aos níveis listados no Guia de Cuidado e Uso de Animais8 (30%-70%, idealmente dentro de 10% do setpoint). A umidade também pode se acumular na câmara devido à presença do animal. Embora alguma umidade seja normal, ela pode continuar a construir se o animal estiver excessivamente ativo ou colocado na câmara por mais tempo. Se os níveis de umidade atingirem níveis máximos (99,99%), a câmara pode precisar ser aberta e enxugada durante a experimentação para manter medidas respiratórias comparáveis. O software explica mudanças na pressão barométrica, temperatura ambiente, temperatura animal e umidade. A melhor prática é manter os valores dentro de uma faixa razoável para que "maçãs para maçãs" estejam sendo comparadas entre idades, cepas e sexos. Além disso, o ciclo circadiano dos camundongos e o intervalo de tempo de testes, bem como as condições específicas de iluminação da sala, são detalhes importantes a considerar13,17. Por exemplo, normalmente testamos ratos em iluminação semelhante à sua sala de alojamento (ciclo claro ou escuro) e dentro de uma faixa de 3 h18. Os experimentadores também devem permanecer cegos aos grupos animais durante a coleta de dados e análises para evitar diferenças na seleção de uma linha de base. Quando possível, o mesmo experimentador deve coletar todos os dados e/ou analisar todos os rastreamentos em um determinado experimento. Passos para manter os experimentadores cegos aos grupos animais, bem como a randomização e testes em horários semelhantes do dia, são cruciais para o rigor da investigação. Em última análise, existem fatores estranhos que podem alterar os traçados de fluxo, e essas preocupações devem ser consideradas ao realizar o UBP.
O método UBP é uma técnica usada para caracterizar o padrão de respiração em camundongos. As medidas de linha de base podem ser coletadas dentro de 2h ao usar um segmento de respiração de 15 s. Aqui relatamos um método que pode ser realizado com camundongos idosos, que muitas vezes são mais agitados na câmara do que os camundongos mais jovens, sugerindo que outras cepas de camundongos ansiosos ou ativos também poderiam ser testadas com este protocolo. Os dados coletados da UBP são não invasivos e permitem testes em vários pontos de tempo, o que é útil para estudos sobre envelhecimento, terapia medicamentosa e progressão da doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Angela Le, Sarah Ruby e Marisa Mickey por seu trabalho mantendo as colônias de animais. Este trabalho foi financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoiar a CNR), e pela McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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