Summary
La pletimografía barométrica sin restricciones se utiliza para cuantificar el patrón de respiración en ratones despiertos. Mostramos que los segmentos de 15 s bajo un protocolo estandarizado muestran valores similares a una duración prolongada de respiración silenciosa. Esta metodología también permite la cuantificación de la apnea y las respiraciones aumentadas durante la primera hora en la cámara.
Abstract
La pletimografía barométrica sin restricciones (UBP) es un método para cuantificar el patrón de respiración en ratones, donde se notifica rutinariamente la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminosa. Además, se puede recopilar información sobre la salida neuronal de la respiración, incluyendo la existencia de apneas centrales y respiraciones aumentadas. Una consideración importante para la UBP es la obtención de un segmento respiratorio con un impacto mínimo de comportamientos ansiosos o activos, para dilucidar la respuesta a los problemas respiratorios. Aquí, presentamos un protocolo que permite obtener líneas de base cortas y silenciosas en ratones envejecidos, comparables a esperar más largos de respiración tranquila. El uso de segmentos de tiempo más cortos es valioso, ya que algunas cepas de ratones pueden ser cada vez más excitables o ansiosos, y períodos más largos de respiración silenciosa pueden no lograrse dentro de un plazo razonable. Colocamos ratones de 22 meses de edad en una cámara UBP y comparamos cuatro segmentos de respiración silenciosa de 15 s entre los minutos 60-120 y un período de respiración silenciosa más largo de 10 minutos que tardó de 2 a 3 horas en adquirirse. También obtuvimos recuentos de apneas centrales y respiraciones aumentadas antes de los segmentos de respiración tranquila, después de un período de familiarización de 30 minutos. Mostramos que 10 minutos de respiración silenciosa es comparable a usar una duración mucho más corta de 15 s. Además, el tiempo que conduce a estos 15 segmentos de respiración silenciosa se puede utilizar para recopilar datos sobre apneas de origen central. Este protocolo permite a los investigadores recopilar datos de patrón de respiración en una cantidad determinada de tiempo y hace que las medidas de referencia silenciosas sean factibles para ratones que pueden exhibir mayores cantidades de comportamiento excitable. La propia metodología UBP proporciona una forma útil y no invasiva de recopilar datos de patrones de respiración y permite que los ratones se prueben en varios puntos de tiempo.
Introduction
UBP es una técnica común para la evaluación de patrones respiratorios1,2,3,4. En este método, los ratones se colocan en una cámara cerrada donde las diferencias de presión entre la cámara principal (donde el animal está alojado) y una cámara de referencia se filtran a través de un neumotachogramógrafo para obtener valores. La configuración de UBP resultante no es invasiva y sin restricciones y permite evaluar las medidas respiratorias sin necesidad de anestesia o cirugía. Además, esta técnica es adecuada para estudios que requieren múltiples mediciones en el mismo ratón a lo largo del tiempo. Variables como la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminal se pueden cuantificar con este método, durante un solo ensayo o durante varios ensayos. La UBP de todo el cuerpo también proporciona medidas de flujos máximos y duración del ciclo respiratorio. Juntos, estos parámetros cuantifican el patrón de respiración. Los rastros respiratorios registrados también permiten revisar los datos y contar el número de apneas centrales mostradas dentro de un período de tiempo determinado. Este recuento se puede utilizar junto con un análisis del volumen de marea y los tiempos inspiratorios para medir otras alteraciones en el patrón de respiración.
Mientras que existen varias técnicas de pletimismografía no invasiva para la evaluación directa de los parámetros fisiológicos pulmonares, UBP de todo el cuerpo permite una manera de detectar la función respiratoria con un mínimo estrés indebido para el ratón. La pletimografía head-out, que utiliza medidas de flujo midexpiratorio de marea y también no es invasiva, se basa en la restricción, como muchos otros tipos de pletimografía (por ejemplo, pletismografía de doble cámara). Si bien estos métodos se han utilizado en modelos de roedores para medir la capacidad de respuesta de las vías respiratorias5, el uso de cuellos o pequeños tubos de retención puede llevar ratones (frente a otras especies) más tiempo para aclimatarse y devolver su respiración a los niveles de reposo.
La obtención de un segmento óptimo de respiración del aire es una consideración importante para las comparaciones de línea de base. El mayor uso de los sistemas de pletimografía disponibles comercialmente hace posible la recopilación de datos de patrones de respiración en muchos laboratorios. Es importante destacar que el patrón de respiración es variable durante todo el período de recolección, especialmente para ratones. Dicho esto, es necesario estandarizar el análisis de línea de base como un medio para garantizar que el nivel de formación de los experimentadores no confunde los resultados. Hay numerosas maneras de recoger un segmento de respiración del aire, sirviendo como un área de variación entre los diseños experimentales. Un ejemplo incluye promediar los últimos 10-30 minutos de datos después de un conjunto de tiempo previamente definido dentro de la cámara1, mientras que otro método implica esperar hasta que el ratón esté visiblemente tranquilo durante 5-10 min6. Este último puede tomar de 2 a 3 h para lograr y, en algunos casos, un ensayo puede necesitar ser abandonado si el ratón no está tranquilo durante el tiempo suficiente. Esta preocupación es una consideración especialmente importante para las cepas de ratones donde los comportamientos observados son más ansiosos y excitables7. Estos ratones pueden tardar más en adaptarse al entorno de la cámara y sólo permanecen tranquilos durante breves ráfagas de tiempo. Limitar el tiempo dedicado a la colección de líneas base estandariza el tiempo de cámara para cada ratón.
Es crucial que los experimentadores obtengan una línea base adecuada que abarque los valores de comportamiento en reposo en el ratón, pero también se produzca de manera oportuna. Por lo tanto, el objetivo de este informe es proporcionar una descripción de los métodos utilizados para obtener valores de referencia silenciosos cortos para los parámetros de respiración en ratones. Además, informamos que las apneas y las respiraciones aumentadas se pueden cuantificar durante la primera hora en la cámara.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Le Moyne College. Todo uso de animales estuvo de acuerdo con las políticas descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio8.
NOTA: (Crítico) Antes de la experimentación, obtenga todas las aprobaciones necesarias y el entrenamiento necesario para el uso animal. Es importante que los experimentadores estén familiarizados con los comportamientos del ratón y los niveles de actividad, incluyendo signos de sueño, angustia y/o artefacto de movimiento frente al olfato normal y la respiración.
1. Cámara de Plethysmography Barométrica de cuerpo entero
- Lea los manuales de usuario adecuados para la cámara de pletimografía barométrica, incluidos conectores, anillos tóricas, etc., y cree un archivo de protocolo estándar para definir analizadores (por ejemplo, metabólicos) y parámetros específicos del software.
- Asegúrese de que todas las mangueras y tubos estén conectados a la cámara. Conecte un tubo de flujo de gas (flujo de entrada) y un tubo de vacío (salida de flujo) directamente a la cámara de pletimografía barométrica.
NOTA: La entrada debe estar unida al flujo de polarizaciónmarcado de apertura. - Conecte los tanques de gas CO2,O2y N2 a la mezcladora de gas. Asegúrese de que todos los tanques de gas estén en la posición abierta antes de la experimentación.
2. Calibración de la Cámara de Plegógrafo Barométrico
- Calibre un flujo alto y bajo de gas seleccionando la configuración de 7700 amplificadores en la pestaña Hardware del software de pletimografía barométrica.
- Fije un vacío (flujo fuera de la cámara) apropiado para el diseño experimental y los analizadores de gas (0,1 L/min).
NOTA: La tasa de salida debe seguir siendo la misma a lo largo de las calibraciones y experimentar para obtener registros metabólicos precisos. - Ajuste un flujo bajo de aire quitando el tubo de flujo de la cámara y apagando el vacío.
- Registre el flujo cero introduciendo un 0 en la celda Unidad baja para la cámara correspondiente. Haga doble clic en la celda Cal baja, cambie la hora a 3 s y pulse Medir.
- Vuelva a colocar el tubo de flujo y permita que el gas (20,93% O2, balanceado N2) fluya a través de la cámara de pletimografía barométrica desde el mezclador de gas.
- Convierta la entrada de litros/minutos en mililitros/segundo. Haga clic en la celda Unidad alta de la cámara correspondiente e introduzca el valor en mililitros/segundo. Haga doble clic en Cal alta, cambie la hora a 3 s y haga clic en Medir.
- Deje abierta la pestaña 7700-Amplifier Setup para calibrar los analizadores metabólicos al software de pletimografía barométrica.
3. Calibración del analizador metabólico
- En el programa de mezclador de gas, configure el mezclador de gas para liberar un flujo de gas que contenga 20,93% O2 y 79,07% N2.
- En los analizadores metabólicos, establezca el nivel de calibración O2 en 20,93% y elCO2 para que lea 0%. Vuelva a girar el dial a Muestra una vez que se introduzcan los valores adecuados.
- Establezca el alto porcentaje de O2. Haga clic en la pestaña ABCD-4 del software de pletimografía barométrica y luego ingrese 20.93 bajo Unidad alta de la línea C2. En Cal alta, cambie la hora a 3 s y pulse Medir.
- Establezca el porcentaje bajo de CO2. Ingrese 0 bajo Cal baja de la línea C3, y después cambie el tiempo a 3 s y haga clic la medida bajo cal baja.
- En el programa de mezclador de gas, cambie el valor de O2 a 10% y el valor de CO2 a 5%. Espere varios minutos para que el flujo de gas se ajuste a estos valores. En los analizadores metabólicos, gire las perillas de ajuste para calibrar CO2 igual al 5%. Asegúrese de volver a girar el dial a Muestra una vez calibrados los valores.
- Establezca el alto porcentaje de CO2. Asegúrese de que las lecturas del analizador sean estables antes de insertar los valores adecuados en el O2 y CO2 en el software de pletimografía barométrica. Haga clic en Unidad alta en C3 e introduzca 5. Cambie Cal alto a 3 s y pulse Medir.
- Establezca el porcentaje bajo de O2. Haga clic en Unidad baja en la opción C2 e introduzca 10. Haga clic en Cal baja, entrada 3 s y haga clic en Medir.
- Cambie los valores de gas en el mezclador de gas de nuevo a 20,93% O2 y 79,07% N2. Espere varios minutos hasta que la cámara se ajuste a estos valores. Repita los pasos 3.1-u20123.7 si los analizadores metabólicos no leen automáticamente 20,93% O2 y 0% CO2,para garantizar una calibración adecuada. Confirme de forma rutinaria la calibración adecuada con tanques de gas certificados.
- Vuelva a comprobar los caudalímetros conectados a la cámara de pletimografía barométrica. Ajuste el flujo de aire dentro y fuera de la cámara a velocidades apropiadas para el experimento (normalmente, 0,1–0,3 L/min).
- Una vez que todos los ajustes se hayan aplicado al software de pletimografía barométrica, haga clic en Aceptar para comenzar a grabar.
4. Plethysmography barométrica sin restricciones
- Registre el peso del ratón y la temperatura corporal inicial. Espere 10 minutos antes de colocar el ratón en la cámara, para recoger los datos de O2 yCO2 de una cámara vacía. Trabajar en un área tranquila familiar para los ratones para que el ruido y los olores no interfieran con la recopilación de datos. Evite posibles interrupciones, incluyendo la apertura y el cierre de puertas o personal que se mueve dentro/fuera de la sala de recopilación de datos.
NOTA: Este protocolo específico empleaba el ratón C57BL/6J masculino de 22 meses. - Durante la primera hora, documente los comportamientos del ratón y tome notas detalladas, incluidos los valores específicos del flujo de entrada/salida de la cámara.
- Después de 60 minutos de habituación de cámara, esté atento a los segmentos de respiración tranquila. para los siguientes 60 min. Listar todos los segmentos que duren al menos 15 s de longitud sin oler y acicalarse. Tome medidas de temperatura corporal cada 10 minutos cuando utilice un dispositivo implantable.
- Al final del experimento, retire el ratón de la cámara y colóquelo de nuevo en su jaula. Todo el equipo debe limpiarse y limpiarse a fondo. Si quedan gotas de agua, utilice aire presurizado para retirarlas.
5. Análisis del patrón de la respiración y el metabolismo
- Abra el archivo de revisión de la pletimografía barométrica y consulte las notas grabadas para el animal de interés.
- Abra el panel Metabólico en el software y tome el promedio de los primeros 10 min de O2 y CO2,cuando la cámara estaba vacía. Registre estos valores como FiO2 y FiCO2.
- Vea el panel Flujo del software de pletimografía barométrica. Haga clic con el botón derecho en Analizar atributos y establezca los parámetros adecuados. En la pestaña Meta 1, introduzca el FiO2 y el FiCO2 del paso 5.2, así como el flujo en la cámara bajo Meta 2,para calcular EL VO2 y el VCO2.
- Para el patrón de análisis de respiración, confirme los tiempos para los 15 segundos de respiración silenciosa utilizando notas sobre el comportamiento animal, así como el trazado del panel de flujo. Introduzca los tiempos para los intervalos de 15 s de respiración silenciosa Parser View Mode en Diálogo de analizador de datos abierto en la ficha Analizador de datos.
- Haga clic en Guardar datos derivados analizados. Abra el archivo de datos en una hoja de cálculo para obtener los datos en la base.
6. Análisis de apneas y respiraciones aumentadas
- En el archivo de revisión abierto, salga del modo de vista del analizador. Vaya a la opción Configuración de gráfico en Configuración > Configuración p3 y seleccione Vista de página en Tipo. Seleccione 5 para el número de paneles. Ingrese -2 en la caja etiquetada Low y 2 en la caja etiquetada High para las medidas de flujo en mililitros/segundo. Aplique los cambios.
- Desplácese hasta la marca de 30 minutos en el panel de trazados de flujo.
- Recuento de apneas y respiraciones aumentadas durante los 30-60 minutos después de que el ratón fue colocado en la cámara. Cuantificar los períodos de respiración suspendida que duran más o igual a 0,5 s, indicativo de una apnea. Las respiraciones aumentadas están indicadas por un fuerte aumento en el rastro respiratorio por encima de 1,25 ml/s seguido de una fuerte disminución por debajo de -0,75 ml/s.
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Representative Results
Se informan los resultados de la UBP como evaluación del patrón de respiración en ratones de 16 años (22 meses) realizados bajo gas de aire normal (20,93% O2 con N2equilibrado). El análisis primero incluyó una comparación de un segmento de respiración silenciosa más largo de 10 minutos (que tomó más de 2 h para obtener) frente al promedio de cuatro segmentos cortos de 15 s (cuantificados en minutos 60-120). En la Figura 1A se proporciona un seguimiento representativo del flujo de respiración silenciosa, donde la respiración es consistente con comportamientos respiratoriosactivos. Cuando se recogen trazas similares de animales, el software debe aceptar el 100% de las respiraciones. Sin embargo, la Figura 1B representa la respiración desde un segmento más activo, donde los ratones están explorando la cámara, olfateando y/o acicalándose. Los trazados similares a los mostrados en la Figura 1B son menos propensos a ser aceptados por el software y no son ideales para el tipo de colección de respiración utilizada y explicada por esta metodología. Los parámetros seleccionados para la evaluación de posibles diferencias de patrón de respiración entre los dos puntos de tiempo fueron la frecuencia respiratoria (Figura 2A), el volumen de marea (VT, Figura 2B), ventilación diminosa (VE, Figura 2C),relación de tiempo de volumen de marea/inspiratorio (VT/Ti, Figura 2D)y relación de ventilación por minuto/dióxido de carbono expulsado (VE/VCO2/g,Figura 2E),que se calcularon utilizando el software de pletimografía barométrica y la ecuación de Drorbaugh y Fenn. Los valores reportados para estas medidas están dentro del rango de lo que hemos informado previamente para el modelo de ratón6,9. No se esclarecieron diferencias significativas entre los grupos; las correcciones post hoc para comparaciones múltiples de frecuencia respiratoria y datos de VT se contabilizaron con Bonferroni (p < 0.025 se consideró significativo). Estos resultados muestran que el uso de un protocolo simplificado mediante líneas base de 15 s proporciona resultados similares a los de un protocolo de línea base más largo.
Se realizaron análisis adicionales con cada uno de los cuatro segmentos de línea de base de 15 s para frecuencia, VT, VE, VT/Ti y VE/VCO2/g(Figura 3). No se encontraron diferencias significativas(p > 0,05) entre cualquiera de los puntos de tiempo. Tampoco hubo diferencias en la variabilidad entre cualquiera de los cuatro segmentos de tiempo para cualquier medida de patrón de respiración. Además, probamos la variabilidad del segmento del grupo de 15 s frente al grupo de 10 min y no encontramos diferencias significativas utilizando la prueba de Levene al comparar los datos de grupo promediados.
El número de apneas y respiraciones aumentadas observadas para cada animal durante los minutos 30–60 del protocolo UBP se presentan en la Figura 4. Estos resultados muestran que los animales envejecidos muestran un alto número de apneas y la presencia de respiraciones aumentadas dentro de un lapso de 30 minutos (rastreo que se muestra en la Figura 1C). Los datos son indicativos de cambios durante el proceso de envejecimiento, ya que estos hallazgos se observaron en ratones de 22 meses de edad. Para confirmar la fiabilidad del terracida para los análisis de apnea y respiración aumentada, se calculó la correlación de Pearson para dos investigadores diferentes. Se encontró un alto grado de acuerdo entre los evaluadores, como se indica en un valor de r . .99 para las apneas y r .86 para las respiraciones aumentadas. En estudios futuros, un mayor número de apneas en comparación con un grupo de control estaría diciendo de una disfunción respiratoria derivada de un componente neuronal.
Figura 1: Seguimientos deflujo representativos. (A) Seguimiento de flujo desde una línea base silenciosa, donde el ratón no muestra ningún comportamiento activo como el olfato o el aseo. (B) Rastreo de flujo desde un período de respiración activo no incluido en nuestros análisis, donde los ratones se mueven por la cámara y muchas respiraciones no se aceptan rutinariamente. (C) Rastreo de flujo que muestra una respiración aumentada seguida de un período de apnea. Se muestra una ventana de 5 s para todas las trazas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Los parámetros respiratorios son similares para segmentos de respiración tranquila de 10 min y 15 s en ratones de 22 meses de edad. La pletimografía barométrica se utilizó para recopilar datos respiratorios en ratones envejecidos(n a 16, 22 meses de edad). Los datos de respiración se calcularon para ratones durante dos puntos de tiempo diferentes, a saber, el promedio de cuatro intervalos de calma de 15 s dentro de la marca de 60-120 minutos del ratón que está en la cámara y durante 10 minutos de respiración tranquila constante. (A) Frecuencia respiratoria (respiraciones/minutos). (B) Volumen de marea (VT; mililitros/respiración). (C) Ventilación diminal (VE; mililitros/minuto). (D) Relación entre el volumen de marea y el tiempo de inspiración (VT/Ti; mililitros/segundo). (E) Relación entre la ventilación diminal y el dióxido de carbono expulsado, normalizado al peso (VE/VCO2/g). No hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos después de correcciones post hoc (p > 0.025). Los valores de >3 SD por encima de la media se consideraron valores atípicos y se eliminaron del conjunto de datos. Los datos se presentan como media sd. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de cuatro intervalos de 15 s. Los datos de respiración se calcularon en ratones con respiración tranquila(n a 16, 22 meses de edad) para cuatro intervalos separados de 15 s dentro de los 60-120 minutos de colocación de la cámara. (A) Frecuencia respiratoria (respiraciones/minutos). (B) Volumen de marea (VT; mililitros/respiración). (C) Ventilación diminal (VE; mililitros/minuto). (D) Relación entre el volumen de marea y el tiempo de inspiración (VT/Ti; mililitros/segundo). (E) Relación entre la ventilación diminal y el dióxido de carbono expulsado, normalizado al peso (VE/VCO2/g). No hay diferencias estadísticamente significativas entre los segmentos de tiempo(p > 0,05). Los valores atípicos se definen como >3 SD por encima de la media y se eliminan. Los datos se presentan como media sd. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La apnea y el aumento de larespiración cuentan en ratones. Las apneas (0,5 s s s incondoloro) y las respiraciones aumentadas (AB; un fuerte aumento de la inhalación de más de 1,25 ml/s seguida de una exhalación aguda por debajo de -0,75 ml/s) se contaron en ratones envejecidos(n a 16, 22 meses de edad) entre 30 y 60 min. Los recuentos se analizaron durante 30 minutos y se notifica el total de ese período de tiempo. Los datos se presentan como media sd. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Esquema de la configuración depletimografía barométrica (UBP) sin restricciones. La configuración general de UBP debe ser similar a la descrita en la figura. Las mediciones de caudal deben medirse para los gases que entran y salen de la cámara, y la composición del gas debe conocerse para la interpretación de los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo proporciona información sobre una línea de base de respiración silenciosa en ratones, así como la recopilación de datos sobre apneas centrales y respiraciones aumentadas. Los resultados representativos muestran que una línea de base silenciosa de 10 minutos tiene un patrón de respiración similar en comparación con un promedio de cuatro peleas de 15 s para una cohorte de ratones viejos. Es importante destacar que los 15 s no son estadísticamente diferentes, ni estos grupos tienen diferencias en la variación entre sí utilizando la prueba de Levene. Estos datos demuestran que incluso un bout corto es suficiente para monitorear la respiración silenciosa. Sin embargo, es totalmente posible que el análisis de la variación individual dentro de un ratón a 15 s frente a 10 min puede resultar en diferentes hallazgos, ya que la pelea de 10 minutos podría abarcar actividades mínimas de olfato y aseo. Sin embargo, el uso de la prueba de Levene para una comparación de segmentos de línea base de ratón individuales proporciona un análisis diferente al descrito en este protocolo. En general, el diseño de esta metodología utiliza segmentos respiratorios de 15 s que se pueden adquirir durante los minutos 60-120 en la cámara, en lugar de tener que esperar a que cada ratón logre una duración más larga de una línea de base silenciosa.
La duración más corta requerida para la línea de base permite que se prueben más cepas de ratones ansiosos/agitados para una respiración silenciosa. El uso de un segmento respiratorio más largo (es decir, 10 o 2 min) alarga la duración del protocolo, hasta un punto en el que un ensayo puede necesitar ser abandonado si los ratones no muestran un rastro de respiración silencioso dentro de las 3 h. Dado que muchos diseños experimentales también incorporan desafíos respiratorios (es decir, hipoxia), el tiempo extendido asignado para otros gases pone de relieve la necesidad de estandarizar el tiempo de recolección de referencia. El uso de un solo pelea de respiración tranquila de 15 s ayuda a aliviar la preocupación de trabajar con ratones (y cepas de ratones) que pueden ser particularmente excitables en la cámara. Mientras trabajamos con pletimografía barométrica, encontramos que el 10 % de los ratones por estudio tuvieron que ser excluidos debido a su incapacidad para realizar tan solo 2 minutos de respiración silenciosa continua dentro de la cámara. La implementación de ensayos previos de familiarización no tuvo éxito en conseguir que los ratones se calmaran más rápido cuando se colocaron en la cámara el día de la experimentación. Sin embargo, debido a que diferentes cepas, sexos y edades de los ratones pueden reaccionar de manera diferente al ambiente de la cámara10,11, es posible que las técnicas de habituación pueden ser útiles12,,13 para algunas cohortes. Nuestros ensayos de familiarización consistieron en colocar a los ratones en la cámara de UBP en la sala de pruebas durante 1-2 h durante varios días antes de la experimentación. Si bien no observamos cambios en el comportamiento animal después de este procedimiento, un estudio previo ha demostrado que 24 h de habituación era necesario para eliminar los efectos de novedad que resultan en actividad física espontánea en ratones12. Además, Kabir y otros encontraron que la colocación de cilindros de plástico de tamaño similar a la cámara de pletimografía barométrica en la jaula del hogar era ventajoso para conseguir que las ratas se familiarizaran con las configuraciones antes de la experimentación13.
Este protocolo también descubre una posible disfunción respiratoria en ratones a través de la cuantificación de apneas centrales, indicativa de problemas de control neuronal. Treinta minutos de observación antes de la colección basal de patrón de respiración mostraron que los 16 ratones envejecidos mostraron un alto número de episodios apneicos y respiraciones aumentadas (representadas en la Figura 1C). Las numerosas apneas de esta cohorte de ratones envejecidos ponen de relieve la capacidad de este protocolo para cuantificar otra medida de respiración importante sin añadir tiempo adicional a la experimentación. Cabe señalar que la edad y la progresión de la enfermedad (si corresponde) pueden afectar la presencia y el número de episodios apneicos.
Con el fin de caracterizar la respiración silenciosa, es importante observar continuamente la cámara de pletimografía barométrica y el ratón durante toda la duración del protocolo. Para la cuantificación de la respiración silenciosa, los ratones deben estar despiertos pero no participar en ningún comportamiento activo como oler, acicalarse o explorar (representado en la Figura 1A). Dado que los patrones de respiración durante el sueño pueden diferir de los de un animal despierto14,15, la colección de respiración tranquila durante el estado despierto es crítica. Es posible que segmentos más largos de respiración tranquila podrían incluir períodos de sueño, que pueden no ser deseados dependiendo del diseño experimental. En este caso, segmentos más cortos de respiración silenciosa serían ideales para documentar, ya que la probabilidad de recopilación de datos durante el sueño se reduce cuando los segmentos activos flanquean los segmentos de respiración silenciosa cortos (15 s). Hemos observado que segmentos más largos de respiración silenciosa pueden ser difíciles de adquirir en el modelo de ratón, ya que el comportamiento del ratón en la cámara parece ser muy diferente en comparación con el de las ratas. Es importante observar críticamente el flujo respiratorio del ratón para segmentos respiratorios apropiados y documentar el comportamiento de los animales. En casos de ventilación reducida o respiración inestable, este método todavía se puede utilizar. En estos casos, es esencial que el experimentador se cega a la cohorte al seleccionar los segmentos de 15 s. El programa de software debe distinguir las respiraciones, con una tasa de aceptación del 100% durante el período de 15 s. Aconsejamos tomar nota de los rastros respiratorios, además de asegurar que los animales cumplen con los criterios de comportamiento para la línea de base, ya que es posible que los ratones estacionarios todavía pueden estar ansiosos. Un estudio anterior informó que aunque las ratas mostraban un comportamiento tranquilo, todavía mostraban patrones respiratorios alterados (es decir, aumento de la frecuencia) en respuesta a estímulos controlados dentro de la sala de pruebas13.
Las medidas de frecuencia, VT, VE, tiempo inspiratorio y espiratorio, y VE/VCO2 se cuantifican utilizando analizadores y el software UBP y se informan con frecuencia en la literatura. En particular, los cálculos VT y VE utilizan la ecuación Drorbaugh y Fenn16,que requiere valores conocidos para la temperatura corporal, la temperatura ambiente de la cámara, la humedad y la presión barométrica. Se recomienda recopilar estas medidas a lo largo del experimento para obtener los valores VT y VE más precisos. Otras variables calculadas por el sistema deben utilizarse con precaución. LA UBP no es una medida directa de la mecánica pulmonar; por lo tanto, las variables relacionadas con la resistencia de las vías respiratorias (por ejemplo, la pausa mejorada [Penh]) deben interpretarse teniendo en cuenta esta advertencia5. Los componentes adicionales de la configuración de UBP que pueden afectar a las variables calculadas por el software incluyen los caudales y la calibración general del sistema. Confirme que los sellos y juntas funcionan correctamente (sin fugas) y asegúrese de que la conexión adecuada de todos los equipos a la cámara de pletimografía barométrica(Figura 5). Los caudales dentro y fuera de la cámara deben mantenerse constantes. Los caudales requeridos pueden diferir entre las configuraciones de UBP, por lo que es importante comprobar estos valores antes de la experimentación. El caudal en la cámara debe ser suficiente para proporcionar desafíos de aire fresco o gas de manera oportuna. El caudal también debe ser suficiente para permitir que los analizadores metabólicos midan O2 yCO2 sin que elCO2 se acumule dentro del entorno de la cámara, lo que plantea el riesgo de un patrón cambiante de respiración. Del mismo modo, las calibraciones del mezclador/analizador de gas deben implementarse regularmente para garantizar que los parámetros metabólicos se midan con precisión.
Otras consideraciones para la UBP consciente incluyen la reducción de las distracciones dentro de la sala experimental mientras los animales están siendo probados. Los ruidos fuertes, los diferentes olores y la presencia de personal no esencial en la habitación pueden aumentar los comportamientos ansiosos exhibidos por los ratones. El uso de salas más pequeñas como áreas de prueba puede ayudar, pero si esto no es posible, se pueden configurar paredes de cartón (con una pequeña ventana de visión) alrededor de la cámara para disminuir las distracciones para los ratones. La actividad eléctrica dentro de la habitación debe mantenerse al mínimo para evitar ruidoadicional dentro de los trazados de pletimografía barométrica. Por lo tanto, es importante tomar nota de los seguimientos de flujo durante el período de 10 minutos cuando el software está recopilando datos de una cámara vacía. Estos trazados deben permanecer planos, y cualquier interrupción o onda leve son signos de ruido y deben abordarse. Los cambios de presión de apertura y cierre de puertas o de funcionamiento de HVAC también pueden aumentar las fluctuaciones erróneas, y asegurarse de que estas acciones se producen mínimamente (y notando cuando ocurren) es fundamental. La humedad también puede afectar el volumen de marea calculado y la ventilación diminal, por lo que es muy importante confirmar que la cámara y los tubos de conexión se secan antes de su uso. Si es necesario, el uso de perlas de tesita en secuencia con los tubos de flujo puede ayudar a eliminar toda condensación en el aire antes de la entrada de la cámara. Este paso se instituiría en casos en los que la humedad ha sido rutinariamente superior a los niveles enumerados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales8 (30%–70%, idealmente dentro del 10% del punto de consigna). La humedad también puede acumularse en la cámara debido a la presencia del animal. Aunque alguna humedad es normal, puede seguir construyéndose si el animal está excesivamente activo o colocado en la cámara durante más tiempo. Si los niveles de humedad alcanzan niveles máximos (99,99%), es posible que sea necesario abrir y limpiar la cámara durante la experimentación para mantener medidas de respiración comparables. El software explica los cambios en la presión barométrica, la temperatura ambiente, la temperatura animal y la humedad. La mejor práctica es mantener los valores dentro de un rango razonable para que las "manzanas a manzanas" se comparen a través de edades, cepas y sexos. Por otra parte, el ciclo circadiano de ratones y el rango de tiempo de pruebas, así como las condiciones de iluminación específicas de la habitación, son detalles importantes a tener en cuenta13,17. Por ejemplo, normalmente probamos ratones en iluminación similar a su sala de alojamiento (ya sea ciclo de luz u oscuridad) y dentro de un rango de 3 h18. Los experimentadores también deben permanecer cegados a los grupos de animales durante la recopilación de datos y análisis para evitar diferencias en la selección de una línea de base. Cuando sea posible, el mismo experimentador debe recopilar todos los datos y/o analizar todos los seguimientos de un experimento determinado. Los pasos para mantener cegados a los experimentadores a los grupos de animales, así como la aleatorización y las pruebas durante momentos similares del día, son cruciales para el rigor de la investigación. En última instancia, hay factores extraños que pueden alterar los trazados de flujo, y estas preocupaciones deben tenerse en cuenta al realizar UBP.
El método UBP es una técnica utilizada para caracterizar el patrón de respiración en ratones. Las medidas de referencia se pueden recoger dentro de las 2 h cuando se utiliza un segmento respiratorio de 15 s. Aquí informamos de un método que se puede realizar con ratones envejecidos, que a menudo están más agitados en la cámara que los ratones más jóvenes, lo que sugiere que otras cepas de ratón ansiosos o activos también podrían ser probados con este protocolo. Los datos recopilados de UBP no son invasivos y permiten realizar pruebas en múltiples puntos de tiempo, lo que es útil para estudios sobre el envejecimiento, la terapia farmacológica y la progresión de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Angela Le, Sarah Ruby y Marisa Mickey por su trabajo manteniendo las colonias de animales. Este trabajo fue financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoyar al CNR), y la Beca McDevitt de Investigación de Grado en Ciencias Naturales (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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