Summary
La pléthysmographie barométrique non retenue est utilisée pour quantifier le modèle de respiration chez les souris éveillées. Nous montrons que les segments de 15 s sous un protocole standardisé affichent des valeurs similaires à une durée prolongée de respiration silencieuse. Cette méthodologie permet également la quantification de l’apnée et des respirations augmentées pendant la première heure dans la chambre.
Abstract
La pléthysmographie barométrique non retenue (UBP) est une méthode pour quantifier le modèle de respiration chez les souris, où la fréquence respiratoire, le volume de marée et la ventilation minute sont régulièrement rapportés. En outre, des informations peuvent être recueillies concernant la sortie neuronale de la respiration, y compris l’existence d’apnées centrales et de respirations augmentées. Une considération importante pour l’UBP est d’obtenir un segment de respiration avec un impact minimal des comportements anxieux ou actifs, pour élucider la réponse aux défis respiratoires. Ici, nous présentons un protocole qui permet d’obtenir des lignes de base courtes et silencieuses chez des souris âgées, comparables à l’attente de plus longues crises de respiration tranquille. L’utilisation de segments de temps plus courts est précieuse, car certaines souches de souris peuvent être de plus en plus excitables ou anxieuses, et de plus longues périodes de respiration tranquille peuvent ne pas être réalisées dans un délai raisonnable. Nous avons placé des souris de 22 mois dans une chambre de l’UBP et comparé quatre segments respiratoires silencieux de 15 s entre les minutes 60-120 à une période de respiration plus longue de 10 min calme qui a pris 2-3 h à acquérir. Nous avons également obtenu des dénombrements d’apnées centrales et de respirations augmentées avant les segments respiratoires silencieux, après une période de familiarisation de 30 min. Nous montrons que 10 min de respiration tranquille est comparable à l’utilisation d’une durée beaucoup plus courte de 15 s. En outre, le temps qui précède ces segments de respiration tranquille de 15 s peut être utilisé pour recueillir des données concernant les apnées d’origine centrale. Ce protocole permet aux chercheurs de recueillir des données sur le modèle de respiration dans un laps de temps défini et rend possible des mesures de base silencieuses pour les souris qui peuvent présenter des quantités accrues de comportement excitable. La méthodologie UBP elle-même fournit un moyen utile et non invasif de recueillir des données sur les modèles de respiration et permet aux souris d’être testées sur plusieurs moments.
Introduction
UBP est une technique courante pour l’évaluation des modèles respiratoires1,2,3,4. Dans cette méthode, les souris sont placées dans une chambre fermée où les différences de pression entre la chambre principale (où l’animal est logé) et une chambre de référence sont filtrées à travers un pneumtachographe pour obtenir des valeurs. La configuration UBP qui en résulte est non invasive et non retenue et permet d’évaluer les mesures respiratoires sans l’exigence d’anesthésie ou de chirurgie. En outre, cette technique est adaptée aux études nécessitant plusieurs mesures dans la même souris au fil du temps. Des variables telles que la fréquence respiratoire, le volume des marées et la ventilation minute peuvent être quantifiées avec cette méthode, au cours d’un seul essai ou sur plusieurs essais. L’UBP du corps entier fournit également des mesures des débits de pointe et de la durée du cycle respiratoire. Ensemble, ces paramètres quantifient le modèle de respiration. Les traces respiratoires enregistrées permettent également d’examiner les données et de compter le nombre d’apnées centrales affichées dans un délai donné. Ce comptage peut être utilisé à côté d’une analyse du volume des marées et des temps inspiratoires pour évaluer d’autres altérations dans le modèle de respiration.
Tandis que plusieurs techniques non invasives de pléthysmographie existent pour l’évaluation directe des paramètres physiologiques pulmonaires, UBP de corps entier permet un moyen de dépister la fonction respiratoire avec un minimum de stress indu à la souris. La pléthysmographie de tête-out, qui utilise des mesures de débit mi-expiratoire des marées et qui est également non invasive, repose sur la retenue, comme beaucoup d’autres types de pléthysmographie (p. ex., pléthysmographie à double chambre). Bien que ces méthodes aient été utilisées dans les modèles de rongeurs pour mesurer la réactivité des voies respiratoires5,l’utilisation de colliers de cou ou de petits tubes de retenue peut prendre des souris (contre d’autres espèces) plus longtemps pour s’acclimater et retourner leur respiration aux niveaux de repos.
L’obtention d’un segment optimal de respiration de l’air est une considération importante pour les comparaisons de base. L’utilisation accrue de systèmes de pléthysmographie disponibles dans le commerce permet de recueillir des données sur les modèles de respiration dans de nombreux laboratoires. Il est important de noter que le modèle de respiration est variable tout au long de la période de collecte, en particulier pour les souris. Cela dit, il est nécessaire de normaliser l’analyse de base comme un moyen de s’assurer que le niveau de formation des expérimentateurs ne confond pas les résultats. Il existe de nombreuses façons de recueillir un segment de respiration de l’air, servant comme un domaine de variation entre les conceptions expérimentales. Un exemple comprend la moyenne des 10-30 minutes finales de données suivant un ensemble de temps précédemment défini dans la chambre1, tandis qu’une autre méthode consiste à attendre jusqu’à ce que la souris est visiblement calme pendant 5-10 min6. Ce dernier peut prendre 2-3 h pour atteindre et dans certains cas, un essai peut avoir besoin d’être abandonné si la souris n’est pas calme assez longtemps. Cette préoccupation est une considération particulièrement importante pour les souches de souris où les comportements observés sont plus anxieux et excitables7. Ces souris peuvent prendre plus de temps à s’adapter à l’environnement de la chambre et ne restent calmes que pour de courtes rafales de temps. Limiter le temps consacré à la collecte de base normalise le temps de chambre pour chaque souris.
Il est crucial que les expérimentateurs obtiennent une ligne de base appropriée qui englobe les valeurs de comportement au repos dans la souris, mais se produit également en temps opportun. Par conséquent, le but de ce rapport est de fournir une description des méthodes utilisées pour obtenir de courtes valeurs de base silencieuses pour les paramètres respiratoires chez les souris. De plus, nous rapportons que les apnées et les respirations augmentées peuvent être quantifiées pendant la première heure dans la chambre.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels du Collège Le Moyne. Toute utilisation des animaux était en accord avec les politiques décrites dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire8.
REMARQUE : (Critique) Avant l’expérimentation, obtenir toutes les approbations et la formation nécessaires à l’utilisation des animaux. Il est important que les expérimentateurs soient familiarisés avec les comportements de la souris et les niveaux d’activité, y compris les signes de sommeil, de détresse et/ou d’artefact de mouvement par rapport à l’inhalation et à la respiration normales.
1. Chambre barométrique de pléthysmographie du corps entier
- Lisez les manuels d’utilisation appropriés pour la chambre de pléthysmographie barométrique, y compris les connecteurs, les anneaux O, etc., et créez un fichier de protocole standard pour définir les analyseurs (p. ex., métaboliques) et les paramètres spécifiques au logiciel.
- Assurez-vous que tous les tuyaux et tubes sont connectés à la chambre. Connectez un tube de débit de gaz (flow-in) et un tube à vide (écoulement) directement à la chambre barométrique de pléthysmographie.
REMARQUE: L’afflux doit être attaché au flux de biaismarqué d’ouverture. - Attachez le CO2, les réservoirs de gaz O2et N2 au mélangeur à gaz. Assurez-vous que tous les réservoirs de gaz sont en position ouverte avant l’expérimentation.
2. Étalonnage de la Chambre barométrique du pléthysmographe
- Calibrer un débit élevé et faible de gaz en sélectionnant la configuration 7700-Amplificateur sous l’onglet Matériel du logiciel de pléthysmographie barométrique.
- Définissez un vide (flux hors de la chambre) approprié pour la conception expérimentale et les analyseurs de gaz (0,1 L/min).
REMARQUE: Le taux d’écoulement doit rester le même tout au long des étalonnages et expérimenter pour des enregistrements métaboliques précis. - Réglez un faible flux d’air en enlevant le tube d’écoulement de la chambre et en éteignant le vide.
- Enregistrez le flux zéro en entrant un 0 dans la cellule Low Unit pour la chambre correspondante. Double-cliquez sur la cellule Low Cal, changer l’heure à 3 s, et frapper Measure.
- Réattachez le tube d’écoulement et laissez le gaz (20,93% O2, équilibré N2) de circuler à travers la chambre barométrique de pléthysmographie du mélangeur à gaz.
- Convertir l’afflux de litres/minutes en millilitres/seconde. Cliquez sur la cellule High Unit pour la chambre correspondante et entrez la valeur en millilitres/seconde. Double-clic High Cal, changer l’heure à 3 s, et cliquez sur Mesure.
- Laissez l’onglet 7700-Amplifier Setup ouvert pour calibrer les analyseurs métaboliques au logiciel barométrique de pléthysmographie.
3. Étalonnage d’analyseur métabolique
- Dans le programme de mélangeur à gaz, réglez le mélangeur à gaz pour libérer un flux de gaz contenant 20,93% O2 et 79,07% N2.
- Sur les analyseurs métaboliques, définissez le niveau d’étalonnage O2 à 20,93% et le CO2 à lire 0%. Retournez le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs appropriées sont saisies.
- Réglez le pourcentage élevé D2. Cliquez sur l’onglet ABCD-4 du logiciel barométrique de pléthysmographie, puis entrez 20,93 sous Haute Unité de la ligne C2. Sous High Cal, changer l’heure à 3 s et hit Measure.
- Réglez le faible pourcentage de CO2. Entrez 0 sous Low Cal de la ligne C3, puis changez l’heure à 3 s et cliquez sur Mesure sous Low Cal.
- Dans le programme de mélangeur à gaz, changez la valeur O2 à 10 % et la valeur du CO2 à 5 %. Attendez plusieurs minutes que le débit de gaz s’adapte à ces valeurs. Sur les analyseurs métaboliques, tourner les boutons d’ajustement pour calibrer le CO2 égal à 5%. Assurez-vous de retourner le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs sont calibrées.
- Réglez le pourcentage élevé de CO2. Assurez-vous que les lectures d’analyseur sont stables avant d’insérer des valeurs appropriées dans le logiciel de pléthysmographie O2 et CO2 sur le logiciel de pléthysmographie barométrique. Cliquez sur High Unit sous C3 et entrez 5. Changez High Cal à 3 s et a frappé Measure.
- Réglez le faible pourcentage D2. Cliquez sur Low Unit sous l’option C2 et entrez 10. Cliquez sur Low Cal, entrée 3 s, et cliquez sur Mesure.
- Changez les valeurs gazeuses sur le mélangeur à gaz à 20,93% O2 et 79,07% N2. Attendez que la chambre s’adapte à ces valeurs pendant plusieurs minutes. Répétez les étapes 3.1-u20123.7 si les analyseurs métaboliques ne lisent pas automatiquement 20,93% O2 et 0% DE CO2, pour assurer un calibrage approprié. Confirmez régulièrement l’étalonnage approprié avec des réservoirs de gaz certifiés.
- Revérifier les compteurs de débit reliés à la chambre barométrique de pléthysmographie. Ajuster le débit d’air dans et hors de la chambre pour les taux appropriés à l’expérience (généralement, 0,1 à 0,3 L/min).
- Une fois que tous les paramètres ont été appliqués au logiciel de pléthysmographie barométrique, cliquez sur OK pour commencer l’enregistrement.
4. Pléthysmographie barométrique non retenue
- Enregistrez le poids de la souris et la température corporelle initiale. Attendez 10 min avant de placer la souris dans la chambre, pour recueillir des données O2 et CO2 à partir d’une chambre vide. Travaillez dans un endroit calme familier aux souris afin que le bruit et les odeurs n’interfèrent pas avec la collecte de données. Évitez toute perturbation possible, y compris l’ouverture et la fermeture des portes ou le personnel qui entre ou sort de la salle de collecte de données.
REMARQUE: Ce protocole spécifique a employé la souris mâle de 22 mois C57BL/6J. - Pendant la première heure, documentez les comportements de la souris et prenez des notes détaillées, y compris des valeurs spécifiques du flux à l’in/extérieur de la chambre.
- Après 60 min d’accoutumation de chambre, surveillez les segments de la respiration tranquille pendant les 60 minutes suivantes. Énumérez tous les segments d’une longueur d’au moins 15 s sans renifler et setoiletter. Prenez des mesures de température corporelle toutes les 10 minutes lorsque vous utilisez un dispositif implantable.
- À la fin de l’expérience, retirez la souris de la chambre et remettez-la dans sa cage. Tout l’équipement doit être nettoyé et nettoyé à fond. Si des gouttelettes d’eau subsistent, utilisez de l’air pressurisé pour les enlever.
5. Analyse du modèle de respiration et de métabolisme
- Ouvrez le dossier barométrique d’examen de la pléthysmographie et consultez les notes enregistrées pour l’animal d’intérêt.
- Ouvrez le panneau métabolique dans le logiciel et prenez la moyenne des 10 premières minutes de O2 et CO2, lorsque la chambre était vide. Enregistrez ces valeurs comme la FiO2 et fiCO2.
- Voir le panneau Flow du logiciel barométrique de pléthysmographie. Cliquez à droite Analysez les attributs et définissez les paramètres appropriés. Sous l’onglet Meta 1, entrez le FiO2 et fiCO2 de l’étape 5.2, ainsi que le flux dans la chambre sous Meta 2, pour calculer VO2 et VCO2.
- Pour le modèle d’analyse de respiration, confirmer les temps pour les 15 secondes de respiration tranquille en utilisant des notes sur le comportement animal aussi bien que le tracé du panneau de débit. Entrez les heures pour les intervalles de 15 s de respiration silencieuse sous Open Data Parser Dialogue à partir de l’onglet Data Parser. Cliquez sur le mode Parser View pour afficher uniquement les segments d intérêt spécifiques des 15 s.
- Cliquez sur Enregistrer les données dérivées parsed. Ouvrez le fichier de données dans une feuille de calcul pour obtenir les données binned.
6. Analyse des apnées et des respirations augmentées
- Dans le fichier d’examen ouvert, sortez le mode Parser View. Entrez dans l’option De configuration de graphique sous configuration 'gt; P3 Setup et sélectionnez Page View sous Type. Sélectionnez 5 pour le nombre de volets. Entrez -2 dans la boîte étiquetée Low et 2 dans la boîte étiquetée High pour les mesures de débit en millilitres/seconde. Appliquer les modifications.
- Faites défiler jusqu’à la marque de 30 minutes sur le panneau de traçage du débit.
- Comptez les apnées et les respirations augmentées pour les 30-60 minutes après que la souris a été placée dans la chambre. Quantifier les périodes de respiration en suspension d’une durée supérieure ou égale à 0,5 s, ce qui indique une apnée. Les respirations augmentées sont indiquées par une forte augmentation de la trace respiratoire au-dessus de 1,25 ml/s, suivie d’une forte diminution en dessous de -0,75 ml/s.
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Representative Results
Les résultats de l’UBP comme une évaluation du modèle de la respiration chez les souris âgées de 16 ans (22 mois) effectuées sous le gaz d’air normal (20,93% O2 avec N2équilibré ) sont rapportés. L’analyse comprenait d’abord une comparaison d’un segment de respiration silencieux plus long de 10 minutes (qui a pris plus de 2 h à obtenir) par rapport à la moyenne de quatre segments courts de 15 s (quantifiés en quelques minutes 60-120). Un tracé représentatif de la respiration silencieuse, où la respiration est compatible avec l’absence de comportements respiratoires actifs, est fourni dans la figure 1A. Lorsque des traces similaires sont recueillies auprès d’animaux, 100% des respirations doivent être acceptées par le logiciel. Cependant, la figure 1B représente la respiration d’un segment plus actif, où les souris explorent la chambre, reniflent et/ou se toilettent. Les traces semblables à celles indiquées dans la figure 1B sont moins susceptibles d’être acceptées par le logiciel et ne sont pas idéales pour le type de collecte de respiration utilisée et expliquée par cette méthodologie. Les paramètres sélectionnés pour l’évaluation des différences possibles de modèle de respiration entre les deux points de temps étaient la fréquence respiratoire(figure 2A), le volume de marée (VT, Figure 2B), ventilation minute (VE, figure 2C), volume de marée/rapport de temps inspiratoire (VT/Ti, figure 2D), et ratio de ventilation/dioxyde de carbone expulsé minute (VE/VCO2/g, figure 2E), qui ont tous été calculés à l’aide du logiciel de pléthysmographie barométrique et de l’équation Drorbaugh et Fenn. Les valeurs déclarées pour ces mesures sont dans la fourchette de ce que nous avons déjà signalé pour le modèle de souris6,9. Aucune différence significative n’a été élucidée entre les groupes; Corrections post hoc pour de multiples comparaisons de la fréquence respiratoire et des données VT ont été prises en compte avec Bonferroni(p 'lt; 0.025 a été considéré comme significatif). Ces résultats montrent que l’utilisation d’un protocole simplifié à l’aide des lignes de base de 15 s donne des résultats similaires à ceux d’un protocole de référence plus long.
Une analyse plus approfondie a été effectuée avec chacun des quatre segments de référence de 15 s pour la fréquence, VT, VE, VT/Ti, et VE/VCO2/g (figure 3). Aucune différence significative(p -gt; 0,05) entre l’un des points de temps ont été trouvés. Il n’y avait pas non plus de différences dans la variabilité entre l’un des quatre segments de temps pour une mesure de modèle de respiration. De plus, nous avons testé la variabilité du segment du groupe 15 s par rapport au groupe de 10 minutes et nous n’avons trouvé aucune différence significative en utilisant le test de Levene en comparant les données moyennes du groupe.
Le nombre d’apnées et de respirations augmentées observées pour chaque animal pendant les minutes 30-60 du protocole UBP sont présentés à la figure 4. Ces résultats montrent que les animaux âgés présentent un grand nombre d’apnées et la présence de respirations augmentées dans une envergure de 30 minutes (traçage indiqué dans la figure 1C). Les données sont indicatives des changements pendant le processus de vieillissement, car ces résultats ont été observés chez des souris de 22 mois. Pour confirmer la fiabilité de l’interrater pour l’apnée et les analyses d’haleine augmentée, la corrélation Pearson a été calculée pour deux chercheurs différents. Un degré élevé d’entente entre les évaluateurs a été trouvé, comme l’indique une valeur de 0,99 r pour les apnées et r 0,86 pour les respirations augmentées. Dans les études futures, un nombre accru d’apnées par rapport à un groupe témoin serait révélateur d’un dysfonctionnement respiratoire découlant d’un composant neuronal.
Figure 1: Traçages de flux représentatifs. (A) Suivi des flux à partir d’une ligne de base tranquille, où la souris ne présente aucun comportement actif tel que le reniflement ou le toilettage. (B) Suivi des flux à partir d’une période de respiration active non incluse dans nos analyses, où les souris se déplacent dans la chambre et de nombreux souffles ne sont pas systématiquement acceptés. (C) Traçage des flux affichant un souffle augmenté suivi d’une période d’apnée. Une fenêtre de 5 s est montrée pour toutes les traces. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Les paramètres respiratoires sont similaires pour les segments de respiration calme de 10 min et 15 s chez les souris de 22 mois. La pléthysmographie barométrique a été utilisée pour recueillir des données respiratoires chez les souris âgées(n - 16, 22 mois). Des données de respiration ont été calculées pour les souris pendant deux points de temps différents, à savoir la moyenne de quatre intervalles calmes de 15 s dans la marque de 60-120 min de la souris étant dans la chambre et pour 10 min de respiration calme cohérente. (A) Fréquence respiratoire (respirations/minute). (B) Volume de marée (VT; millilitres/souffle). (C) Ventilation minute (VE; millilitres/minute). (D) Ratio du volume des marées au temps d’inspiration (VT/Ti; millilitres/seconde). (E) Ratio de ventilation minute au dioxyde de carbone expulsé, normalisé au poids (VE/VCO2/g). Il n’y a pas de différences statistiquement significatives entre les groupes après les corrections post hoc(p -gt; 0,025). Les valeurs de 'gt;3 SD au-dessus de la moyenne ont été considérées comme aberrantes et supprimées de l’ensemble de données. Les données sont présentées comme moyennes et SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 3: Comparaison des intervalles de quatre 15 s. Les données de respiration ont été calculées chez les souris qui respirent calmement(n - 16, 22 mois) pour quatre intervalles distincts de 15 s dans les 60-120 min de placement de chambre. (A) Fréquence respiratoire (respirations/minute). (B) Volume de marée (VT; millilitres/souffle). (C) Ventilation minute (VE; millilitres/minute). (D) Ratio du volume des marées au temps d’inspiration (VT/Ti; millilitres/seconde). (E) Ratio de ventilation minute au dioxyde de carbone expulsé, normalisé au poids (VE/VCO2/g). Il n’y a pas de différences statistiquement significatives entre les segments de temps(p -gt; 0,05). Les valeurs aberrantes sont définies comme 'gt;3 SD au-dessus de la moyenne et enlevées. Les données sont présentées comme moyennes et SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 4: L’apnée et le nombre d’haleine augmentée chez les souris. Les apnées (0,5 s sans respiration) et les respirations augmentées (AB; une forte augmentation de l’inhalation de plus de 1,25 ml/s, suivie d’une forte expiration inférieure à -0,75 ml/s) ont été comptabilisées chez des souris âgées(n - 16, 22 mois) entre 30 et 60 min. Les dénombrements ont été analysés sur une période de 30 min et le total pour cette période est signalé. Les données sont présentées comme moyennes et SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 5: Schéma de la configuration barométrique effrénée de la pléthysmographie (UBP). La configuration globale de l’UBP devrait être similaire à celle décrite dans le chiffre. Les mesures de débit doivent être mesurées pour les gaz entrant et sortant de la chambre, et la composition du gaz doit être connue pour l’interprétation des données. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole fournit des informations concernant une ligne de base de respiration silencieuse chez les souris, ainsi que la collecte de données sur les apnées centrales et les respirations augmentées. Les résultats représentatifs montrent qu’une ligne de base tranquille de 10 min a un modèle similaire de respiration par rapport à une moyenne de quatre 15 s combats pour une cohorte de vieilles souris. Fait important, les 15 s ne sont pas statistiquement différents, et ces groupes n’ont pas de différences de variation les uns des autres en utilisant le test de Levene. Ces données démontrent que même un combat court est suffisant pour surveiller la respiration silencieuse. Cependant, il est tout à fait possible que l’analyse de la variation individuelle au sein d’une souris à 15 s vs 10 min peut entraîner des résultats différents, comme le combat de 10 minutes pourrait englober des activités minimales de renifler et de toilettage. Cependant, l’utilisation du test de Levene pour une comparaison des segments de base de souris individuels fournit une analyse différente de celle décrite dans ce protocole. Dans l’ensemble, la conception de cette méthodologie utilise 15 segments respiratoires qui peuvent être acquis pendant les minutes 60-120 dans la chambre, par rapport à avoir à attendre que chaque souris pour atteindre de plus longues durées de base calme.
La durée plus courte requise pour la ligne de base permet de tester des souches plus anxieuses/agitées de souris pour une respiration silencieuse. L’utilisation d’un segment de respiration plus long (c.-à-d. 10 ou 2 min) allonge la durée du protocole, à un point où un essai peut devoir être abandonné si les souris n’affichent pas une trace de respiration tranquille dans les 3 h. Étant donné que de nombreuses conceptions expérimentales intègrent également des défis respiratoires (c.-à-d. l’hypoxie), le temps prolongé alloué pour d’autres gaz souligne la nécessité d’uniformiser le temps de collecte de référence. L’utilisation d’un seul accès de 15 s de respiration tranquille aide à soulager le souci de travailler avec des souris (et des souches de souris) qui peuvent être particulièrement excitables dans la chambre. Tout en travaillant avec la pléthysmographie barométrique, nous avons constaté que 10 % des souris par étude devaient être exclues en raison de leur incapacité à effectuer aussi peu que 2 min de respiration silencieuse continue dans la chambre. La mise en œuvre des essais de familiarisation antérieurs n’a pas réussi à amener les souris à se calmer plus rapidement lorsqu’elles sont placées dans la chambre le jour de l’expérimentation. Cependant, parce que différentes souches, sexes, et âges des souris peuvent tous réagir différemment à l’environnement de chambre10,11, il est possible que les techniques d’accoutumation peuvent être utiles12,13 pour certaines cohortes. Nos essais de familiarisation ont consisté à placer les souris dans la chambre de l’UBP dans la salle d’essai pendant 1-2 h pendant plusieurs jours avant l’expérimentation. Bien que nous n’ayons observé aucun changement dans le comportement animal suivant cette procédure, une étude précédente a montré que 24 h d’accoutumance était nécessaire pour éliminer les effets de nouveauté ayant pour résultat l’activité physique spontanée chez les souris12. En outre, Kabir et coll. ont constaté que placer des cylindres en plastique de taille similaire à la chambre barométrique de pléthysmographie dans la cage à la maison était avantageux pour amener les rats à se familiariser avec les configurations avant l’expérimentation13.
Ce protocole révèle également le dysfonctionnement respiratoire possible chez les souris par la quantification des apnées centrales, indicatif des issues de contrôle neuronale. Trente minutes d’observation avant la collecte de base du modèle de respiration ont montré que les 16 souris âgées présentaient un grand nombre d’épisodes apnéiques et de respirations augmentées (représentées dans la figure 1C). Les nombreux apnées de cette cohorte de souris vieillies soulignent la capacité de ce protocole à quantifier une autre mesure respiratoire importante sans ajouter plus de temps à l’expérimentation. Il convient de noter que l’âge et la progression de la maladie (le cas échéant) peuvent affecter la présence et le nombre d’épisodes apnéiques.
Afin de caractériser la respiration tranquille, il est important d’observer en permanence la chambre et la souris barométriques de pléthysmographie tout au long de la durée du protocole. Pour la quantification de la respiration tranquille, les souris doivent être éveillées, mais ne pas participer à des comportements actifs tels que le reniflement, le toilettage ou l’exploration (représenté dans la figure 1A). Puisque les modèles de respiration pendant le sommeil peuvent différer de ceux d’un animal éveillé14,15, la collection de la respiration calme pendant l’état éveillé est critique. Il est possible que de plus longs segments de la respiration tranquille pourrait inclure des périodes de sommeil, qui peuvent ne pas être désirés en fonction de la conception expérimentale. Dans ce cas, des segments plus courts de la respiration tranquille serait idéal pour documenter, car la probabilité de collecte de données pendant le sommeil est réduite lorsque les segments actifs flanquent les courts (15 s) segments respiratoires silencieux. Nous avons observé que de plus longs segments de la respiration tranquille peuvent être difficiles à acquérir dans le modèle de souris, comme le comportement de la souris dans la chambre semble être très différent par rapport à celui des rats. Il est important à la fois d’observer de façon critique le flux respiratoire de souris pour des segments respiratoires appropriés et de documenter le comportement animal. En cas de ventilation réduite ou de respiration instable, cette méthode peut encore être utilisée. Dans ces cas, il est essentiel que l’expérimentateur soit aveuglé par la cohorte lors de la sélection des segments des 15 s. Le logiciel devrait distinguer les respirations, avec un taux d’acceptation de 100% au cours de la période de 15 s. Nous conseillons de prendre note des tracés de respiration en plus de s’assurer que les animaux répondent aux critères de comportement pour la ligne de base car il est possible que les souris stationnaires peuvent encore être anxieux. Une étude précédente a rapporté que bien que les rats aient montré le comportement calme, ils ont toujours montré des modèles de respiration altérés (c.-à-d., la fréquence accrue) en réponse aux stimulus contrôlés dans la salle d’essai13.
Les mesures de la fréquence, du VT, de la VE, du temps d’inspiration et de l’expiration, et de VE/VCO2 sont toutes quantifiées à l’aide d’analyseurs et du logiciel UBP et sont fréquemment rapportées dans la littérature. En particulier, les calculs VT et VE utilisent l’équation Drorbaugh et Fenn16, qui nécessite des valeurs connues pour la température corporelle, la température de la chambre ambiante, l’humidité et la pression barométrique. Il est recommandé de recueillir ces mesures tout au long de l’expérience pour les valeurs VT et VE les plus précises. D’autres variables qui sont calculées par le système doivent être utilisées avec prudence. L’UBP n’est pas une mesure directe de la mécanique pulmonaire; ainsi, les variables liées à la résistance aux voies respiratoires (p. ex., pause améliorée [Penh]) doivent être interprétées avec cette mise en garde à l’esprit5. D’autres composants de la configuration UBP qui peuvent avoir un impact sur les variables calculées par le logiciel comprennent les débits et l’étalonnage général du système. Confirmer que les joints et les joints fonctionnent correctement (sans fuite) et assurer une connexion appropriée de tout l’équipement à la chambre barométrique de pléthysmographie(figure 5). Les débits à l’autre et à l’extérieur de la Chambre devraient être uniformes. Les débits requis peuvent différer d’une configuration UBP à l’autre, il est donc important de vérifier ces valeurs avant l’expérimentation. Le débit dans la Chambre devrait suffire à présenter des défis en matière d’air frais ou de gaz en temps opportun. Le débit devrait également être suffisant pour permettre aux analyseurs métaboliques de mesurer O2 et CO2 sans avoir co2 s’accumulent dans l’environnement de la chambre, ce qui pose le risque d’un changement de modèle de respiration. De même, les étalonnages de mélangeur/analyseur de gaz doivent être régulièrement mis en œuvre pour s’assurer que les paramètres métaboliques sont mesurés avec précision.
D’autres considérations pour l’UBP conscient incluent la réduction des distractions dans la salle expérimentale pendant que les animaux sont testés. Les bruits forts, les différentes odeurs, et la présence de personnel non essentiel dans la salle peuvent tous ajouter aux comportements anxieux exposés par les souris. L’utilisation de plus petites pièces comme zones d’essai peut aider, mais si cela n’est pas possible, des murs en carton (avec une petite fenêtre d’observation) peuvent être installés autour de la chambre pour réduire les distractions pour les souris. L’activité électrique dans la pièce doit être maintenue au minimum afin d’éviter un bruit supplémentaire dans les tracés barométriques de pléthysmographie. Par conséquent, il est important de prendre note des tracés de flux pendant la période de 10 minutes lorsque le logiciel recueille des données à partir d’une chambre vide. Ces tracés doivent rester plats, et toutes les interruptions ou les légères vagues sont des signes de bruit et doivent être abordées. Les changements de pression découlant de l’ouverture et de la fermeture des portes ou du fonctionnement du CVC peuvent également ajouter à des fluctuations erronées, et il est essentiel de s’assurer que ces mesures se produisent au minimum (et de les noter lorsqu’elles se produisent) est essentielle. L’humidité peut également affecter le volume calculé des marées et la ventilation minute, ce qui rend très important de confirmer que la chambre et les tubes de raccordement sont séchés avant utilisation. Si nécessaire, l’utilisation de perles Drierite dans l’ordre avec les tubes d’écoulement peut aider à éliminer toute condensation dans l’air avant l’entrée de la chambre. Cette étape serait instituée dans les cas où l’humidité a été systématiquement plus élevée que les niveaux énumérés dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux8 (30 % à 70 %, idéalement dans un délai de 10 % du point fixe). L’humidité peut également s’accumuler dans la chambre en raison de la présence de l’animal. Bien qu’une certaine humidité soit normale, elle peut continuer à se développer si l’animal est excessivement actif ou placé dans la chambre pendant de plus longues durées. Si les niveaux d’humidité atteignent des niveaux maximaux (99,99 %), la chambre devra peut-être être ouverte et essuyée pendant l’expérimentation afin de maintenir des mesures respiratoires comparables. Le logiciel explique les changements dans la pression barométrique, la température ambiante, la température animale et l’humidité. La meilleure pratique consiste à maintenir les valeurs dans une fourchette raisonnable afin que les « pommes aux pommes » soient comparées entre les âges, les souches et les sexes. En outre, le cycle circadien des souris et la plage de temps des tests, ainsi que des conditions d’éclairage spécifiques de la salle, sont des détails importants à considérer13,17. Par exemple, nous testons généralement des souris dans l’éclairage semblable à leur salle d’habitation (cycle clair ou foncé) et dans une gamme de 3 h18. Les expérimentateurs doivent également rester aveuglés par les groupes d’animaux lors de la collecte et des analyses de données afin d’éviter les différences dans la sélection d’une ligne de base. Dans la mesure du possible, le même expérimentateur doit recueillir toutes les données et/ou analyser tous les tracés d’une expérience donnée. Les mesures prises pour garder les expérimentateurs aveuglés par les groupes d’animaux, ainsi que la randomisation et les tests à des moments similaires de la journée, sont cruciales pour la rigueur de l’enquête. En fin de compte, il y a des facteurs extrasants qui peuvent modifier les tracés de flux, et ces préoccupations devraient être prises en considération lors de l’exécution de l’UBP.
La méthode UBP est une technique utilisée pour caractériser le modèle de respiration chez la souris. Les mesures de base peuvent être recueillies dans les 2 h lors de l’utilisation d’un segment respiratoire de 15 s. Ici, nous rapportons une méthode qui peut être effectuée avec des souris âgées, qui sont souvent plus agités dans la chambre que les souris plus jeunes, suggérant que d’autres souches anxieuses ou actives de souris pourraient également être testées avec ce protocole. Les données recueillies auprès de l’UBP sont non invasives et permettent de tester sur plusieurs moments, ce qui est utile pour les études sur le vieillissement, la pharmacothérapie et la progression de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Angela Le, Sarah Ruby et Marisa Mickey pour leur travail de maintien des colonies animales. Ces travaux ont été financés par 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. pour soutenir le CN) et la Bourse de recherche de premier cycle McDevitt en sciences naturelles (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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