Summary
Безудержная барометрическая плетисмография используется для количественной оценки структуры дыхания у проснувающихся мышей. Мы показываем, что 15 сегментов в рамках стандартизированного протокола отображают аналогичные значения длительной продолжительности тихого дыхания. Эта методология также позволяет количественно количественно апноэ и увеличенные вдохи в течение первого часа в камере.
Abstract
Безудержная барометрическая плетисмография (UBP) является методом количественной оценки структуры дыхания мышей, где обычно сообщается частота дыхания, приливный объем и минутная вентиляция. Кроме того, может быть собрана информация о нервном выходе дыхания, включая наличие центрального апноэ и увеличенного дыхания. Важным фактором для UBP является получение дыхательного сегмента с минимальным воздействием тревожного или активного поведения, чтобы прояснить реакцию на проблемы с дыханием. Здесь мы представляем протокол, который позволяет получить короткие, тихие базовые линии у пожилых мышей, сравнимые с ожиданием более длительных приступов тихего дыхания. Использование более коротких сегментов времени является ценным, так как некоторые штаммы мышей могут быть все более возбудимыми или тревожными, и более длительные периоды тихого дыхания не могут быть достигнуты в разумные сроки. Мы поместили 22-месячных мышей в камеру UBP и сравнили четыре 15 сегментов тихого дыхания между минутами 60-120 и более длинным 10 минутами спокойного дыхания, который занял 2-3 ч, чтобы приобрести. Мы также получили количество центрального апноэ и увеличенные вдохи до тихого дыхания сегментов, после 30 минут периода ознакомления. Мы показываем, что 10 минут тихого дыхания сравнимо с использованием гораздо более короткой 15-й продолжительности. Кроме того, время, предшествуя этим 15 с тихого дыхания сегментов могут быть использованы для сбора данных о апноэ центрального происхождения. Этот протокол позволяет следователям собирать шаблон-дыхания данных в определенное количество времени и делает тихие базовые меры осуществимы для мышей, которые могут проявлять увеличение количества возбудимого поведения. Сама методология UBP обеспечивает полезный и неинвазивный способ сбора данных о шаблонах дыхания и позволяет мыши тестироваться в течение нескольких временных точек.
Introduction
UBP является распространенной техникой для оценки дыхательных узоров1,,2,23,,4. В этом методе мыши помещаются в закрытую камеру, где различия в давлении между основной камерой (где находится животное) и эталонной камерой, фильтруются через пневмотахограф для получения значений. Полученная установка UBP является неинвазивной и безудержной и позволяет оценить респираторные меры без необходимости анестезии или хирургического вмешательства. Кроме того, этот метод подходит для исследований, требующих нескольких измерений в одной и той же мыши с течением времени. Переменные, такие как частота дыхания, объем приливов и минутная вентиляция может быть количественно с помощью этого метода, во время одного испытания или в течение нескольких испытаний. UBP всего тела также обеспечивает измерения пиковых потоков и продолжительности дыхательного цикла. Вместе эти параметры количественно определить структуру дыхания. Записанные следы дыхания также позволяют просматривать данные и подсчитывать количество центральных апноэ, отображаемых в течение определенного периода времени. Это количество может быть использовано наряду с анализом приливного объема и inspiratory раз для оценки других изменений в структуре дыхания.
В то время как существует несколько неинвазивных методов плейсмографии для непосредственной оценки легочных физиологических параметров, UBP всего тела позволяет провести скрининг на дыхательную функцию с минимальным неоправданным стрессом для мыши. Головной плетисмографии, которая использует приливные меры среднего течения потока, а также неинвазивный, опирается на сдержанность, как и многие другие виды плетисмографии (например, двухкамерный плетисмографии). Хотя эти методы были использованы в моделях грызунов для измерения реакции дыхательных путей5, использование воротники шеи или небольшие удерживающие трубки могут занять мышей (по сравнению с другими видами) дольше, чтобы акклиматизироваться и вернуть свое дыхание к уровню отдыха.
Получение оптимального сегмента воздуходыша является важным фактором для базовых сравнений. Более широкое использование коммерчески доступных систем плейсмографии делает возможным сбор данных о шаблонах дыхания во многих лабораториях. Важно отметить, что структура дыхания является переменной на протяжении всего периода сбора, особенно для мышей. С указанной стороной необходимо стандартизировать базовый анализ как средство обеспечения того, чтобы уровень подготовки экспериментаторов не смуал результаты. Существует множество способов сбора сегмента дыхания воздуха, который служит одной из областей вариаций между экспериментальными проектами. Один пример включает в себя усреднение окончательного 10-30 мин данных после ранее определенного набора времени в камере1, в то время как другой метод включает в себя ожидание, пока мышь заметно спокойно в течение 5-10 мин6. Последний может занять 2-3 ч для достижения, а в некоторых случаях, судебное разбирательство, возможно, потребуется отказаться, если мышь не спокойна достаточно долго. Эта озабоченность является особенно важным фактором для штаммов мышей, где наблюдаемое поведение более тревожным и возбудимым7. Эти мыши могут занять больше времени, чтобы приспособиться к камере окружающей среды и только оставаться спокойным в течение коротких очередей времени. Ограничение времени, отведенного на базовую коллекцию, стандартизирует время камеры для каждой мыши.
Очень важно, чтобы экспериментаторы получили подходящий базовый участок, который включает в себя значения поведения отдыха в мыши, но также происходит своевременно. Таким образом, цель этого доклада заключается в предоставлении описания методов, используемых для получения коротких тихих базовых значений для дыхания параметров у мышей. Кроме того, мы сообщаем, что апноэ и увеличенные вдохи могут быть количественно в течение первого часа в камере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных колледжа Ле Мойн. Все использование животных было в согласии с политикой, описанной в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных8.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критически) До экспериментов, получить все необходимые разрешения и обучение, необходимые для использования животных. Важно, чтобы экспериментаторы были ознакомины с поведением и уровнем активности мыши, включая признаки сна, дистресса и/или артефакта движения против нормального нюхания и дыхания.
1. Барометрическая палата плейсмографии всего тела
- Прочитайте соответствующие руководства пользователя для барометрической камеры плетисмографии, включая разъемы, O-кольца и т.д., и создайте стандартный протокольный файл для определения анализаторов (например, метаболических) и параметров, характерных для программного обеспечения.
- Убедитесь, что все шланги и трубки подключены к камере. Соедините трубку потока газа (flow-in) и вакуумную трубку (выход) непосредственно к барометрической камере плейсмографии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приток должен быть прикреплен к потокусмещения открывания marked. - Прикрепите CO2,O2и N2 газовые баллоны к газовому смесителю. Убедитесь, что все газовые баллоны находятся в открытом положении до экспериментов.
2. Калибровка барометрической палаты плейзирования
- Калибрайте высокий и низкий поток газа, выбрав 7700-усилитель настройки под аппаратной вкладке барометрического программного обеспечения плетисмографии.
- Установите вакуум (выход из камеры), подходящий для экспериментальных проектных и газоанализаторов (0,1 л/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость оттока должна оставаться прежней на протяжении всей калибровки и экспериментировать для точных метаболических записей. - Установите низкий поток воздуха, удалив трубку потока из камеры и выключив вакуум.
- Запись нулевого потока, введя 0 в ячейку Low Unit для соответствующей камеры. Дважды щелкните ячейку Low Cal, измените время до 3 с и нажмите Measure.
- Прикрепите трубку потока и позвольте газу (20.93% O2,сбалансированному N2)течь через барометрическую камеру плетисмографии из газового смесителя.
- Преобразуйте приток из литров/минут в миллилиты в секунду. Нажмите ячейку High Unit для соответствующей камеры и введите значение в миллилитрах в секунду. Двойной щелчок High Cal,изменить время до 3 с, и нажмите Мера.
- Оставьте вкладку 7700-Amplifier Setup открытой для калибровки метаболических анализаторов в программное обеспечение барометрической плетисмографии.
3. Метаболический анализатор калибровки
- В газовой программе смесителя установите газовый смеситель для выпуска потока газа, содержащего 20,93% O2 и 79,07% N2.
- На метаболических анализаторов установите уровень калибровки O2 до 20,93%, а CO2 - до 0%. Поверните циферблат обратно в образец после ввода соответствующих значений.
- Установите высокий процент O2. Нажмите на вкладку ABCD-4 барометрического программного обеспечения плетилисмографии, а затем введите 20.93 под высоким блоком линии C2. Под High Cal, изменить время до 3 с и хит мера.
- Установите низкий процент CO2. Введите 0 под Low Cal линии C3, а затем изменить время до 3 с и нажмите Мера под Low Cal.
- В программе смесителя газа измените значение O2 до 10%, а значение CO2 до 5%. Подождите несколько минут, пока поток газа приспособится к этим значениям. На метаболических анализаторов, включите регулировки ручки для калибровки CO2 равна 5%. Не забудьте повернуть циферблат обратно в образец после откалибровки значений.
- Установите высокий процент CO2. Убедитесь, что показания анализатора стабильны перед вставкой соответствующих значений в O2 и CO2 на программное обеспечение барометрической плетисмографии. Нажмите высокой единицы под C3 и введите 5. Изменение High Cal до 3 с и хит мера.
- Установите низкий процент O2. Нажмите Низкий блок под опцией C2 и введите 10. Нажмите Низкий Cal, ввод 3 с, и нажмите Мера.
- Изменение значений газа на газовом смесителе обратно до 20,93% O2 и 79,07% N2. Подождите несколько минут, пока камера приспособится к этим значениям. Повторите шаги 3.1'u20123.7, если метаболические анализаторы автоматически не считывают 20,93% O2 и 0% CO2,чтобы обеспечить надлежащую калибровку. Регулярно подтверждайте надлежащую калибровку с сертифицированными газовыми баллонами.
- Перепроверить счетчики потока, подключенные к барометрической камере плейсмографии. Отрегулируйте поток воздуха в камеру и из нее на тарифы, подходящие для эксперимента (обычно, 0,1-0,3 л/мин).
- После того, как все настройки были применены к программному обеспечению барометрической плетисмографии, нажмите OK, чтобы начать запись.
4. Безудержная барометрическая плетисмография
- Запишите вес мыши и начальную температуру тела. Подождите 10 минут, прежде чем поместить мышь в камеру, чтобы собрать данные O2 и CO2 из пустой камеры. Работа в тихом районе, знакомом мышам, поэтому шум и запахи не мешают сбору данных. Избегайте возможных сбоев, включая открытие и закрытие дверей или перемещения персонала в/из комнаты сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом специальном протоколе использовался 22-месячный мужчина C57BL/6J mouse. - В течение первого часа документируйте поведение мыши и сделать подробные заметки, включая конкретные значения потока в/из камеры.
- После 60 минут камерного привыкания, следите за сегментами тихого дыхания в течение следующих 60 мин. Перечислите любые сегменты продолжительностью не менее 15 с в длину без обнюхивания иухода. Принимайте меры температуры тела каждые 10 минут при использовании имплантируемого устройства.
- В конце эксперимента выньте мышь из камеры и поместите ее обратно в клетку. Все оборудование должно быть тщательно очищено и вытерто. Если капли воды остаются, используйте воздух под давлением, чтобы удалить их.
5. Анализ модели дыхания и метаболизма
- Откройте барометрический файл проверки плетисмографии и проконсультируйтесь с записанными примечаниями для интересуемого животному.
- Откройте метаболическую панель в программном обеспечении и возьмите в среднем первые 10 минут O2 и CO2, когда камера была пуста. Запись этих значений, как FiO2 и FiCO2.
- Посмотреть панель потока программного обеспечения барометрической плетисмографии. Нажмите справа, проанализируйте атрибуты и установите соответствующие параметры. Под вкладкой Meta 1 введите FiO2 и FiCO2 со ступени 5.2, а также поток в камеру под Meta 2,чтобы рассчитать VO2 и VCO2.
- Для модели анализа дыхания, подтвердить время для 15 секунд тихого дыхания, используя заметки о поведении животных, а также отслеживание панели потока. Введите время для 15 с интервалами тихого дыхания под Open Data Parser Диалог из вкладки Data Parser. Нажмите Parser View Mode, чтобы показать только конкретные 15 сегментов интереса.
- Нажмите Сохранить Parsed полученных данных. Откройте файл данных в электронной таблице для получения связанных данных.
6. Анализ апноэ и дополненных дыханий
- В открытом файле обзора выйдите в режим Parser ViewMode . Перейти в Graph Настройка вариант под настройкой и P3 Настройка и выберите просмотр страницы под типом. Выберите 5 для количества стекол. Введите -2 в поле с пометкой Низкий и 2 в поле с пометкой High для измерения потока в миллилитрах в секунду. Примените изменения.
- Прокрутите до отметки 30 минут на панели отслеживания потока.
- Подсчитайте апноэ и увеличенные вдохи в течение 30-60 минут после того, как мышь была помещена в камеру. Количественная оценка периодов подвесного дыхания продолжительностью более или равна 0,5 с, что свидетельствует о апноэ. Дополненные вдохи указывают на резкий рост дыхания выше 1,25 м/с с последующим резким снижением ниже -0,75 м/с.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сообщается о результатах UBP как оценки структуры дыхания у 16 возрастных (22-месячных) мышей, выполняемых при нормальном воздушном газе (20,93% O2 со сбалансированным N2). Анализ первый включал в себя сравнение более 10 мин тихого дыхания сегмента (который взял более 2 ч, чтобы получить) по сравнению со средним и четыре коротких 15 s сегментов (количественно в течение нескольких минут 60-120). Репрезентативная отслеживание потока тихого дыхания, где дыхание согласуется с отсутствием активного дыхания поведения, обеспечивается в рисунке 1A. Когда аналогичные трассировки собираются с животных, 100% вдохов должны быть приняты программным обеспечением. Тем не менее, Рисунок 1B представляет собой дыхание из более активного сегмента, где мыши изучают камеру, нюхают, и / или уход. Трассировки, аналогичные тем, которые показаны на рисунке 1B, менее вероятно, будут приняты программным обеспечением и не идеально подходят для типа дыхательной коллекции, используемой и объясненной этой методологией. Параметры, выбранные для оценки возможных различий в структуре дыхания между двумя точками времени, были частотой дыхания(рисунок 2А),приливным объемом (VT, Рисунок 2B), минутная вентиляция (VE, Рисунок 2C),приливное соотношение времени объема/виспирационного времени (VT/Ti, Рисунок 2D),и минутноесоотношение вентиляции/изгнанного углекислого газа (VE/VCO2/g, Рисунок 2E),которые были вычисляются с помощью программного обеспечения барометрического плетизма и уравнения Drorbaugh и Fenn. Значения, сообщенные для этих мер, находятся в пределах того, что мы ранее сообщали для мыши модели6,,9. Существенных различий между группами не выявлено; после специальных исправлений для нескольких сравнений частоты дыхания и данных VT были учтены с Bonferroni(p qlt; 0.025 был рассмотрен значительным). Эти результаты показывают, что использование упрощенного протокола с использованием 15 базовых линий обеспечивает аналогичные результаты более длинного базового протокола.
Дальнейший анализ был проведен с каждым из четырех 15 базовых сегментов для частоты, VT, VE, VT/Ti, и VE/VCO2/g(рисунок 3). Никаких существенных различий(р. 0,05) между любым из временных точек не было найдено. Не было также никаких различий в изменчивости между любым из четырех временных сегментов для любой модели дыхания меры. Кроме того, мы проверили изменчивость сегмента группы 15 с по сравнению с группой 10 мин и не обнаружили существенных отличий с помощью теста Левена при сравнении усредненных данных группы.
Количество апноэ и увеличенных вдохов, наблюдаемых для каждого животного в течение минут 30-60 протокола UBP представлены на рисунке 4. Эти результаты показывают, что пожилые животные демонстрируют большое количество апноэ и наличие увеличенных вдохов в течение 30 минут (трассировка показана на рисунке 1C). Данные свидетельствуют об изменениях в процессе старения, так как эти выводы были отмечены у 22-месячных мышей. Чтобы подтвердить нетертертерную надежность апноэ и увеличенных анализов дыхания, корреляция Пирсона была рассчитана для двух разных исследователей. Была обнаружена высокая степень согласия между оценщиками, о чем свидетельствует значение r .99 для апноэ и r .86 для увеличенных вдохов. В будущих исследованиях, увеличение числа апноэ по сравнению с контрольной группой будет говорить о дисфункции дыхания, вытекающих из нервного компонента.
Рисунок 1: Отслеживание потока представителя. (A) Отслеживание потока из тихой базовой линии, где мышь не демонстрирует каких-либо активных поведений, таких как нюхание или уход. (B) Поток отслеживания от активного периода дыхания не включены в наши анализы, где мыши движутся по камере, и многие вдохи обычно не принимаются. (C)Отслеживание потока отображение увеличенного дыхания с последующим периодом апноэ. Окно 5 s отображается для всех следов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Параметры дыхания аналогичны для сегментов спокойного дыхания 10 мин и 15 с у 22-месячных мышей. Барометрическая плетисмография использовалась для сбора данных о дыхании у выдержан мышей(n No 16, 22 месяцев). Дыхательные данные были рассчитаны для мышей в течение двух различных точек времени, а именно в среднем четыре 15 с спокойных интервалов в течение 60-120 минут знак мыши, находящейся в камере и в течение 10 минут последовательного спокойного дыхания. (A) Частота дыхания (дыхания/минута). (B) Приливный том (VT; миллилитров/дыхание). (C) Минутная вентиляция (VE; миллилитры/минута). (D) Соотношениее приливного объема к времени вдохновения (VT/Ti; миллилитров/секунда). (E) Соотношение минутной вентиляции до углекислого газа исключено, нормализовано к весу (VE/VCO2/g). Статистически значимых различий между группами после специальныхp корректировок нет (р.г.; 0,025). Значения sgt;3 SD выше среднего были рассмотрены выбросы и удалены из набора данных. Данные представлены в виде среднего значения sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение четырех 15 с интервалами. Дыхательные данные были рассчитаны в спокойных дыхания мышей(n No 16, 22 месяцев) для четырех отдельных 15 с интервалами в течение 60-120 минут размещения камеры. (A) Частота дыхания (дыхания/минута). (B) Приливный том (VT; миллилитров/дыхание). (C) Минутная вентиляция (VE; миллилитры/минута). (D) Соотношениее приливного объема к времени вдохновения (VT/Ti; миллилитров/секунда). (E) Соотношение минутной вентиляции до углекислого газа исключено, нормализовано к весу (VE/VCO2/g). Статистически значимых различий между тайм-сегментами нет(р.; 0,05). Выбросы определяются как «gt;3 SD выше среднего и удаляются. Данные представлены в виде среднего значения sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Апноэ и увеличенное дыхание рассчитывает на мышей. Апноэ (0,5 с без дыхания) и увеличенные вдохи (АБ; резкое увеличение вдыхания свыше 1,25 мл/с с последующим резким выдохом ниже -0,75 мл/с) были подсчитаны у выдержанных мышей(п 16, 22 месяцев) в возрасте от 30 до 60 мин. Подсчеты были проанализированы более 30 минут, и общее количество за этот период времени сообщается. Данные представлены в виде среднего значения sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Схема безудержной барометрической установки плетисмографии (UBP). Общая настройка UBP должна быть аналогична той, которая описана на рисунке. Измерения потока должны быть измерены для газов, входящих и выходящих из камеры, и состав газа должен быть известен для интерпретации данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол содержит информацию о тихом дыхании базовых у мышей, а также сбор данных о центральных апноэ и увеличенных вдохов. Репрезентативные результаты показывают, что 10 мин тихий базовый имеет аналогичную картину дыхания по сравнению с в среднем четыре 15 с боями для когорты старых мышей. Важно отметить, что 15 s поединки статистически не отличаются, и эти группы не имеют различия в вариации друг от друга с помощью теста Левен. Эти данные свидетельствуют о том, что даже одного короткого боя достаточно для мониторинга тихого дыхания. Тем не менее, вполне возможно, что анализ отдельных изменений в мыши на 15 с против 10 мин может привести к различным выводам, как 10 мин бой может включать в себя минимальные нюхать и уход деятельности. Однако использование теста Левиндля для сравнения отдельных базовых сегментов мыши обеспечивает другой анализ, чем тот, который описан в этом протоколе. В целом, дизайн этой методологии использует 15 s дыхательных сегментов, которые могут быть приобретены в течение минут 60-120 в камере, по сравнению с того, чтобы ждать каждой мыши для достижения более длительного времени тихой базовой линии.
Более короткая продолжительность, необходимая для базового, позволяет более тревожным/агитированным штаммам мышей быть проверенными на тихое дыхание. Использование более длинного дыхательного сегмента (т.е. 10 или 2 мин) удлиняет продолжительность протокола, до такой степени, что испытание может потребоваться отказаться, если мыши не показывают тихий дыхательный след в пределах 3 ч. Поскольку многие экспериментальные проекты также включают респираторные проблемы (т.е. гипоксию), расширенное время, отведенное для других газов, подчеркивает необходимость стандартизации базового времени сбора. Использование одного 15 s бой тихого дыхания помогает облегчить озабоченность работы с мышами (и штаммов мышей), которые могут быть особенно возбудимы в камере. Во время работы с барометрической плетисмографией, мы обнаружили, что 10% мышей за исследование должны были быть исключены из-за их неспособности выполнить всего лишь 2 мин непрерывного тихого дыхания в камере. Реализация предыдущих ознакомительных испытаний была неудачной в получении мышей успокоиться быстрее, когда помещается в камеру в день экспериментов. Однако, поскольку различные штаммы, полы, и возраст мышей все могут по-разному реагировать на камерной среде10,11, вполне возможно, что методы привыкания могут быть полезны12,13 для некоторых когорт. Наши ознакомительные испытания состояли из размещения мышей в камере UBP в испытательном зале в течение 1-2 ч в течение нескольких дней до экспериментов. Хотя мы наблюдали никаких изменений в поведении животных после этой процедуры, предыдущее исследование показало, что 24 ч привыкания было необходимо для устранения новизны эффекты в результате спонтанной физической активности у мышей12. Кроме того, Kabir et al. обнаружили, что размещение пластиковых цилиндров, похожих по размеру на барометрическую зал плетьсмографию в домашней клетке, было выгодно в получении крыс, чтобы ознакомиться с установками до экспериментов13.
Этот протокол также раскрывает возможную дыхательную дисфункцию у мышей через количественную оценку центрального апноэ, что свидетельствует о проблемах нервного контроля. Тридцать минут наблюдения до базовой коллекции шаблонов дыхания показали, что все 16 возрастных мышей отображаются большое количество апноэ эпизодов и увеличенных вдохов (представлено на рисунке 1C). Многочисленные апноэ в этой возрастной когорты мыши подчеркнуть способность этого протокола количественно другой важной меры дыхания без добавления дополнительного времени для экспериментов. Следует отметить, что прогрессирование возраста и заболевания (если это применимо) может повлиять на наличие и количество апноэ эпизодов.
Для того, чтобы охарактеризовать тихое дыхание, важно постоянно наблюдать барометрическую камеру плетисмографии и мышь на протяжении всего срока действия протокола. Для количественной оценки тихого дыхания, мыши должны бодрствовать, но не участвовать в любых активных поведениях, таких как нюхать, ухаживать, или исследовать (представлено на рисунке 1A). Так как модели дыхания во время сна могут отличаться от тех, в бодрствующее животное14,15, сбор спокойного дыхания во время бодрствования состояние имеет решающее значение. Вполне возможно, что более длинные сегменты тихого дыхания могут включать периоды сна, которые не могут быть желаемыми в зависимости от экспериментального дизайна. В этом случае, короткие сегменты тихого дыхания было бы идеально подходит для документирования, так как вероятность сбора данных во время сна уменьшается, когда активные сегменты фланг короткие (15 s) тихое дыхание сегментов. Мы заметили, что более длинные сегменты тихого дыхания может быть сложной задачей, чтобы приобрести в мышиной модели, как поведение мыши в камере, кажется, очень отличается по сравнению с крысами. Важно как критически наблюдать поток дыхательных путей мыши для соотвествующего дыхательных сегментов и документировать поведение животного. В случаях снижения вентиляции или нестабильного дыхания, этот метод все еще может быть использован. В этих случаях, важно экспериментатор ослеплен когорты при выборе 15 s сегментов. Программное обеспечение должно различать дыхание, с скоростью принятия 100% в течение 15 с периодом. Мы советуем принимать к сведению отслеживания дыхания в дополнение к обеспечению того, чтобы животные отвечают поведенческим критериям для базового, поскольку вполне возможно, что стационарные мыши могут по-прежнему беспокоиться. Предыдущее исследование сообщило, что, хотя крысы выставлены спокойное поведение, они по-прежнему показали измененные структуры дыхания (т.е. увеличение частоты) в ответ на контролируемые раздражители в испытательном зале13.
Измерения частоты, VT, VE, время истечения истечения срока годности, и VE/VCO2 все количественно с помощью анализаторов и программного обеспечения UBP и часто сообщается в литературе. В частности, расчеты VT и VE используют уравнение Drorbaugh и Fenn16,которое требует известных значений температуры тела, температуры окружающей камеры, влажности и барометрического давления. В ходе эксперимента рекомендуется собирать эти меры для наиболее точных значений VT и VE. Другие переменные, которые рассчитываются системой, следует использовать с осторожностью. UBP не является прямым мерилом легочной механики; таким образом, переменные, связанные с сопротивлением дыхательных путей (например, расширенная пауза) следует интерпретировать с учетом этого предостережения5. Дополнительные компоненты установки UBP, которые могут влиять на переменные, рассчитанные программным обеспечением, включают скорость потока и общую калибровку системы. Подтвердите, что уплотнения и прокладки работают должным образом (без утечек) и обеспечивают надлежащее подключение всего оборудования к барометрической камере плейсмографии(рисунок 5). Скорость потока в камере и за ее выходом должна быть согласована. Требуемые скорость потока могут отличаться между установками UBP, поэтому важно проверить эти значения до экспериментов. Скорость потока в камеру должна быть достаточной, чтобы обеспечить свежий воздух или газ проблемы своевременно. Скорость потока также должна быть достаточной для того, чтобы метаболические анализаторы измеряли O2 и CO2 без наличия CO2, накопленного в камерной среде, что создает риск изменения структуры дыхания. Аналогичным образом, калибровки газоциографа/анализатора должны регулярно внедряться для точного измерения метаболических параметров.
Другие соображения для сознательного UBP включают уменьшение отвлекающих факторов в экспериментальной комнате в то время как животные проходят испытания. Громкие звуки, различные запахи, и наличие несущественного персонала в комнате все может добавить к тревожным поведением выставлены мышей. Использование небольших комнат в качестве испытательных площадок может помочь, но если это невозможно, картонные стены (с небольшим окном просмотра) могут быть созданы вокруг камеры, чтобы облегчить отвлекаться на мышей. Электрическая активность в помещении должна быть как минимум сохранена, чтобы предотвратить дополнительный шум в барометрической трассировке плейсмографии. Поэтому важно принять к сведению отслеживание потока в течение 10 минут, когда программное обеспечение собирает данные из пустой камеры. Эти трассировки должны оставаться плоскими, а любые перерывы или небольшие волны являются признаками шума и должны быть решены. Изменения давления от открытия и закрытия дверей или от функционирования HVAC также могут добавить к ошибочным колебаниям, и обеспечение того, чтобы эти действия происходили минимально (и задев их, когда они происходят) имеет решающее значение. Влажность может также влиять на расчетный объем приливов и минутную вентиляцию, что делает его очень важным, чтобы подтвердить, что камера и соединительные трубки высушиваются перед использованием. При необходимости использование бусин дририта в последовательности с трубами потока может помочь удалить весь конденсационный контур в воздухе до входа в камеру. Этот шаг будет введен в тех случаях, когда влажность обычно была выше, чем уровни, перечисленные в Руководстве по уходу и использованию животных8 (30%-70%, в идеале в пределах 10% от установленной точки). Влажность может также накапливаться в камере из-за присутствия животного. Хотя некоторая влажность является нормальным, он может продолжать строить, если животное является чрезмерно активным или помещены в камеру в течение более длительного времени. Если уровень влажности достигает максимальных уровней (99,99%), камера, возможно, потребуется открыть и стереть во время экспериментов для поддержания сопоставимых показателей дыхания. Программное обеспечение учитывает изменения барометрического давления, температуры окружающей среды, температуры животных и влажности. Наилучшая практика заключается в поддержании значений в пределах разумного диапазона, так что "яблоки к яблокам" в настоящее время по сравнению между возрастами, штаммов и полов. Кроме того, циркадный цикл мышей и временной диапазон тестирования, а также специфические условия освещения комнаты, являются важными деталями для рассмотрения13,17. Например, мы обычно тестируем мышей на освещении, похожем на их жилище (свет или темный цикл) и в пределах диапазона 3 ч18. Экспериментаторы также должны оставаться слепыми к группам животных во время сбора данных и анализа, чтобы предотвратить различия в выборе базового. Когда это возможно, один и тот же экспериментатор должен собрать все данные и/или проанализировать все трассировки в данном эксперименте. Меры по ослеплению экспериментаторов с группами животных, а также рандомизация и тестирование в аналогичное время суток имеют решающее значение для строгости расследования. В конечном счете, существуют посторонние факторы, которые могут изменить отслеживание потока, и эти проблемы следует учитывать при выполнении UBP.
Метод UBP является метод, используемый для характеристики модели дыхания у мышей. Базовые показатели могут быть собраны в течение 2 ч при использовании 15 s дыхательного сегмента. Здесь мы сообщаем метод, который может быть выполнен с пожилыми мышами, которые часто более взволнованы в камере, чем молодые мыши, предполагая, что другие тревожные или активные мыши штаммы также могут быть проверены с этим протоколом. Данные, собранные из UBP является неинвазивным и позволяет для тестирования в течение нескольких точек времени, что полезно для исследований о старении, медикаментозной терапии и прогрессирования заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Анжелу Ле, Сару Руби и Марису Микки за их работу по поддержанию колоний животных. Эта работа была профинансирована 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. для поддержки CNR), и McDevitt бакалавриат научно-исследовательской стипендии в естественных науках (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
