Summary
يصف هذا العمل التوليف والتوصيف لـ pomalidomide القائم على، ثنائي ة وظيفية هومو-بروتك كنهج جديد للحث على كل مكان وتدهور E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN)، وهو الهدف من النظائر الثاليدوميد.
Abstract
الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وافقت جميع ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج الورم النقوي المتعدد، والحث على كل مكان وتدهور عوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3) عن طريق سيريبلون (CRBN) E3 يوبيكويتين الرباطي للتدهور البروتياسومال. وقد استخدمت مؤخرا IMiDs لتوليد التحلل البروتيوليسي ثنائي وظيفية التي تستهدف chimeras (PROTACs) لاستهداف البروتينات الأخرى للتدهور في كل مكان وبروتياسومال من قبل الرباط يَكِنْ ر. بنُ3. قمنا بتصميم وتوليف PROTACs المتجانسة القائمة على pomalidomide وحللت قدرتها على الحث على توجيه ذاتي في كل مكان وتدهور CRBN. هنا, CRBN بمثابة على حد سواء, وE3 في كل مكان ligase والهدف في نفس الوقت. مركب هومو-بروتك 8 يتحلل CRBN مع فعالية عالية مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على IKZF1 و IKZF3. لم يكن للتعطيل CRBN بواسطة مركب 8 أي تأثير على صلاحية الخلية وانتشار خطوط الخلايا النقوية المتعددة المختلفة. هذا homo-PROTAC يلغي آثار IMiDs في خلايا الورم النقوي متعددة. ولذلك، قد تساعد مركباتنا المستندة إلى بوماليدوميد المتجانسة على تحديد الركائز الذاتية والوظائف الفسيولوجية لـ CRBN والتحقيق في الآلية الجزيئية للـ IMiDs.
Introduction
الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وكلها معتمدة لعلاج الورم النقوي المتعدد، وربط E3 يوبيكويتين ligase cereblon (CRBN)، محول الركيزة لcullin4A-RING E3 في يوبيكويتين ligase (CRL4CRBN)1،2،3. ربط IMiDs يعزز تقارب CRL4CRBN لعوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3)، مما يؤدي إلى كل مكان والتدهور (الشكل1)4،5، 6 , 7 , 8.منذ IKZF1 و IKZF3 ضرورية لخلايا الورم النقوي متعددة, نتائج تعطيلها في تثبيط النمو. تم العثور على SALL4 مؤخرا كالركيزة الجديدة التي يسببها IMiD من CRBN التي من المرجح أن تكون مسؤولة عن المسخ وما يسمى كارثة Contergan في 1950s الناجمة عن الثاليدوميد9،10. وعلى النقيض من ذلك، فإن الكازين كيناز 1α (CK1α) هو الركيزة الخاصة بالليناليدوميد من CRBN التي تورطت في التأثير العلاجي في متلازمة خلل التنسج النخاعي مع حذف كروموسوم 5q11.
إن قدرة الجزيئات الصغيرة على استهداف بروتين معين للتحلل هي دلالة مثيرة على تطوير الأدوية الحديثة. في حين تم اكتشاف آلية الثاليدوميد ونظائرها بعد استخدامها لأول مرة في البشر، ما يسمى Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) وقد تم تصميمها لاستهداف على وجه التحديد بروتين من الفائدة (POI) (الشكل 2)12،13،14،15،16،17،18. PROTACs هي جزيئات heterobifunctional التي تتكون من ligand محددة لPOI متصلة عن طريق رابط إلى الرباط من الليغا سمعة E3 ubiquitin مثل CRBN أو فون هيبل لينداو (VHL)18,19,20, 21،22. PROTACs الحث على تشكيل مجمع ثلاثي عابر، وتوجيه POI إلى الليغا في كل مكان E3، مما أدى إلى وجود في كل مكان والتدهور البروتياسومال. المزايا الرئيسية لPROTACs على مثبطات التقليدية هو أن ملزمة لPOI كافية بدلا من تثبيط لها، وبالتالي PROTACs يمكن أن تستهدف مجموعة أوسع بكثير من البروتينات بما في ذلك تلك التي كانت تعتبر غير قابلة للمخدرات مثل [ ترجمفب 15] وبالإضافة إلى ذلك، تعمل جزيئات الشميرية بشكل حفاز، وبالتالي يكون لها قوة عالية. بعد نقل ubiquitin إلى POI، ينفصل المجمع الثلاثي وهو متاح لتشكيل مجمعات جديدة. وهكذا، تركيزات PROTAC منخفضة جدا كافية لتدهور البروتين المستهدف23.
هنا نقوم بوصف التوليف من pomalidomide-pomalidomide مترافق homo-PROTAC (مجمع 8) أن يجند CRBN لتدهور نفسها24. وE3 ubiquitin ligase CRBN بمثابة كل من المجند والهدف في نفس الوقت (الشكل3). للتحقق من صحة بياناتنا، قمنا أيضًا بتوليف عنصر تحكم سلبي ملزم (مركب 9). وتؤكد بياناتنا أن هومو-بروتك التوليف حديثا ً محدد لتدهور CRBN ولا له سوى آثار طفيفة على البروتينات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد جزيئات بروتك
تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه المرادفات سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية.
- إعداد tert-butyl N-(2,6-ديوكسو-3-piperidyl) كارباميت (مركب 1)
- إضافة 1,1'-كاربونيلديميدازول (1.95 غرام، 12 مليمول) وكمية حفازة من 4-(ثنائي ميثيل أمينو)بيريدين (5 ملغ) إلى خليط من Boc-Gln-OH (2.46 غرام، 10 ملمول) في THF (50 مل) في 100 مل قارورة أسفل جولة مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج في الجزر لمدّة 10 ساعة مع التحريك حتى يتمّ التوصل إلى حل واضح.
- إزالة المذيب تحت ضغط منخفض مع المبخر الدوارة، إضافة EtOAc (200 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل) وجففها فوق Na2SO4.
- تصفية الحل من خلال لوحة قصيرة من هلام السيليكا (5 سم قطرها وارتفاع 5 سم) وeluate مع حجم إضافي (200 مل) من EtOAc.
- تتبخر المذيبات وتجف الصلبة التي تم الحصول عليها عديم اللون في vacuo.
- إعداد tert-butyl N-(1-ميثيل-2،6-ديوكسو-3-بيبيريديل) كارباميت (مركب 2)
- الجمع بين مركب 1 (2.28 غرام، 10 مليمول) مع كربونات البوتاسيوم المطحون (2.76 غرام، 20 مليمول) وDMF (25 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل. إضافة يودوميثان (1.42 غرام، 0.62 مل، 10 مل) قطرة الحكمة باستخدام حقنة وتجهيز قارورة مع الحاجز المطاطي المثقوب. وضع وعاء رد الفعل في حمام ultrasonication لمدة 2 ح.
- تمييع خليط التفاعل مع EtOAc (100 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ 1 N NaOH (2x 25 مل)، H2O (25 مل)، ومحلول ملحي (25 مل)، وجففها على Na2SO4.
- تصفية وتبخر المذيب. تنقية المنتج عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (6 سم قطر العمود وارتفاع 20 سم) باستخدام الأثير النفط / EtOAc (2:1).
- إعداد 2-(2,6-ديوكسوبيبريدين-3-yl)-4-فلوروإيزويندولين-1,3-ديون (مركب 3)
- الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 1 (1.14 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مل) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
- بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
- إعداد 4-فلورو-2-(1-ميثيل-2،6-ديوكسوبيبريدين-3-yl) إيزويندولين-1،3-ديون (مركب 4)
- الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 2 (1.21 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مليمول) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
- بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
- إعداد tert-butyl N-[2-2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (compound 7)
- شحن قارورة أسفل جولة 50 مل مع tert-butyl N-[2-2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0.41 g, 1.65 mmol), compound 3 (0.41 g, 1.50 mmol), DMF الجافة (10 مل) وDIPEA (0.39 غرام, 0.51 مل, 3.0 مل). تجهيز مع شريط تحريك ومكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
- بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،مرشح، والتركيز في vacuo.
- تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 60 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:1 إلى 1:2).
- إعداد هوموديمر (مركب 8)
- الجمع بين α،ω-ديامين linker 6 (0.22 غرام، 0.22 مل، 1.50 مل)، ديبا (1.05 مل، 6.00 مل مول) وحل 3 (0.83 غرام، 3.00 مل) في DMSO الجافة (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،وتصفية والتركيز في vacuo.
- تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
- إعداد هيتروديمر (مركب 9)
- حل مركب 7 (0.83 غرام، 1.65 مليمول) في CH الجافة2كل2 (10 مل). يُضاف حمض ثلاثي فلورو سيتيك (10 مل) ويُحرّك المزيج الأصفر عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في قارورة سفلية مستديرة بمقدار 50 مل.
- إزالة المتطايرات وcoevaporate مع CH2Cl2 (4X 5 مل). تجفيف بقايا في vacuo لمدة 10 ساعة.
- إعادة إذابة المواد في DMF الجافة (20 مل). إضافة مركب 4 (0.44 غرام، 1.50 مليمول) وDIPEA (0.78 غرام، 1.05 مل، 6.00 مل) وتجهيز قارورة مع مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
- بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع المشبعة NaHCO3 (50 مل)، H2O (50 مل)، 10٪ KHSO4 (50 مل)، H2O (50 مل)، ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،فلتر والتركيز في vacuo.
- تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
- توضيح هيكل الجزيء والتحقق منه (مركبالشكل 5A 8،مركب 5B 9)بواسطة 1H NMR و 13C NMR الأطياف في DMSO-d6 على الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف. تحقق من أن نقاء كلا المركبين أعلى من 97٪ عن طريق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)، وتطبيق الكشف عن صفيف الصمام الثنائي (DAD) في 220-500 نانومتر.
2. التحقق الوظيفي من جزيئات بروتك
- تحليل اللطخة الغربية لتدهور CRBN من قبل PROTACs
ملاحظة: آثار مركب8ومجمع9على مستوى البروتين CRBN تم اختبارها من قبل تحليل وصمة عار الغربية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تأكيد التأثير على مستويات IKZF1 و IKZF3 (الشكل 6).-
إعداد العينات
- حل المركبات 8 و 9، lenalidomide (لين) ، pomalidomide (بوم) ، MG132 ، وMLN-4924 في DMSO بتركيز 10 MM ، aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
- البذور 1 × 106 خلايا MM1S في لوحة 6 جيدا مع وسائل الإعلام 2.5 مل وعلاج الخلايا مع 100 nM أو 1 مجمع ميكرومتر 8 أو 9 لمدة 24 ساعة.
- خلايا الحصاد بعد المعالجة والطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية مع الباردة 1X PBS لإزالة الوسائط المتبقية، الطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- خلايا الليس في التحلل العازلة (25 mM تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، 150 مل NaCl، 1٪ NP-40، 1 MM EDTA، 5٪ الجلسرين، 1X البروتياز وPhosphatase كوكتيل المانع) لمدة 10 دقائق على الجليد، الطرد المركزي في 320 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية. حصاد supernatant وتحديد تركيز البروتين عن طريق اختبار بروتين حمض bicinchoninic (اختبار BCA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- البروتينات تشوه (15-30 ميكروغرام / عينة) مع 1X LDS تحميل العازلة (5٪ 2-mercaptoethanol) ويغلي 10 دقيقة، 75 درجة مئوية.
-
SDS-PAGE
- إصلاح ساندويتش هلام مع هلام فصل 10٪ [4 مل 3X هلام العازلة (3 M تريس / حمض الهيدروكلوريك، 0.3٪ (ث / الخامس) كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، درجة الحموضة 8.45)، 4 مل أكريلاميد 30٪، 2.52 مل الجلسرين 50٪، 1.395 مل H2O، 75 ميكرولتر 11٪ كبريتات الأمونيوم (APS)، و 9.75 ميكرولتر TEMED] و هلام التراص 4٪ [1.992 مل 3X هلام العازلة، 0.792 مل 30٪ أكريلاميد، 3.168 مل H2O، 36 ميكرول 11٪ APS، و 6 درجة مئوية TEMED] في وحدة تجميع القطب الكهربائي. إزالة أمشاط، وآبار دافق مع العازلة الكاثود (100 MM تريس / حمض الهيدروكلوريك، 100 mM tricine، 0.1٪ (ث / الخامس) SDS)، وتحميل العينات.
- ملء المخزن المؤقت الأنود (100 mM Tris/HCl، الحموضة 8.9) في الخزان. تحميل عينة البروتين من الخطوة 2.1.1.4 وتشغيل SDS-PAGE في 70 V، 20 دقيقة، تليها 115 V، 150 دقيقة في الجهد المستمر.
-
مناعة والكشف عن CRBN، IKZF1 و IKZF3
- تنشيط غشاء PVDF (0.45 ميكرومتر) في الميثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة. غشاء Equilibrate وفصل هلام في 1X نقل العازلة [10X نقل العازلة (192 مل غليسين، 25 mM تريس قاعدة / حمض الهيدروكلوريك، 900 مل H2O)، 20٪ الميثانول، 0.1٪ SDS، pH 8.3].
- تجميع كاسيت النشاف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل هلام في 180 مأ لمدة 90 دقيقة.
- غسل غشاء 3X في 1X TBS-T (25 MT Tris / HCl، 150 مل NaCl، درجة الحموضة 7.6، 0.1٪ توين 20) لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كتلة غشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون (NFDM)، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان غشاء مع الأجسام المضادة الأولية لCRBN (1:500 في 5٪ BSA، TBS-T) مع هز لطيف في 4 درجة مئوية، بين عشية وضحاها.
- غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الغشاء الحضانة مع المضادة للماوس (1:10.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) أو المضادة للأرنب (1:5.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب الفجل peroxidase HRP (1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.)
- غسل غشاء 2X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين مع TBS 1x.
- احتضان غشاء لمدة 2 دقيقة مع حل الركيزة HRP وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة والكشف عن chemiluminescence في جهاز الكشف عن chemiluminescence.
- غسل غشاء 1X في 1X TBS لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. للإفراج عن الأجسام المضادة، غشاء الشريط في المخزن المؤقت تجريد المتاحة تجاريا لمدة 15 دقيقة.
- إعادة حظر الغشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة وإعادة التحقيق مع IKZF1، IKZF3 أو توبولين وفقا للخطوة 2.1.3.4.
-
إعداد العينات
- تجارب المنافسة مع MG132، MLN4942 أو pomalidomide
ملاحظة: للتأكد من ما إذا كان CRBN المتدهورة عبر مسار ubiquitin-proteasome، قمنا بإجراء تجارب المنافسة مع مثبطات بروتياسوم MG132ومثبط تنشيط الإنزيم (NAE) MLN4942 (الشكل 7).- البذور 1 × 106 MM1S الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا. خلايا الإنقراض مع 10 ميكرومتر MG132، 10 μM MLN4942، أو lenalidomide (100x)، وحضانة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- إضافة 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- خلايا الحصاد لللطخة الغربية وفقا للخطوة 2.1.1.
- اختبار صلاحية الخلايا في خطوط خلايا الورم النقوي المتعددة
ملاحظة: يتم استخدام هذا الفحص لاختبار التأثير على قدرة الخلية على البقاء، بالإضافة إلى ذلك، تعادي تأثير IMiDs على خلايا الورم النقوي المتعددة عن طريق المعالجة المسبقة للخلايا مع المركب 8 (الشكل 8، الشكل 9A ، B).- البذور 5 × 104 خلايا MM1S لكل بئر في لوحة 96 جيدا في triplicates البيولوجية للحصول على اختبار الصلاحية. لتحليل وصمة عار الغربية، البذور 1 × 106 خلايا MM1S في بئر في لوحة 6 جيدا في triplicates البيولوجية.
- علاج الخلايا مع DMSO أو 100 nM، 1 μM، أو 10 م مركب 8،مركب 9 أو pomalidomide وحضانة لمدة 24 ساعة، 48 ساعة، أو 96 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. لتجارب الإنقاذ، علاج الخلايا مع 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة، قبل أو بعد إضافة 1 μM pomalidomide وحضانة لمدة 96 ساعة.
- قياس الإنارة لوحة 96 جيدا مع اختبار صلاحية الخلية الإنارة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة على قارئ لوحة أو خلايا الحصاد من لوحة 6-جيدا لتحليل وصمة عار الغربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا وصفنا تصميم، والتوليف والتقييم البيولوجي لPROTAC المستندة إلى pomalidomide المتجانسة لتدهور CRBN. يتفاعل PROTAC لدينا في وقت واحد مع اثنين من جزيئات CRBN وتشكل المجمعات الثلاثية التي تحفز على التحلل الذاتي في كل مكان وتدهور البروتياسومال من CRBN مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على الركائز الجديدة التي يسببها pomalidomide IKZF1 أو IKZF3.
من سلسلة من الجزيئات PROTAC pomalidomide التي نشرت سابقا24، وكان مركب 8 فعالة بشكل خاص في التحلل الناجم عن المواد الكيميائية من CRBN. ويمكن إنجاز تركيبه علىالنحو التالي (الشكل 4). التكثيف 1,1'-كاربونيلديميدازول الترويج من البوك المحمية l-الجلوتامين يؤدي إلى إيميد cyclized 1. يمكن الوصول إلى التناظرية N-methylated 2 من خلال الألكلة مع يوديد الميثيل. يتم تحويل كل من لبنات البناء (1 و 2)،بعد N-إزالة الحماية في ظل الظروف الحمضية، إلى مشتقات الفطاميد (3 و 4)في سياق رد فعل فتح حلقة / إعادة التدوير باستخدام 3- أنهيدريد فلوروفثاليك. نظائر الثاليدوميد، بشكل عام، عرضة للتحلل المائي وينبغي أن تستخدم فقط في الخطوة التالية بعد التجفيف الكافي. مركب 3 عرضة لاستبدال النيوكليوفيليك العطرية مع الأمينات العليفية الأولية25; تم العثور على هذا التحويل للمضي قدما بكفاءة فقط عندما يتم استخدام المذيبات الجافة. تصميم منتج متجانس حقيقي ينطوي على اتصال الرابط من اثنين من الهياكل الفرعية الوظيفية متطابقة وتطبيق الرابط متناظرة. الرابط الذي هو جزء من PROTAC 8 يمثل N-إلى-N، سلسلة خطية البولي ايثيلين القائم. ال [أ], يماثل[أوم-ديمين] 6 يقود إلى ال ب رغب مركبة نهائيّة 8 عندما يتجاوب مع [بووون-بلوك] 3 في حصة الأضراس من 1:2 في [دمسو] في 90 [ك.]. من بين البيانات التحليلية الأخرى24، تم التحقق من هيكل 8 من قبل الأطياف NMR (الشكل5A). مركب 9، مصممة كسيطرة سلبية مناسبة ، لديه الحد الأدنى فقط ، ولكن الانحرافات الهيكلية الحرجة ، مقارنة مع الإنسان النشط بروتاك 8. ومن المعروف أن N-methylation داخل جزء الجلوتاريميد يلغي CRBN ملزمة26،27. جزء واحد من مركب التحكم السلبي 9 يحمل بقايا N-ميثيل. ويمكن إعداده عن طريق استبدال النيوكليوفيليك الأول من 3 مع N-monoprotected linker بناء كتلة 5، تليها انشقاق من مجموعة حماية Boc واقتران لاحق إلى المتوسطة 4. ونظراً لهيكلها غير المتناظر، أظهرت بعض الانبعاثات الكربونية المناظرة إشارات مختلفة من 13درجة مئوية من إشارات NMR (الشكل5باء).
وقد لوحظ أن homo-PROTAC 8 أن تكون قوية للغاية، مما يؤدي إلى تدهور البروتياسومال كاملة تقريبا من CRBN. تم تأكيد تفسير مستويات البروتين CRBN وIKZF1 وIKZF3 في خلايا الورم النقوي المتعددة من خلال تحليل اللطخة الغربية (الشكل 6، الشكل 7، الشكل 9B) ، وهو طريقة قياسية شبه كمية ، حيث التغير في البروتين يمكن الكشف عن التعبير بسهولة. الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الورقة هي ذات نوعية جيدة والطريقة هي إجراء قياسي الأمثل في مختبرنا.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن تدهور CRBN بواسطة مركب 8 لم يؤثر على قدرة الخلية على البقاء، ومنحت مقاومة لIMiDs (الشكل 8، الشكل 9A)،وهو ما يتماشى مع كريسبر / Cas9-بوساطة خروج المغلوب من CRBN بواسطة sgRNAs24. واستندت إشارة الإنارة في اختبار صلاحية الخلية على إطلاق ATP، والتي يمكن تفسيرها على أنها عدد الخلايا الميتة. يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة في وقت قصير مع عدد كبير من العينات. وهناك طريقة بديلة لقياس الخلايا القابلة للحياة / الميتة هي Annexin V / 7-AAD تلطيخ عن طريق قياس التدفق.
الشكل 1: E3 ubiquitin ligase CRBN هو الهدف الرئيسي للIMiDs. الأدوية المناعية ملزمة CRBN وتجنيد العديد من الركائز الجديدة للتدهور البروتياسومال. التحلل الناجم عن IMiD من عوامل النسخ اللمفاوي IKZF1 و IKZF3 هو المسؤول عن الآثار على خلايا الورم النقوي متعددة وبعض الخصائص المناعية. الكازين كيناز 1α هو المتدهورة بشكل انتقائي من قبل lenalidomide ولكن ليس IMiDs الأخرى ويسهم في نشاط lenalidomide في متلازمة خلل التنسج النخاعي مع فقدان كروموسوم 5Q. تم اكتشاف SALL4 مؤخرا كهدف مشترك لجميع IMiDs التي من المرجح أن ترتبط بمسخ الناجمة عن الثاليدوميد ونظائرها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: PROTACs تتحلل البروتين من الفائدة (POI). PROTACs هي جزيئات heterobifunctional، حيث يربط الرابط بين الليغاد ubiquitin إلى الرباط POI. من خلال تشكيل المجمعات الثلاثية، وligase ubiquitin، مثل CRBN، ثم في كل مكان POI، مما أدى إلى تدهور البروتياسومال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ثنائي وظيفية هومو-بروتك لتدهور E3 يوبيكويتين ligase CRBN. في pomalidomide القائم على homo-PROTAC، يتم توصيل اثنين من الموثقات ligase ubiquitin للحث على عبر في كل مكان من CRBN مما أدى إلى ضربة قاضية الناجمة كيميائيا من CRBN. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توليف من homodimer 8 وheterodimer 9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: 1H NMR (أعلى) و 13C NMR (أسفل) الأطياف. تم تسجيل الأطيافمن مركب 8 (أ) ومركب 9 (B) في DMSO-d6 على مطياف NMR. وتُعطى التحولات الكيميائية في أجزاء لكل مليون (جزء في المليون). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: آثار المركبات 8 و9 على CRBN و IKZF1 وIKZF3. Pomalidomide القائم على homo-PROTAC مركب 8 يحفز تدهور CRBN مع الآثار المتبقية ضعيفة من pomalidomide على IKZF1 و IKZF3. وعلى النقيض من ذلك، فإن المركب 9 الذي يحتوي على مجموعة الميثيل على إحدى مخلفات بوماليدوميد ليس له أي تأثير على التركيزات المشار إليها (درجة مئوية). تم علاج خلايا MM1S لعلاج 24 ساعة. تم تحليل الآثار على CRBN، IKZF1، IKZF3 وtubulin (التحكم في التحميل) من قبل وصمة عار الغربية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: يمكن منع تدهور CRBN بواسطة مثبط اتوام MG132 أو من قبل MLN4942 الذي يمنع الأربطة في كل مكان بشكل غير مباشر عن طريق تثبيط النبر. تم معالجة خط الخلايا المايلوما متعددة MM1s مع 10 μM MG132، 10 μM MLN4924 لمدة 1 ساعة قبل إضافة مركب homo-PROTAC 8 في 100 nM لمدة 3 ساعة من العلاج مجتمعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: اختبار صلاحية الخلية في خلايا الورم النقوي المتعددة MM1S. آثار مركب 8 والسلبية مركب التحكم ملزمة 9 على بقاء الخلية في pomalidomide الحساسة خط الخلية المايلوما MM1S بعد 24 ح، 48 ح و 96 ح العلاج. تم قياس صلاحية الخلية بعد 4 أيام في triplicates. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مركب 8 يعادي تأثير pomalidomide في خطوط الخلايا النقوية متعددة. تم علاج الخلايا مسبقا مع 100 nM مركب 8 لمدة 3 ح. بعد ذلك 1 μM pomalidomide أضيف. تم قياس صلاحية الخلية بعد 4 أيام في triplicates. p <0.001 وفقا لطالب €ق ر-اختبار (A). تحليل وصمة عار الغربية لCRBN، IKZF1، IKZF3 وtubulin (التحكم في التحميل) بعد المعالجة المسبقة للخلايا MM1S مع 100 مجمع NM 8 لمدة 3 ساعة، قبل إضافة 1 μM pomalidomide (B ). أعيد طبعها (تكييفها) بإذن من Steinebach, C. et al. 201824. حقوق الطبع والنشر 2019 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصميم مثل هذه proTACs الإنسان كما هو موضح هنا لCRBN يعتمد على تقارب محددة من pomalidomide إلى CRBN، والتي تم استخدامها بنجاح في العديد من PROTACs heterobifunctional وأدى إلى تطوير PROTAC 8 باعتبارها عالية انتقائية CRBN المهينة. وقد تم بالفعل تأكيد خصوصية جزيء لدينا من قبل التحليلات البروتيومية24. بالنسبة بالضربة القاضية التي يتم التوسط فيها وراثياً، فإن الاستبعاد والتحقق من الآثار الجانبية أمر صعب ويستغرق وقتاً طويلاً. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الضربة القاضية المستحثة كيميائيا ً يمكن عكسها وسرعة وانطباقها مباشرة على مجموعة واسعة من الخلايا وأنواع الأنسجة28.
وقد أصبحت الـ IMiDs thalidomide وlenalidomide وpomalidomide الدعامة الأساسية في علاج الورم النقوي المتعدد والأورام الليمفاوية ب الخلايا ومتلازمة خلل التنسج النقوي. IMiDs التوسط نشاطها عن طريق تحوير خصوصية CRBN-CRL4 E3 ligase لتحلل الركائز الجديدة IKZF1، IKZF3، أو CK1α6،11،29. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت IMiDs لإلغاء وظيفة مرافقة CRBN على اثنين من البروتينات الأخرى، MCT-1 وBSG، التي هي أيضا مهمة لنمو المايلوما متعددة30. تدهور CRBN من قبل PROTAC ثنائية وظيفية متجانسة كان جيدا التحمل من قبل معظم خطوط الخلايا المايلوما متعددة اختبارها، مما يعني أن تعطيل CRBN وحدها لا يكفي للتسبب في قتل خلايا الورم النقوي المتعددة. وعلى النقيض من ذلك، ألغى العلاج المسبق مع المركب 8 آثار IMiDs على تدهور IKZF 1/3 وأنقذ خلايا الورم النقوي المتعددة من ليناليدوميد وبوماليدوميد. وهذا يتماشى مع التعطيل الوراثي لـ CRBN والطفرات الضارة CRBN الموجودة في مرضى المايلوما المتعددة المقاومة لليناليدوميد ويسلط الضوء على الدور الأساسي لـ CRBN في آلية IMiDs31,32 . وبالتالي فإن homo-PROTAC 8 يمكن أن يكون أداة مفيدة لتقليد حالة من المقاومة IMiD. الآثار الأخرى من IMiDs التي لم يتم فهمها بشكل كامل حتى الآن مثل تثبيط الأوعية الدموية أو إطلاق TNFα قد تستمد من تثبيط وظيفة CRBN ولدينا homo-PROTAC هي أدوات مناسبة للتحقيق في تعطيل CRBN مزيد من. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الضربة القاضية الناجمة كيميائيا من CRBN من قبل مركب 8 قد تساعد على تحديد ركائز محلية جديدة من CRBN وتوضيح الوظائف الفسيولوجية من CRBN. وبالنظر إلى أن لدينا مركب 8 لم يكن لها أي آثار على انتشار خط الخلايا السرطانية, تثبيط CRBN وحدها ليس لديه أي نشاط مضاد للورم. ومع ذلك، قد تكون الالمتدهورات CRBN قابلة للتطبيق سريريا في أمراض أخرى غير السرطان. في هذا الصدد، تبين مؤخرا تعطيل CRBN لمنح مقاومة للإنتان ومنع السمنة التي يسببها النظام الغذائي عالية الدهون في الفئران 33،34،35.
في الختام، قمنا بتوليد والتحقق من صحة أول مثبط كيميائي من CRBN التي يمكن أن تكون بمثابة أداة مفيدة للتحقيقات الطبية الحيوية في المستقبل على الإشارات ذات الصلة CRBN والآلية الجزيئية للثاليدوميد ونظائرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن احتمال وجود تضارب مالي في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل برنامج "برنامج إيمي- نوثير Kr-3886/2-1" وSFB-1074 إلى J.K.؛ FOR2372 إلى M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
