Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kjemisk deaktivering av E3 Ubiquitin Ligase Cereblon av Pomalidomide-baserte homo-PROTACs

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59472
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 2, 1
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet beskriver syntese og karakterisering av en pomalidomide-basert, bifunctional homo-PROTAC som en ny tilnærming for å indusere ubiqitinering og degradering av E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), målet for Thalidomid analogs.

Abstract

Den immunmodulerende narkotika (IMiDs) Thalidomid og dets analogs, lenalidomid og pomalidomide, alle FDA godkjente legemidler for behandling av flere myelom, indusere ubiqitinering og degradering av lymfoide transkripsjon faktorene Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3) via cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase for proteasomal degradering. IMiDs har nylig blitt benyttet for generering av bifunctional proteinolyse målretting chimeras (PROTACs) å målrette andre proteiner for ubiqitinering og proteasomal degradering av CRBN E3 ligase. Vi designet og syntetisert pomalidomide homobifunctional PROTACs og analyserte deres evne til å indusere selv-regissert ubiqitinering og degradering av CRBN. Her, CRBN fungerer som begge, den E3 ubiquitin ligase og målet på samme tid. Homo-PROTAC sammensatte 8 forringer CRBN med høy potens med bare minimale gjenværende effekter på IKZF1 og IKZF3. CRBN deaktivering av sammensatte 8 hadde ingen effekt på celle levedyktighet og spredning av ulike flere myelom cellelinjer. Denne homo-PROTAC opphever virkningene av IMiDs i flere myelom celler. Derfor, våre homodimeric pomalidomide-basert forbindelser kanskje hjelpe å identifisere CRBN ' endogene underlag og fysiologisk funksjonene og etterforske det molekylær mekanikk av IMiDs.

Introduction

De immunmodulerende stoffene (IMiDs) Thalidomid og dets analogs, lenalidomid og pomalidomide, alle godkjent for behandling av flere myelom, binder seg til E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), et substrat adapter for cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Binding av IMiDs forbedrer affinitet av CRL4CRBN til lymfoide transkripsjon faktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3), fører til deres ubiqitinering og degradering (figur 1)4,5, 6 andre priser , 7 andre er , 8. siden IKZF1 og IKZF3 er avgjørende for flere myelom celler, deres inaktive resultater i veksthemming. SALL4 ble nylig funnet som en ekstra IMiD-indusert neo-substrat av CRBN som er sannsynlig ansvarlig for teratogenisitet og den såkalte Contergan katastrofe i 1950 forårsaket av Thalidomid9,10. I kontrast, kasein kinase 1 α (CK1α) er et lenalidomid-spesifikt substrat for CRBN som er innblandet i den terapeutiske effekten i myelodysplastisk syndrom med kromosom 5q slettinger11.

Evne til små molekyler til å målrette et bestemt protein for degradering er en spennende konsekvens for moderne narkotika utvikling. Mens mekanismen for Thalidomid og dens analogs ble oppdaget etter deres første bruk i mennesker, såkalt proteolysis taRgeting Chimeras (PROTACs) har blitt designet for å spesifikt MÅLRETTE et protein av interesse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs er heterobifunctional molekyler som består av en bestemt ligand for POI koblet via en linker til en ligand av en E3 ubiquitin ligase som CRBN eller von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs induserer dannelsen av et forbigående trefoldig kompleks, dirigere POI til E3 ubiquitin ligase, noe som resulterer i sin ubiqitinering og proteasomal degradering. De store fordelene med PROTACs over konvensjonelle hemmere er at binding til et POI er tilstrekkelig snarere enn dens hemming og derfor PROTACs kan potensielt målrette et langt bredere spekter av proteiner, inkludert de som ble ansett for å være undruggable som transkripsjon faktorer15. I tillegg chimeric molekyler handle katalytisk og derfor har en høy potens. Etter ubiquitin overføring til POI, den trefoldig komplekse dissociates og er tilgjengelig for dannelsen av nye komplekser. Dermed svært lave PROTAC konsentrasjoner er tilstrekkelig for nedbrytning av målet protein23.

Her beskriver vi syntesen av en pomalidomide-pomalidomide bøyd homo-PROTAC (sammensatt 8) som rekrutterer CRBN for nedbrytning av seg selv24. E3 ubiquitin ligase CRBN fungerer både som rekrutterer og mål samtidig (Figur 3). For å validere våre data, har vi også syntetisert en negativ bindende kontroll (sammensatt 9). Våre data bekrefter at den nylig syntetisert homo-PROTAC er spesifikk for CRBN degradering og har bare minimale effekter på andre proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av PROTAC molekyler

FORSIKTIG: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelettlidelser) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i disse synteser er giftige og kreftfremkallende. Bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis og personlig verneutstyr.

  1. Utarbeidelse av tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamate (sammensatt 1)
    1. Tilsett 1, 1 '-carbonyldiimidazole (1,95 g, 12 mmol) og en katalysator av 4-(dimetylamino) pyridine (5 mg) til en blanding av Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) i THF (50 mL) i 100 mL rund bunn kolbe med en røre bar og utstyrt med en reflux kondensator. Heat på reflux for 10 h under omrøring til en klar løsning er dannet.
    2. Fjern væsken under redusert trykk med en roterende fordamper, tilsett EtOAc (200 mL) og overfør den til en separatory trakt. Vask det organiske laget med H2O (50 ml) og saltlake (50 ml) og tørk den over na2så4.
    3. Filtrer løsningen gjennom en kort pute av silika gel (5 cm diameter og 5 cm høyde) og eluatet med et ytterligere volum (200 mL) av EtOAc.
    4. Fordampe væsken og tørk den oppnådde fargeløs fast i vacuo.
  2. Utarbeidelse av tert-butyl N-(1-metyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamate (sammensatt 2)
    1. Kombiner sammensatt 1 (2,28 g, 10 mmol) med valset kalium (2,76 g, 20 mmol) og DMF (25 ml) i en 100 ml rund bunn kolbe. Legg iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) drop-klok ved hjelp av en sprøyte og utstyre flasken med en punktert gummi septum. Plasser reaksjons fartøyet i en ultralydbad for 2 t.
    2. Fortynne reaksjonsblandingen med EtOAc (100 mL) og overfør den til en separatory trakt. Vask det organiske laget med 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml), og saltlake (25 ml), og tørk den over na2så4.
    3. Filtrer og fordampe løsningsmidlet. Rens produktet etter kolonne kromatografi over silica gel (6 cm kolonne diameter og 20 cm høyde) ved hjelp av Petroleum Eter/EtOAc (2:1).
  3. Fremstilling av 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-YL) -4-fluoroisoindoline-1, 3-Dione (sammensatt 3)
    1. Kombiner 3-fluorophthalic yre (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) og en løsning av natrium acetate (0,50 g, 6,0 mmol) i isbre eddiksyre (20 ml) i en 50 ml rund bunn kolbe med en røre bar og utstyrt med en reflux kondensator. Varm opp blandingen ved 120 ° c i 6 timer.
    2. Etter avkjøling, hell den lilla blandingen på H2o (100 ml) og rør i 10 min. samle dannet solid ved filtrering, vask med h2O (3 × 5 ml) og petroleum Eter (3 × 5 ml) og tørk i vacuo.
  4. Utarbeidelse av 4-fluoro-2-(1-metyl-2, 6-dioxopiperidin-3-YL) isoindoline-1, 3-Dione (sammensatt 4)
    1. Kombiner 3-fluorophthalic yre (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) og en løsning av natrium acetate (0,50 g, 6,0 mmol) i isbre eddiksyre (20 ml) i en 100 ml rund bunn kolbe med en røre bar og utstyrt med en reflux kondensator. Varm opp blandingen ved 120 ° c i 6 timer.
    2. Etter avkjøling, hell den lilla blandingen på H2o (100 ml) og rør i 10 min. samle dannet solid ved filtrering, vask med h2O (3 × 5 ml) og petroleum Eter (3 × 5 ml) og tørk i vacuo.
  5. Fremstilling av tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-(2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-YL] amino] ethoxy] ethoxy] etanol] carbamate (sammensatt 7)
    1. Lad 50 mL rund bunn kolbe med tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] etanol] carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), sammensatt 3 (0,41 g, 1,50 mmol), tørr DMF (10 mL) og DIPEA (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Utstyre med en røre bar og en reflux kondensator. Heat under Argon atmosfære ved 90 ° c for 10 h.
    2. Etter avkjøling til romtemperatur, hell den mørke grønne blandingen på H2O (100 ml) og trekk ut med EtOAc (3X 50 ml) i en separatory trakt. Vask de kombinerte organiske lagene med H2O (50 ml) og saltlake (50 ml), tørk over na2så4, Filtrer og Konsentrer deg i vacuo.
    3. Rens råolje produktet etter kolonne kromatografi over silica gel (3 cm kolonne diameter og 60 cm høyde) ved hjelp av en gradient av Petroleum Eter/EtOAc (1:1 til 1:2).
  6. Utarbeidelse av homodimer (sammensatt 8)
    1. Kombiner α, ω-diamin linker 6 (0,22 g, 0,22 mL, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 mL, 6,00 mmol) og en løsning av 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) i tørr DMSO (20 mL) i en 50 ml rund bunn kolbe med en røre bar og utstyrt med en reflux kondensator. Heat under Argon atmosfære ved 90 ° c for 18 h.
    2. Etter avkjøling til romtemperatur, hell den mørke grønne blandingen på H2O (100 ml) og trekk ut med EtOAc (3X 50 ml) i en separatory trakt. Vask de kombinerte organiske lagene med H2O (50 ml) og saltlake (50 ml), tørk over na2så4, Filtrer og Konsentrer deg i vacuo.
    3. Rens råolje produktet etter kolonne kromatografi over silica gel (3 cm kolonne diameter og 50 cm høyde) ved hjelp av en gradient av Petroleum Eter/EtOAc (1:2) til EtOAc.
  7. Utarbeidelse av heterodimer (sammensatte 9)
    1. Oppløse forbindelse 7 (0,83 g, 1,65 mmol) i tørr ch2CL2 (10 ml). Tilsett trifluoroacetic yre (10 mL) og rør den gule blandingen ved 40 ° c i 2 timer i en lukket 50 mL rund bunn kolbe.
    2. Fjern flyktige og coevaporate med CH2CL2 (4X 5 ml). Tørk rester i vacuo i 10 timer.
    3. Redissolve materialet i tørr DMF (20 mL). Legg sammensatte 4 (0,44 g, 1,50 mmol) og DIPEA (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) og utstyre kolbe med en reflux kondensator. Heat under Argon atmosfære ved 90 ° c for 10 h.
    4. Etter avkjøling til romtemperatur, hell den mørke grønne blandingen på H2O (100 ml) og trekk ut med EtOAc (3X 50 ml) i en separatory trakt. Vask de kombinerte organiske lagene med mettet NaHCO3 (50 ml), H2O (50 ml), 10% KHSO4 (50 ml), H2O (50 ml) og saltlake (50 ml), tørk over na2så4, Filtrer og Konsentrer deg i vacuo.
    5. Rens råolje produktet etter kolonne kromatografi over silica gel (3 cm kolonne diameter og 50 cm høyde) ved hjelp av en gradient av Petroleum Eter/EtOAc (1:2) til EtOAc.
    6. Belyse og verifisere molekylstrukturen (figur 5a sammensatte 8, 5B SAMMENSATTE 9) med 1H NMR og 13C NMR SPECTRA i DMSO-d6 på en kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) spektrometer. Kontroller at renheten av begge forbindelsene er høyere enn 97% ved hjelp av flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC-MS), bruke en diode array deteksjon (DAD) på 220-500 NM.

2. funksjonell validering av PROTAC molekyler

  1. Western Blot analyse av CRBN degradering av PROTACs
    Merk: effekten av sammensatte8og sammensatte9på CRBN protein nivå ble testet av Western Blot analyse. I tillegg kan virkningen på IKZF1 og IKZF3 nivåer også bekreftes (Figur 6).
    1. Eksempel på tilberedning
      1. Oppløse forbindelser 8 og 9, lenalidomid (len), pomalidomide (pom), MG132 og MLN-4924 i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mm, alikvot og oppbevares ved-80 ° c til videre bruk.
      2. Seed 1 x 106 MM1S celler i en 6-brønn plate med 2,5 ml Media og behandle celler med 100 nM eller 1 μM sammensatte 8 eller 9 for 24 h.
      3. Høste celler etter behandling og sentrifuge ved 700 x g, 5 min, 4 ° c. Vask celle pellet med kald 1x PBS å fjerne gjenværende Media, sentrifuge ved 700 x g, 5 min, 4 ° c, og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet én gang.
      4. Lyse celler i lyseringsbuffer (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glyserol, 1x protease & fosfatase inhibitor cocktail) i 10 min på isen, sentrifuger ved 320 x g i 10 min, 4 ° c. Harvest supernatanten og bestemme proteinkonsentrasjon av en bicinchoninic acid protein analysen (BCA-analysen) i henhold til produsentens protokoll.
      5. Denaturere proteiner (15 – 30 μg/prøve) med 1x LDS lasting buffer (5% 2-mercaptoethanol) og kok 10 min, 75 ° c.
    2. SDS-SIDE
      1. Fix gel sandwich med en 10% skille gel [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), pH 8,45), 4 mL akrylamid 30%, 2,52 mL glyserol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μL 11% ammonium PERSULFATE (APS), og 9,75 μL TEMED] og en 4% stabling gel [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% akrylamid, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS og 6 μL TEMED] i en elektrode monterings enhet. Fjern kammer, skyll brønner med bilderør buffer (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS), og Last prøver.
      2. Fyll anode buffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) inn i tanken. Load protein prøve fra trinn 2.1.1.4 og kjøre SDS-side på 70 V, 20 min, etterfulgt av 115 V, 150 min ved konstant spenning.
    3. Proteinimmunoblotting og påvisning av CRBN, IKZF1 og IKZF3
      1. Aktiver PVDF-membran (0,45 μm) i 100% metanol i 1 min. likevekt membran og skille gel i 1x overføringsbuffer [10x overføringsbuffer (192 mM Glycine, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Monter blotting kassett i henhold til produsentens protokoll. Transfer gel på 180 mA for 90 min.
      3. Vaske membranen 3x i 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% mellom 20) for 5 – 10 min hver ved romtemperatur. Blokk membran i 5% nonfat-tørket melk (NFDM), TBS-T for 1 time ved romtemperatur. Vask membranen 3x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved romtemperatur.
      4. Ruge membran med primær antistoff for CRBN (1:500 i 5% BSA, TBS-T) med skånsom risting ved 4 ° c, over natten.
      5. Vask membranen 3x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved romtemperatur. Ruge membran med anti-mus (1:10.000 i 5% NFDM, TBS-T) eller anti-kanin (1:5.000 i 5% NFDM, TBS-T) sekundære antistoff koplet til pepperrot peroksidase HRP (1 t ved romtemperatur.)
      6. Vask membranen 2x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet to ganger med 1x TBS.
      7. Ruge membran for 2 min med HRP substrat løsning i henhold til produsentens protokoller og oppdage kjemiluminescens i en kjemiluminescens deteksjon enhet.
      8. Vask membran 1x i 1X TBS for 5 – 10 minutter ved romtemperatur. For frigjøring av antistoffer, bånd membran i kommersielt tilgjengelig stripping buffer i 15 min. vask membran 3x i 1X TBS for 5 – 10 minutter ved romtemperatur.
      9. Reblock membran i 5% nonfat melk, TBS-T for 1 time ved romtemperatur. Vask membranen 3x i 1x TBS-T for 5 – 10 min hver ved romtemperatur og reprobe med IKZF1, IKZF3 eller tubulin i henhold til trinn 2.1.3.4.
  2. Konkurranse eksperimenter med MG132, MLN4942 eller pomalidomide
    Merk: for å bekrefte om CRBN er degradert via ubiquitin-proteasomet veien, utførte vi konkurranse eksperimenter med proteasomet inhibitor MG132 og en neddylation aktivering enzym (NAE) inhibitor MLN4942 (figur 7).
    1. Seed 1 x 106 MM1S celler per brønn i en 6-brønn plate. Forbehandle celler med 10 μM MG132, 10 μM MLN4942 eller lenalidomid (100 prosent), og ruge 1 t ved 37 ° c, 5% CO2.
    2. Tilsett 100 nM sammensatte 8 for 3 t ved 37 ° c, 5% co2.
    3. Harvest celler for Western Blot i henhold til trinn 2.1.1.
  3. Celle levedyktighet analyser i flere myelom cellelinjer
    Merk: denne analysen brukes til å teste effekten på celle levedyktighet og i tillegg antagonize effekten av IMiDs på flere myelom celler ved forbehandling av cellene med sammensatte 8 (Figur 8, figur 9a, B).
    1. Seed 5 x 104 MM1S celler per brønn i en 96 brønn plate i biologiske triplicates for levedyktighet analysen. For Western Blot analyse, frø 1 x 106 MM1S celler per brønn i en 6-brønn plate i biologiske triplicates.
    2. Behandle celler med DMSO eller 100 nM, 1 μM, eller 10 μM sammensatte 8, sammensatte 9 eller pomalidomide og ruge for 24 h, 48 h, eller 96 h ved 37 ° c, 5% co2. For rednings eksperimenter, behandle celler med 100 nM sammensatte 8 for 3 h, før eller etter tilsetning av 1 μM pomalidomide og ruge for 96 h.
    3. Mål 96-brønn plate luminescence med en selvlysende celle levedyktighet analysen, i henhold til produsentens protokoll på en plate leser eller høste celler fra 6-brønn plate for Western Blot analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her har vi beskrevet design, syntese og biologisk evaluering av en homodimeric pomalidomide-basert PROTAC for nedbrytning av CRBN. Våre PROTAC samhandler samtidig med to CRBN molekyler og former trefoldig komplekser som induserer selv-ubiqitinering og proteasomal degradering av CRBN med bare minimale gjenværende effekter på pomalidomide-indusert neo-underlag IKZF1 eller IKZF3.

Ut av en serie av tidligere utgitte pomalidomide-baserte PROTAC molekyler24, sammensatte 8 var spesielt effektiv i kjemisk-indusert degradering av CRBN. Dens syntese kan oppnås som følger (Figur 4). En 1, 1 '-carbonyldiimidazole-forfremmet kondens av Boc-beskyttet l-glutamin fører til cyclized imide 1. N-denaturert analoge 2 er tilgjengelig via alkylation med methyl iodide. Begge byggesteinene (1 og 2) transformeres, etter N-deprotection under Sure forhold, til phthalimide derivater (3 og 4) i løpet av en ring-åpning/recyclization reaksjon ved hjelp av 3- fluorophthalic yre. Thalidomid analogs, generelt, er mottakelige for hydrolytisk nedbryting og bør bare brukes i neste trinn etter tilstrekkelig tørking. Sammensatte 3 er mottakelig for en aromatisk nukleofil substitusjon med primær alifatiske aminer25; denne konverteringen ble funnet å fortsette effektivt bare når tørre løsemidler brukes. Utformingen av en ekte homodimeric produktet innebærer linker tilkobling av to identiske funksjonell underlag og anvendelse av symmetrisk linker. Den linker som er en del av PROTAC 8 representerer en N-til-n, polyetylen-basert lineær kjede. Den tilsvarende α, ω-diamin 6 fører til den ønskede siste sammensatte 8 når reagert med byggekloss 3 i molar rasjon av 1:2 i DMSO ved 90 ° c. Blant andre analytiske data24ble strukturen til 8 verifisert av NMR Spectra (figur 5a). Sammensatte 9, utformet som en passende negativ kontroll, har en bare minimal, men kritiske strukturelle avvik, sammenlignet med den aktive homo-PROTAC 8. Det er kjent at N-metylering innenfor glutarimide delen opphever CRBN binding26,27. En pomalidomide del av den negative kontrollen sammensatte 9 bjørner en N-metyl rester. Det kan fremstilles ved en første nukleofil substitusjon av 3 med N-monoprotected linker byggekloss 5, etterfulgt av kløft av Boc beskytte gruppen og en påfølgende kopling til middels 4. På grunn av den asymmetriske strukturen viste noen av de korresponderende karbonatomer distinkte 13C NMR-signaler (figur 5B).

Homo-PROTAC 8 ble observert for å være svært potent, noe som førte til en nesten fullstendig proteasomal DEGRADERING av CRBN. Tolkningen av CRBN, IKZF1 og IKZF3 proteinnivåer i flere myelom celler ble bekreftet av Western Blot analyse (figur 6, figur 7, figur 9B), en semi-kvantitativ standard metode, hvor endringen i protein uttrykket kan enkelt oppdages. Antistoffene som brukes i dette papiret er av god kvalitet og metoden er en optimalisert standard prosedyre i laboratoriet vårt.

I tillegg har nedbrytning av CRBN ved sammensatte 8 ikke påvirke celle levedyktighet og overdratt motstand mot IMiDs(figur 8, figur 9a), som er i tråd med CRISPR/Cas9-mediert knockout av CRBN av sgRNAs24. Det luminescence signalet i cellen levedyktighet analysen var basert på ATP utgivelse, som kan tolkes som døde celle tall. Denne metoden kan enkelt utføres på kort tid med et høyt antall prøver. En alternativ metode for måling av levedyktige/døde celler er en Annexin V/7-AAD farging av Flow flowcytometri.

Figure 1
Figur 1: E3 ubiquitin LIGASE CRBN er hovedmålet for IMiDs. Immunmodulerende legemidler binder til CRBN og rekrutterer flere neo-underlag for proteasomal degradering. IMiD-indusert degradering av lymfoide transkripsjon faktorer IKZF1 og IKZF3 er ansvarlig for virkningene på flere myelom celler og noen av de immunmodulerende egenskaper. Kasein kinase 1 α er selektivt degradert av lenalidomid, men ikke de andre IMiDs og bidrar til aktiviteten av lenalidomid i myelodysplastisk syndrom med tap av kromosom 5q. SALL4 ble nylig oppdaget som et felles mål for alle IMiDs som sannsynligvis er knyttet til teratogenisitet indusert av Thalidomid og dets analogs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: PROTACs forringe protein av interesse (POI). PROTACs er heterobifunctional molekyler, hvor en linker forbinder en ubiquitin ligase ligand til en POI ligand. Ved dannelsen av trefoldig komplekser, en ubiquitin ligase, som CRBN, deretter ubiquitinates den POI, som resulterer i sin proteasomal degradering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: bifunctional homo-PROTAC for nedbrytning av E3-ubiquitin LIGASE CRBN. I et pomalidomide homo-PROTAC er to ubiquitin ligase bindemidler koblet til for å indusere ubiqitinering på tvers CRBN, noe som resulterer i en kjemisk indusert knockdown av CRBN. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: syntese av homodimer 8 og heterodimer 9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: 1H NMR (øverst) og 13C NMR (nederst) Spectra. Spectra av sammensatte 8 (A) og sammensatte 9 (B) ble spilt inn i DMSO-d6 på en NMR spektrometer. Kjemiske Skift er gitt i deler per million (ppm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: effekter av forbindelser 8 og 9 på CRBN, IKZF1, og IKZF3. Pomalidomide-basert homo-PROTAC sammensatte 8 induserer CRBN degradering med svake gjenværende effekter av POMALIDOMIDE på IKZF1 og IKZF3. I kontrast har sammensatte 9 som inneholder en methyl gruppe på en av pomalidomide rester ingen effekt på de angitte konsentrasjonene (μM). MM1S celler ble behandlet for 24 h behandling. Effekter på CRBN, IKZF1, IKZF3 og tubulin (lasting kontroll) ble analysert av Western Blot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: CRBN degradering kan blokkeres av proteasomet INHIBITOR MG132 eller ved MLN4942 som blokkerer ubiquitin ligases indirekte via neddylation hemming. Den flere myelom cellelinjen MM1s ble forbehandlet med 10 μM MG132, 10 μM MLN4924 for 1 time før tillegg av homo-PROTAC sammensatte 8 ved 100 nM for 3 h av kombinert behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Celle levedyktighet analysen i MM1S flere myelom celler. Effekter av sammensatte 8 og negative bindende kontroll sammensatte 9 på celle levedyktighet i pomalidomide FØLSOM myelom cellelinje MM1S etter 24 h, 48 h og 96 h behandling. Celle levedyktighet ble målt etter 4 dager i triplicates. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Sammensatt 8 antagonizes effekten av pomalidomide i flere myelom cellelinjer. Celler ble forbehandlet med 100 nM sammensatte 8 for 3 h. etterpå 1 μM pomalidomide ble lagt. Celle levedyktighet ble målt etter 4 dager i triplicates. p <0,001 i henhold til student t-test (A). Western Blot analyse for CRBN, IKZF1, IKZF3 og tubulin (lasting kontroll) etter forbehandling av MM1S celler med 100 nM sammensatte 8 for 3 h, før tilsetning av 1 μM Pomalidomide (B). Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utformingen av slike homo-PROTACs som beskrevet her for CRBN er avhengig av spesifikke affinitet av pomalidomide til CRBN, som har blitt utnyttet i mange heterobifunctional PROTACs og resulterte i utviklingen av PROTAC 8 som en svært selektiv CRBN Degrader. Det spesielle ved vårt molekyl er allerede bekreftet av Proteomikk analyser24. For genetisk mediert knockout, eksklusjon og validering av bivirkninger er utfordrende og tidkrevende. I tillegg er en kjemisk indusert knockdown reversibel, rask og direkte gjelder for et bredt spekter av celler og vevstyper28.

IMiDs Thalidomid, lenalidomid og pomalidomide har blitt en bærebjelke i behandlingen av flere myelom, B-celle lymfomer og myelodysplastisk syndrom. IMiDs megle sin aktivitet ved modulerende spesifisitet av CRBN-CRL4 E3 ligase å forringe neo-underlag IKZF1, IKZF3, eller CK1α6,11,29. I tillegg har IMiDs vist å oppheve den Anstandsdame funksjonen til CRBN på to andre proteiner, MCT-1 og BSG, som også er viktig for flere myelom vekst30. Nedbrytning av CRBN av homo-bifunctional PROTAC ble godt tolerert av de fleste flere myelom cellelinjer testet, antyde at CRBN inaktive alene er ikke tilstrekkelig til å forårsake drap av flere myelom celler. I motsetning til pre-behandling med sammensatte 8 avskaffet effekten av IMIDS på IKZF1/3 degradering og reddet flere myelom celler fra lenalidomid og pomalidomide. Dette er i tråd med genetisk deaktivering av CRBN og skadelige CRBN mutasjoner som finnes i lenalidomid-resistente flere myelom pasienter og fremhever den essensielle rollen til CRBN i mekanismen av IMiDs31,32 . Homo-PROTAC 8 kan derfor være et nyttig redskap for å etterligne en tilstand av IMiD motstand. Andre effekter av IMiDs som ikke er fullt ut forstått, men som hemming av angiogenicity eller TNFα utgivelse kan være avledet fra en hemming av CRBN funksjon og vår homo-PROTAC er egnet verktøy for å undersøke deaktivering av CRBN videre. I tillegg kan den kjemisk induserte knockdown av CRBN ved sammensatte 8 bidra til å identifisere nye endogene UNDERLAG av CRBN og belyse de fysiologiske funksjonene til CRBN. Gitt at våre sammensatte 8 hadde ingen effekter på kreftcelle linje SPREDNING, CRBN hemming alene har ingen anti-tumor aktivitet. CRBN degraders kan imidlertid være klinisk anvendelig i andre sykdommer enn kreft. I denne forbindelse, CRBN inaktive ble nylig vist å konferere motstand mot sepsis og for å hindre høy-fett-diett-indusert fedme i mus 33,34,35.

Avslutningsvis har vi generert og validert den første kjemiske inhibitor av CRBN som kan tjene som et nyttig verktøy for fremtidige biomedisinsk undersøkelser på CRBN-relaterte signalering og molekylær mekanisme av Thalidomid og dens analogs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke en potensiell økonomisk interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether program kr-3886/2-1 og SFB-1074 til JK; FOR2372 til M.G.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1'-Carbonyldiimidazole TCI chemicals C0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) Sigma-Aldrich 385506 Compound 6
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % Alfa Aesar A12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 % Acros 148270250 Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) Carl Roth 3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB Cell signaling 15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbit Sigma HPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody Sigma 7074S
Ammonium Persulfate Roth 9592.2
Boc-Gln-OH TCI chemicals B1649
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7571
ChemiDoc XRS+ Bio-Rad 1708265
DMF, anhydrous, 99.8 % Acros 348435000 Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 % Acros 348445000 Extra Dry over Molecular Sieve
Glycine Sigma-Aldrich 15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated) Santa Cruz biotechnology sc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) Thermo Scientific 1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab Cell signaling 14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) Merck IPVH000010
Iodomethane, 99 % Sigma-Aldrich I8507 Highly toxic
Methanol Sigma-Aldrich 32213-2.5L
Mg132 Selleckchem S2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell Bio-Rad 1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658004
MLN4942 biomol (cayman) Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) Sigma T5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % Alfa Aesar A11801
Nonfat dried milk powder PanReac AppliChem A0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate Thermo Scientific 136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Thermo Scientific NP0008
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Pomalidomide Selleckchem S1567
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46430
sodium dodecyl sulfate Carl Roth 183.1
Sodium Chloride Sigma-Aldrich A9539-500g
TEMED Carl Roth 2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate Sigma-Aldrich 89761 Compound 5
Tricin Carl Roth 6977.4
Trizma base Sigma-Aldrich T1503-1kg
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
WesternBright ECL spray Advansta K-12049-D50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Tags

Kjemi CRBN PROTAC IMiD pomalidomide ubiquitin ligase flere myelom proteasomet
Kjemisk deaktivering av E3 Ubiquitin Ligase Cereblon av Pomalidomide-baserte homo-PROTACs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm,… More

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm, H., Mangold, M., Gütschow, M., Krönke, J. Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs. J. Vis. Exp. (147), e59472, doi:10.3791/59472 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter