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Chemistry

पोमालीडोमाइड आधारित होमो-प्रोटाक द्वारा ई 3 यूबिक्विटिन लिगासे सेरेबलॉन की रासायनिक निष्क्रियता

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59472
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 2, 1
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Summary

यह कार्य एक पोमलिडोमाइड-आधारित, द्विकार्यात्मक होमो-प्रोटाक के संश्लेषण और विशेषता का वर्णन करता है ताकि ई 3 सबबिकुटिन लिगेसे सेरेब्लॉन (सीआरबीएन) की सर्वव्यापकता और गिरावट को प्रेरित किया जा सके, जो थैलिडोमाइड एनालॉग्स का लक्ष्य है।

Abstract

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाएं (आईएमआईडी) थालिडोमाइड और इसके एनालॉग, लेलिडोमाइड और पोमलिडोमाइड, सभी एफडीए ने एकाधिक मायलोमा के उपचार के लिए दवाओं को मंजूरी दे दी, लसीकाभ प्रतिलेखन कारकों इकारोस (आईकेजेडएफ 1) और आयोलोस की सर्वव्यापकता और गिरावट को प्रेरित किया। (आईकेजेडएफ 3) प्रोटीसोमल निम्नीकरण के लिए सेरेब्लन (CRBN) E3 यूबिक्विटिन लिगेज़ के माध्यम से। आईएमआईडी का उपयोग हाल ही में सीआरबीएन ई3 लिगेस द्वारा सर्वव्यापकता और प्रोटीसोमल अवक्रमण के लिए अन्य प्रोटीनों को लक्षित करने वाले द्वि-कार्यात्मक प्रोटीओलिसिस के उत्पादन के लिए किया गया है। हमने पोमालीडोमाइड-आधारित होमोबिफंक्शनल प्रोटेक्स को डिजाइन और संश्लेषित किया है और सीआरबीएन के आत्म-निर्देशित सर्वव्यापकता और गिरावट को प्रेरित करने की उनकी क्षमता का विश्लेषण किया है। यहाँ, CRBN दोनों के रूप में कार्य करता है, E3 ubicuitin लिगेज़ और एक ही समय में लक्ष्य. होमो-प्रोटाक यौगिक 8 एक उच्च शक्ति के साथ CRBN को कम करता है, जिसमें केवल कम से कम शेष प्रभाव के साथ आईकेजेडएफ1 और आईकेजेडएफ3 शामिल हैं। 8 यौगिक द्वारा CRBN निष्क्रियता सेल व्यवहार्यता और विभिन्न एकाधिक myeloma सेल लाइनों के प्रसार पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. यह होमो-प्रोटाक कई मायलोमा कोशिकाओं में आईएमआईडी के प्रभाव को समाप्त करता है। इसलिए, हमारे homodimeric pomalidomide आधारित यौगिकों CRBN अंतर्जात substrates और शारीरिक कार्यों की पहचान करने और IMiDs के आणविक तंत्र की जांच करने में मदद कर सकते हैं.

Introduction

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी ड्रग्स (आईएमआईडी) थालिडोमाइड और इसके एनालॉग, लेनालीडोमाइड और पोमलिडोमाइड, सभी को कई मायलोमा के उपचार के लिए मंजूरी दे दी गई है, ई 3 यूबिक्विटिन लिगेज़ सेरेब्लॉन (सीआरबीएन), cullin4A-RING E3 ubiQuitin लिगाज़ के लिए एक substrate एडेप्टर (CRL4CRBN)1,2,3. IMIDs के बंधन CRL4CRBN की समानता को बढ़ाता है लिम्फोइड प्रतिलेखन कारकों Ikaros (IK$F1) और Aiolos (IK$F3), उनकी सर्वव्यापकता और गिरावट के लिए अग्रणी (चित्र 1)4,5, 6 , 7 , 8के बाद से आई के ]F1 और आईकेजेडF3 कई myeloma कोशिकाओं के लिए आवश्यक हैं, उनके निष्क्रियता विकास निषेध में परिणाम. SALL4 हाल ही में CRBN के एक अतिरिक्त IMID प्रेरित नव-सब्सट्रेट के रूप में पाया गया था कि संभावना teratogenicity और 1950 के दशक में तथाकथित Contergan तबाही के लिए जिम्मेदार है thalidomide9,10 कीवजह से . इसके विपरीत, केसिन काइनेज़ 1 $(CK1]) CRBN का एक lenalidomide-विशिष्ट सब्सट्रेट है जो गुणसूत्र 5के विलोपन11के साथ मायलोडिसप्लास्टिक सिंड्रोम में चिकित्सीय प्रभाव में फंसा हुआ है।

गिरावट के लिए एक विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए छोटे अणुओं की क्षमता आधुनिक दवा के विकास के लिए एक रोमांचक निहितार्थ है. जबकि thalidomide और उसके एनालॉग के तंत्र मनुष्यों में अपने पहले उपयोग के बाद की खोज की थी, तथाकथित Protelysis Targeting Chimeras (PROTACs) विशेष रूप से ब्याज की एक प्रोटीन को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया है (POI) (चित्रा 2)12,13,14,15,16,17,18. प्रोटाक्स हेटरोबीफनिफलिफंक्शनल अणु हैं जो पी ओ आई के लिए एक लिंकर के माध्यम से एक लिंकर के माध्यम से जुड़े होते हैं, जैसे CRBN या von-Hippell-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs एक क्षणिक त्रिअंगी परिसर के गठन के लिए प्रेरित, ई 3 ubicuitin लिगे के लिए POI निर्देशन, इसकी सर्वव्यापकता और proteasomal गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप. पारंपरिक inhibitors पर PROTACs के प्रमुख लाभ यह है कि एक POI के लिए बाध्यकारी के बजाय अपने निषेध के लिए पर्याप्त है और इसलिए PROTACs संभावित रूप से उन है कि undruggable माना जाता था सहित प्रोटीन की एक दूर व्यापक स्पेक्ट्रम लक्ष्य कर सकते हैं जैसे प्रतिलेखन कारक15| इसके अतिरिक्त, झंकार के अणु उत्प्रेरक रूप से कार्य करते हैं और इसलिए उनमें उच्च शक्ति होती है। POI के लिए सर्वव्यापक हस्तांतरण के बाद, त्रिअंगी परिसर अलग हो जाता है और नए परिसरों के गठन के लिए उपलब्ध है। इस प्रकार, बहुत कम PROTAC सांद्रता लक्ष्य प्रोटीन23की गिरावट के लिए पर्याप्त हैं.

यहाँ हम एक पोमलिडोमाइड-पोमालीडोमाइड संयुग्मी होमो-प्रोटीक (कम्पाउंड 8) के संश्लेषण का वर्णन करते हैं जो स्वयं की गिरावट के लिए CRBN की भर्ती करता है24. E3 सर्वव्यापक लिगेज़ CRBN एक ही समय में भर्ती और लक्ष्य दोनों के रूप में कार्य करता है (चित्र 3)। हमारे डेटा को मान्य करने के लिए, हम भी एक नकारात्मक बाध्यकारी नियंत्रण संश्लेषित (कम्पाउंड 9). हमारे डेटा की पुष्टि करें कि नए संश्लेषित होमो-प्रोटाक CRBN गिरावट के लिए विशिष्ट है और अन्य प्रोटीन पर केवल न्यूनतम प्रभाव पड़ता है।

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Protocol

1. प्रोटैक अणुओं की तैयारी

चेतावनी: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। इन syntheses में इस्तेमाल रसायनों के कई विषाक्त और कैंसरकारी हैं. सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें.

  1. टर्ट-ब्यूटिल एन-(2,6-dioxo-3-piperidyl) कार्बामेट (कम्पाउंड 1) की तैयारी
    1. जोड़ें 1,1'-कार्बोनिलडिमिडाज़ोल (1.95 ग्राम, 12 एमएल) और 4 की एक उत्प्रेरक राशि (dimethylamino)pyridine (5 मिलीग्राम) को एक मिश्रण में बोक-Gln-OH (2.46 ग्राम, 10 mmol) THF (50 एमएल) में 100 एमएल राउंड बॉटम फ्लास्क के साथ एक हलचल और एक से सुसज्जित बार के साथ एक सुसज्जित। 10 ज के लिए भाटा पर गर्मी जब तक एक स्पष्ट समाधान का गठन किया है सरगर्मी.
    2. एक रोटरी वाष्पित्र के साथ कम दबाव के तहत विलायक निकालें, EtOAc (200 एमएल) जोड़ने के लिए और यह एक अलग करने कीप करने के लिए स्थानांतरण। कार्बनिक परत को एच2ओ (50 एमएल) और नमकीन (50 एमएल) से धोकर ना2SO4पर सुखा लें।
    3. सिलिका जेल (5 सेमी व्यास और 5 सेमी ऊंचाई) की एक छोटी पैड के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और EtOAc की एक और मात्रा (200 एमएल) के साथ eluate.
    4. विलायक का वाष्पित करें और प्राप्त बेरंग ठोस को धानी में सुखा लें।
  2. टर्ट-ब्यूटिल एन-(1-मेथिल-2,6-डाइऑक्सो-3-पाइपरिडिल) कार्बामेट (कम्पाउंड 2) की तैयारी
    1. मिश्रित पोटेशियम कार्बोनेट (2.76 ग्राम, 20 एमएल) और डीएमएफ (25 एमएल) के साथ यौगिक 1 (2.28 ग्राम, 10 मिली) को 100 एमएल गोल तल फ्लास्क में मिलाएं। एक सिरिंज का उपयोग करके आयोडोमेथेन (1.42 ग्राम, 0.62 एमएल, 10 एमएल) ड्रॉप-वार जोड़ें और फ्लास्क को पंचर रबर के पट से लैस करें। 2 ज के लिए एक ultrasonication स्नान में प्रतिक्रिया पोत रखें।
    2. EtOAc (100 एमएल) के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को पतला करें और इसे एक विभाजक कीप में स्थानांतरित करें। 1 N NaOH (2x 25 एमएल), एच2O (25 एमएल), और नमकीन (25 एमएल) के साथ कार्बनिक परत धो लें, और यह Na2SO4पर सूखी .
    3. विलायक को छानकर वाष्पित कर दिया। सिलिका जेल (6 सेमी कॉलम व्यास और 20 सेमी ऊंचाई) पेट्रोलियम ईथर / EtOAc (2:1) का उपयोग कर पर स्तंभ क्रोमैटोग्राफी द्वारा उत्पाद को शुद्ध।
  3. 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (कम्पाउंड 3) की तैयारी
    1. मिश्रण 3-fluorophthalic anhydride (1.25 ग्राम, 7.5 mmol), glutarimide 1 (1.14 ग्राम, 5 mmol) और सोडियम एसीटेट का एक समाधान (0.50 ग्राम, 6.0 mmol) हिमनदों में एसिटिक एसिड (20 एमएल) एक हलचल पट्टी के साथ और एक condenser के साथ सुसज्जित. मिश्रण को 6 ज के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर गरम करें।
    2. ठंडा करने के बाद, एच2ओ (100 एमएल) पर बैंगनी मिश्रण डालना और 10 मिनट के लिए हलचल. निस्पंदन द्वारा गठित ठोस लीजिए, एच2ओ (3 $ 5 एमएल) और पेट्रोलियम ईथर (3 $ 5 एमएल) के साथ धो लें और धानी में सूखा।
  4. 4-फ्लोरो-2-(1-मेथिल-2,6-डाइऑक्सोपाइपरिडिन-3-yl)isoindoline-1,3-dione (कम्पाउंड 4)
    1. मिश्रण 3-fluorophthalic anhydride (1.25 ग्राम, 7.5 mmol), glutarimide 2 (1.21 ग्राम, 5 mmol) और सोडियम एसीटेट का एक समाधान (0.50 ग्राम, 6.0 mmol) हिमनदों में एसिटिक एसिड (20 एमएल) एक हलचल के साथ एक 100 एमएल दौर नीचे फ्लास्क में एक 100 एमएल दौर flask एक हलचल के साथ और एक भाटाधर के साथ सुसज्जित. मिश्रण को 6 ज के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर गरम करें।
    2. ठंडा करने के बाद, एच2ओ (100 एमएल) पर बैंगनी मिश्रण डालना और 10 मिनट के लिए हलचल. निस्पंदन द्वारा गठित ठोस लीजिए, एच2ओ (3 $ 5 एमएल) और पेट्रोलियम ईथर (3 $ 5 एमएल) के साथ धो लें और धानी में सूखा।
  5. tert-butyl N-[2-[2-]2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl[amino]ethoxy]एथॉक्सी]एथिथॉल-कार्बामेट (कम्पाउंड 7)
    1. एक 50 एमएल गोल नीचे फ्लास्क को टेरट-ब्यूटिल एन-[2-$2-2-(2-एमिनोएथॉक्सी)इथॉक्सी]एथिल-कार्बामेट (5, 0.41 ग्राम, 1.65 एममोल), यौगिक 3 (0.41 ग्राम, 1.50 एमएल), सूखी डीएमएफ (10 एमएल) और डीआईपीईए (0.39 ग्राम, 0.50 मीटर)। एक हलचल बार और एक भाटा कंडेनसर के साथ लैस. 10 एच के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर आर्गन वातावरण के तहत गर्मी।
    2. कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, एच2ओ (100 एमएल) पर गहरे हरे रंग का मिश्रण डालना और एक अलग कीप में EtOAc (3x 50 एमएल) के साथ निकालें। एच2ओ (50 एमएल) और नमकीन (50 एमएल) के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों को धो लें, ना2SO4पर सूखा, फिल्टर, और धानी में ध्यान केंद्रित करें।
    3. सिलिका जेल (3 सेमी कॉलम व्यास और 60 सेमी ऊंचाई) पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध पेट्रोलियम ईथर/
  6. होमोडाइमर की तैयारी (कम्पाउंड 8)
    1. जेड-डायमाइन लिंकर 6 (0.22 ग्राम, 0.22 एमएल, 1.50 एमएल), डीआईपीईए (1.05 एमएल, 6.00 एमएल) और सूखे डीएमएसओ (20 एमएल) में 3 (0.83 ग्राम, 3.00 एमएल) का घोल मिलादें। 18 एच के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर आर्गन वातावरण के तहत गर्मी।
    2. कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, एच2ओ (100 एमएल) पर गहरे हरे रंग का मिश्रण डालना और एक अलग कीप में EtOAc (3x 50 एमएल) के साथ निकालें। एच2ओ (50 एमएल) और नमकीन (50 एमएल) के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों को धोएं, ना2SO4पर सूखा, फिल्टर करें और धानी में ध्यान केंद्रितकरें।
    3. सिलिका जेल (3 सेमी कॉलम व्यास और 50 सेमी ऊंचाई) पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध पेट्रोलियम ईथर/
  7. हेटेरोडिमर की तैयारी (कम्पाउंड 9)
    1. शुष्क सीएच2सीएल2 (10 एमएल) में यौगिक 7 (0.83 ग्राम, 1.65 एमएल) को भंग करें। ट्राइफ्लोरोऐसीटिक एसिड (10 एमएल) जोड़ें और एक बंद 50 एमएल गोल नीचे फ्लास्क में 2 एच के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर पीले मिश्रण हलचल।
    2. उतार-चढ़ाव निकालें और CH2Cl2 (4x 5 एमएल) के साथ वाष्पित करें। 10 ज के लिए धानी में अवशेषों को सुखा लें।
    3. सूखी DMF (20 एमएल) में सामग्री को घोलना। यौगिक 4 (0.44 ग्राम, 1.50 mmol) और DIPEA (0.78 ग्राम, 1.05 एमएल, 6.00 mmol) जोड़ें और फ्लास्क को भाटा संघनित्र से सुसज्जित करें। 10 एच के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर आर्गन वातावरण के तहत गर्मी।
    4. कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, एच2ओ (100 एमएल) पर गहरे हरे रंग का मिश्रण डालना और एक अलग कीप में EtOAc (3x 50 एमएल) के साथ निकालें। संतृप्त NaHCO3 (50 एमएल), एच2ओ (50 एमएल), 10% KHSO4 (50 एमएल), एच2ओ (50 एमएल), और नमकीन (50 एमएल), ना2SO4,फिल्टर और धानी में ध्यान केंद्रित के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों को धो लें।
    5. सिलिका जेल (3 सेमी कॉलम व्यास और 50 सेमी ऊंचाई) पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध पेट्रोलियम ईथर/
    6. परमाणु चुंबकीय अनुनाद पर 1एच एनएमआर और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रम द्वारा अणु संरचना (चित्र5क यौगिक 8, 5बी यौगिक 9) का एल्यूसी और सत्यापित करना स्पेक्ट्रोमीटर. जाँच करें कि दोनों यौगिकों की शुद्धता से अधिक है 97% तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से (एलसी-एमएस), एक डायोड सरणी का पता लगाने (डीएडी) पर लागू करने 220-500 एनएम.

2. PROTAC अणुओं के कार्यात्मक सत्यापन

  1. PROTACs द्वारा CRBN गिरावट के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
    नोट: यौगिक के प्रभाव8और यौगिक9CRBN प्रोटीन स्तर पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया. इसके अलावा, आईकेजेडएफ1 और आईकेजेडएफ3 के स्तर पर प्रभाव की भी पुष्टि की जा सकती है (चित्र 6).
    1. नमूना तैयारी
      1. 10 एम एम, अलीकोट की एकाग्रता में DMSO में 8 और 9,lenalidomide (लेन), pomalidomide (पोम), MG132, और MLN-4924 को भंग करें 10 एम एम, अलीकोट की एकाग्रता में और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. बीज 1 x 106 MM1S कोशिकाओं के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में 2.5 एमएल मीडिया और 100 nM या 1 $M यौगिक 8 या 9 के साथ कोशिकाओं का इलाज 24 एच के लिए.
      3. उपचार के बाद फसल कोशिकाओं और 700 x gपर अपकेंद्रित्र , 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस। शेष मीडिया को हटाने के लिए ठंड 1x पीबीएस के साथ सेल गोली धोएं, 700 x gपर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस, और सुपरनेंट को त्यागें। इस चरण को एक बार दोहराएँ.
      4. lysis बफर में Lyse कोशिकाओं (25 एम Tris HCl पीएच 7.4, 150 एम एम NaCl, 1% एनपी-40, 1 एम एम EDTA, 5% ग्लिस्टरॉल, 1x Protease और Phosphatase अवरोधक कॉकटेल) बर्फ पर 10 मिनट के लिए, 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए, 4 $ सी. हार्वेस्ट supernatant और एक bicinoninic एसिड प्रोटीन परख (बीसीए परख) द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार.
      5. 1x एलडीएस लोडिंग बफर (5% 2-मरकैप्टोथेनोल) के साथ विकृत प्रोटीन (15-30 डिग्री/प्रतिदर्श) और 10 मिनट, 75 डिग्री सेल्सियस उबालें।
    2. एसडीएस-पेज
      1. एक 10% अलग जेल के साथ जेल सैंडविच फिक्स [4 एमएल 3x जेल बफर (3 एम Tris / 0.3% (w/v) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), पीएच 8.45), 4 एमएल acrylamide 30%, 2.52 एमएल ग्लिसरॉल 50%, 1.395 एमएल एच2ओ, 75 $L 11% अमोनियम persulfate (एपीएस), और 9.75L TEMED] और एक geling 4 [1.992 एमएल 3x जेल बफर, 0.792 एमएल 30% acrylamide, 3.168 एमएल एच2हे, 36 [L 11% एपीएस, और 6 [L TEMED] एक इलेक्ट्रोड विधानसभा इकाई में. कंघी निकालें, कैथोड बफर के साथ फ्लश कुओं (100 एमएम Tris/HCl, 100 m tricine, 0.1% (w/v) एसडीएस), और लोड नमूने.
      2. टैंक में एनोड बफर (100 एम एम ट्रास/एचसीएल, पीएच 8.9) भरें। चरण 2.1.1.4 से प्रोटीन नमूना लोड करें और 70 ट, 20 मिनट, इसके बाद 115 वी, 150 मिनट पर लगातार वोल्टेज पर एसडीएस-पेज चलाएं।
    3. इम्यूनोब्लोटिंग और CRBN, आईकेजेडएफ 1 और आईकेजेडएफ3 का पता लगाना
      1. 1 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में PVDF झिल्ली (0.45 डिग्री) को सक्रिय करें। समान झिल्ली और 1x हस्तांतरण बफर में जेल को अलग करना [10x स्थानांतरण बफर (192 एमएम ग्लिसिन, 25 एमएम ग्लिसिन, 25 एमएम ट्राइस-बेस/एचसीएल, 900 एमएल एच2ओ), 20% मेथनॉल, 0.1% एसडीएच, पी एच 8$3।
      2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ब्लॉटिंग कैसेट इकट्ठा करें। 90 मिनट के लिए 180 मा पर स्थानांतरण जेल।
      3. 1x टीबीएस-टी (25 एमएम ट्रास/एचसीएल, 150 एमएम नैकल, पीएच 7.6, 0.1% ट्वीन 20) में 5-10 मिनट प्रत्येक कमरे के तापमान पर 3x झिल्ली धोएं। कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 5% nonfat-सूखे दूध (NFDM), टीबीएस-टी में ब्लॉक झिल्ली। कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5-10 मिनट के लिए 1X टीबीएस-टी में झिल्ली 3x धोएं।
      4. CRBN के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट झिल्ली (1:500 में 5% बीएसए, टीबीएस-टी) 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए, रात भर के साथ।
      5. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5-10 मिनट के लिए 1X टीबीएस-टी में झिल्ली 3x धोएं। एंटी-माउस के साथ इनक्यूबेट झिल्ली (1:10.000 में 5% एनएफडीएम, टीबीएस-टी) या एंटी-रैबिट (1:5.000 में 5% एनएफडीएम, टीबीएस-टी) माध्यमिक एंटीबॉडी को हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस एचआरपी (1 एच कमरे के तापमान पर।
      6. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5-10 मिनट के लिए 1X टीबीएस-टी में झिल्ली 2x धोएं। 1x टीबीएस के साथ दो बार इस चरण को दोहराएँ।
      7. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एचआरपी सब्सट्रेट समाधान के साथ 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट झिल्ली और एक chemiluminescence का पता लगाने डिवाइस में chemiluminscence का पता लगाने।
      8. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5-10 मिनट के लिए 1X टीबीएस में झिल्ली 1x धोएं। एंटीबॉडी की रिहाई के लिए, 15 मिनट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अलग करना बफर में पट्टी झिल्ली. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5-10 मिनट के लिए 1X टीबीएस में वॉश झिल्ली 3x।
      9. कमरे के तापमान पर 5% नॉनफैट-ड्राईड दूध, टीबीएस-टी के लिए 1 एच में झिल्ली को ब्लॉक करें। धो झिल्ली 3x में 1x टीबीएस-टी के लिए 5-10 मिनट प्रत्येक कमरे के तापमान पर और IK$F1, IK$F3 या tubulin के साथ reprobe चरण 2.1.3.4 के अनुसार.
  2. MG132, MLN4942 या pomalidomide के साथ प्रतियोगिता प्रयोगों
    नोट: CRBN सर्वव्यापक पथ के माध्यम से निम्नीकृत है कि क्या पुष्टि करने के लिए, हम proteasome अवरोध करनेवाला MG132 और एक neddylation सक्रिय एंजाइम (NAE) अवरोध करनेवाला MLN4942 के साथ प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन किया (चित्र 7).
    1. बीज 1 x 106 MM1S कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति. 10 डिग्री एम एमजी 132, 10 डिग्री एम एमएलएन4942, या लीनालिडोमाइड (100x) के साथ ट्रीट्रीट कोशिकाओं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच इनक्यूबेट, 5% सीओ2।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 h के लिए 100 एनएम यौगिक 8 जोड़ें, 5% सीओ2.
    3. चरण 2.1.1 के अनुसार पश्चिमी दाग के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं.
  3. एकाधिक मायलोमा सेल लाइनों में सेल व्यवहार्यता परख
    नोट: इस परख सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है और इसके अलावा, यौगिक 8 के साथ कोशिकाओं के pretreatment द्वारा एकाधिक myeloma कोशिकाओं पर IMiDs के प्रभाव का विरोध (चित्र 8, चित्र 9A, बी) .
    1. बीज 5 x 104 MM1S कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में जैविक triplicates में व्यवहार्यता परख के लिए. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, बीज 1 x 106 MM1S कोशिकाओं को अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से जैविक triplicates में एक 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं.
    2. DMSO या 100 nM, 1 $M, या 10 डिग्री सेल्सियस यौगिक 8, यौगिक 9 या pomalidomide और 24 एच, 48 एच, या 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 एच के लिए इनक्यूबेट के साथ कोशिकाओं का इलाज, 5% सीओ2. बचाव प्रयोगों के लिए, 100 एनएम यौगिक 8 के साथ कोशिकाओं का इलाज 3 एच के लिए, पहले या इसके बाद 1 $M pomalidomide और 96 h के लिए इनक्यूबेट.
    3. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 6-वेल प्लेट से एक प्लेट रीडर या फसल कोशिकाओं पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, एक luminescent सेल व्यवहार्यता परख के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट luminscence उपाय।

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Representative Results

यहाँ हम CRBN की गिरावट के लिए एक homodimeric pomalidomide आधारित PROTAC के डिजाइन, संश्लेषण और जैविक मूल्यांकन का वर्णन किया. हमारे PROTAC दो CRBN अणुओं और रूपों त्रिअंगी परिसरों के साथ एक साथ सूचना का आदान प्रदान करता है कि आत्म-सबब्युटिनेशन और CRBN के proteasomal गिरावट प्रेरित केवल कम से कम शेष प्रभाव के साथ pomalidomide-प्रेरित नव substrates IK$F1 या IK$F3.

पहले प्रकाशित pomalidomide आधारित PROTAC अणुओं की एक श्रृंखला में से24,यौगिक 8 CRBN के रासायनिक प्रेरित गिरावट में विशेष रूप से कुशल था. इसका संश्लेषण निम्नानुसार पूरा किया जा सकता है (चित्र 4) । एक 1,1'-कार्बोनिलडिमिडाज़ोल-प्रोन्नत द्रवण बोक-सुरक्षित एल-ग्लूटामाइन की ओर जाता है जो चक्रीकृत इमिड 1की ओर जाता है। एन-मेथिलयुक्त एनालॉग 2 मिथाइल आयोडाइड के साथ ऐल्किलन के माध्यम से पहुँचा जा सकता है। दोनों बिल्डिंग ब्लॉक (1 और 2) अम्लीय परिस्थितियों में एन-डीप्रोटेशन के बाद, एक अंगूठी खोलने / फ्लुओरोफ्थालिक एनहाइड्राइड। Thalidomide एनालॉग, सामान्य रूप में, hydrolytic अपघटन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और केवल पर्याप्त सुखाने के बाद अगले चरण में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यौगिक 3 प्राथमिक अलिफैटिक ऐमीन25के साथ एक खुशबूदार नाभिक प्रतिस्थापन के लिए अतिसंवेदनशील है; इस रूपांतरण के लिए कुशलता से आगे बढ़ने के लिए केवल जब सूखी सॉल्वैंट्स का उपयोग किया जाता है पाया गया. एक सच्चे homodimeric उत्पाद के डिजाइन दो समान कार्यात्मक substructures और सममित linker के आवेदन के linker कनेक्शन का तात्पर्य है. लिंकर जो PROTAC 8 का हिस्सा है एक N-to-N, polyethylene आधारित रैखिक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करता है. संगत ,डायमिन 6 वांछित अंतिम यौगिक 8 की ओर जाता है जब 90 डिग्री सेल्सियस पर डीएमएसओ में 1:2 के मोलर राशन में बिल्डिंग ब्लॉक 3 के साथ प्रतिक्रिया की जाती है। अन्य विश्लेषणात्मक आंकड़ों24में , 8 की संरचना को एनएमआर स्पेक्ट्रम द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 5क) . यौगिक 9, एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में डिजाइन, एक ही कम है, लेकिन महत्वपूर्ण संरचनात्मक विचलन, सक्रिय होमो-प्रोटाक 8की तुलना में. यह ज्ञात है कि ग्लूटारीमाइड भाग के भीतर एन-मेथिलेशन CRBN बंधन26,27को समाप्त कर देते हैं . ऋणात्मक नियंत्रण यौगिक 9 के एक पोमालीडोमाइड भाग में एन-मेथिल अवशेष होते हैं। इसे एन-मोनोप्रोफित लिंकर बिल्डिंग ब्लॉक 5के साथ 3 के प्रथम न्यूक्लिओफिलिक प्रतिस्थापन द्वारा तैयार किया जा सकता है , जिसके बाद बोक सुरक्षा समूह के दरार और बाद में युग्मन मध्यवर्ती 4के लिए किया जा सकता है . इसकी असममित संरचना के कारण कुछ संगत कार्बनों ने 13 ब् एनएमआर संकेतों को अलग-अलग दिखाया (चित्र 5ठ)।

होमो-प्रोटाक 8 अत्यधिक शक्तिशाली पाया गया था, जिससे CRBN का लगभग पूर्ण प्रोटेसोमल अवक्रमण हो गया था। कई मायलोमा कोशिकाओं में CRBN, आईकेजेडएफ 1 और आईकेजेडएफ 3 प्रोटीन के स्तर की व्याख्या पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 6, चित्र 7, चित्र 9B), एक अर्द्ध-मात्रात्मक मानक विधि, जहां प्रोटीन में परिवर्तन अभिव्यक्ति आसानी से पता लगाया जा सकता है. इस कागज में इस्तेमाल एंटीबॉडी अच्छी गुणवत्ता के हैं और विधि हमारी प्रयोगशाला में एक अनुकूलित मानक प्रक्रिया है।

इसके अतिरिक्त, यौगिक 8 द्वारा CRBN की अवक्रमण से सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और आईएमआईडी (चित्र8, चित्र 9 ए) को प्रतिरोध प्रदान किया गया जो एसजीआरएन द्वारा CRBN के CRISPR/Cas9-मध्यस्थ नॉकआउट के अनुरूप है24. सेल व्यवहार्यता परख में luminscence संकेत एटीपी रिलीज, जो मृत कोशिका गिनती के रूप में व्याख्या की जा सकती पर आधारित था. इस विधि को आसानी से नमूनों की एक उच्च संख्या के साथ एक कम समय में किया जा सकता है. व्यवहार्य/मृत कोशिकाओं की माप के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एक एनेकिन V/

Figure 1
चित्र ााा्वित १: ई 3 यूबिक्विटिन लिगास CRBN IMiDs का मुख्य लक्ष्य है। इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाएं CRBN को बांधती हैं और प्रोटीसोमल निम्नीकरण के लिए कई नव-सब्स्ट्रेट्स की भर्ती करती हैं। लिम्फोइड प्रतिलेखन कारकों की IMiD-प्रेरित गिरावट आईकेजेडएफ 1 और आईकेजेडएफ 3 कई मायलोमा कोशिकाओं और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों में से कुछ पर प्रभाव के लिए जिम्मेदार है। केसिन काइनेज 1 " चुनिंदा lenalidomide द्वारा अपमानित किया जाता है, लेकिन अन्य IMids नहीं है और गुणसूत्र 5के के नुकसान के साथ मायलोडिसमाइड में लीनालिडोमाइड की गतिविधि के लिए योगदान देता है। SALL4 हाल ही में सभी IMiDs है कि संभावना thalidomide और उसके एनालॉग द्वारा प्रेरित teratogenicity से जुड़ा हुआ है की एक आम लक्ष्य के रूप में की खोज की थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रोटीसी ब्याज (पीओआई) के प्रोटीन को नीचा दिखाते हैं। प्रोटाक्स हेटेरोबीफंक्शनल अणु हैं, जहां एक लिंकर एक सर्वव्यापक लिगेज़ लिगन्ड को एक POI लिगन्ड से जोड़ता है। त्रिअंगी परिसरों के गठन से, CRBN जैसे सर्वव्यापक लिगेस, फिर पीओआई को सर्वव्यापक बना देता है, जिसके परिणामस्वरूप इसका प्रोटीसोमल अवक्रमण होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ई 3 यूबीक्विटिन लिगासे CRBN की गिरावट के लिए द्विकार्यात्मक होमो-प्रोटीएसी। एक पोमलिडोमाइड-आधारित होमो-प्रोटीक में, दो सर्वव्यापक लिगेज बांधने की मशीन सीआरबीएन के क्रॉस-सर्वाबिनेशन को प्रेरित करने के लिए जुड़े हुए हैं जिसके परिणामस्वरूप CRBN की रासायनिक रूप से प्रेरित दस्तक दी जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: होमोडीमर 8 और हेटेरोडर 9 का संश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: 1एच एनएमआर (ऊपर) और 13सी एनएमआर (नीचे) स्पेक्ट्रम। एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर DMSO-d6 में यौगिक 8 (ए) और यौगिक 9 (बी) का स्पेक्ट्रम दर्ज किया गया. रासायनिक बदलाव प्रति मिलियन (पीपीएम) भागों में दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: CRBN, IK$F1, और आईकेजेडएफ 3 पर यौगिकों 8 और 9 के प्रभाव। पोमलिडोमाइड-आधारित होमो-प्रोटाक यौगिक 8 आईकेजेडएफ 1 और आईकेजेडएफ 3 पर पोमलिडोमाइड के कमजोर शेष प्रभावों के साथ CRBN गिरावट लाती है। इसके विपरीत, यौगिक 9 जिसमें पोमालीडोमाइड अवशेषों में से एक पर एक मिथाइल समूह होता है, इंगित सांद्रता (जत्) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। MM1S कोशिकाओं 24 एच उपचार के लिए इलाज किया गया. CRBN पर प्रभाव, आईकेजेडएफ 1, आईकेजेडएफ 3 और ट्यूबुलिन (लोडिंग नियंत्रण) का पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: CRBN गिरावट proteasome अवरोध करनेवाला MG132 द्वारा या MLN4942 द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है कि ब्लॉक सबबक्विटीन ligases परोक्ष रूप से neddylation निषेध के माध्यम से. एकाधिक myeloma सेल लाइन MM1s के साथ pretreated किया गया था 10 $M MG132, 10 डिग्री एम MLN4924 के लिए 1 एच के लिए होमो-प्रोटाक यौगिक 8 पर 100 एनएम के अलावा संयुक्त उपचार के लिए 3 एच. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: एमएमए1S एकाधिक myeloma कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता परख. 24 ज, 48 ज और 96 एच उपचार के बाद पोमलिडोमाइड संवेदनशील मायलोमा सेल लाइन MM1S में सेल व्यवहार्यता पर यौगिक 8 और नकारात्मक बंधन नियंत्रण यौगिक 9 के प्रभाव। सेल व्यवहार्यता triplicates में 4 दिनों के बाद मापा गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: यौगिक 8 एकाधिक मायलोमा सेल लाइनों में पोमालीडोमाइड के प्रभाव का विरोध करता है। कोशिकाओं के साथ pretreated थे 100 एनएम यौगिक 8 के लिए 3 एच. बाद में 1 $M pomalidomide जोड़ा गया था. सेल व्यवहार्यता triplicates में 4 दिनों के बाद मापा गया था. p और0.001 छात्र के अनुसार t-परीक्षण (ए) . CRBN के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, आईकेजेडएफ 1, आईकेजेडएफ 3 और ट्यूबुलिन (लोडिंग नियंत्रण) के साथ MM1S कोशिकाओं के pretreatment के बाद 100 एनएम यौगिक 8 के लिए 3 एच, के अलावा से पहले 1 $M pomalidomide (बी). Steinebach, C. et. 201824से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) | कॉपीराइट 2019 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीआरबीएन के लिए यहां वर्णित ऐसे होमो-प्रोटाक्स का डिजाइन CRBN को पोमलिडोमाइड की विशिष्ट आत्मीयता पर निर्भर करता है, जिसे सफलतापूर्वक कई हेटेरोबीफंक्शनल प्रोटाक में उपयोग किया गया है और प्रोटीएसी 8 के विकास के परिणामस्वरूप एक अत्यधिक चयनात्मक CRBN नीचाकरनेवाला. हमारे अणु की विशिष्टता की पुष्टि प्रोटीओमिक विश्लेषणों द्वारा पहलेही की जा चुकी है . आनुवंशिक रूप से मध्यस्थता नॉकआउट के लिए, बहिष्करण और साइड इफेक्ट के सत्यापन चुनौतीपूर्ण और समय लगता है. इसके अतिरिक्त, रासायनिक रूप से प्रेरित नॉकडाउन प्रतिवर्ती, तीव्र और सीधे कोशिकाओं और ऊतक प्रकारों के व्यापक स्पेक्ट्रमपरलागू होता है।

आईएमआइडी थैलिडोमाइड, लीनालिडोमाइड, और पोमलिडोमाइड कई माइलोमा, बी-सेल लिंफोमा और मायलोडिसप्लास्टिक सिंड्रोम के उपचार में एक मुख्य आधार बन गए हैं। IMIDs CRBN-CRL4 E3 लिगे की विशिष्टता को मॉडुलन द्वारा उनकी गतिविधि को मध्यस्थता करने के लिए नव-substrates आईकेजेडएफ 1, आईकेजेडएफ 3, या सीके1 जेडएफ3 , 6 ,11,29को नीचा करने के लिए । इसके अलावा, IMIDs दो अन्य प्रोटीन, MCT-1 और BSG, कि भी कई myeloma विकास30के लिए महत्वपूर्ण हैं पर CRBN के chaperone समारोह को समाप्त करने के लिए दिखाया गया है. होमो-द्विकार्यात्मक प्रोटाक द्वारा CRBN की गिरावट अच्छी तरह से सबसे एकाधिक myeloma सेल लाइनों का परीक्षण द्वारा सहन किया गया था, जिसका अर्थ है कि CRBN निष्क्रियता अकेले एकाधिक myeloma कोशिकाओं की हत्या का कारण पर्याप्त नहीं है. इसके विपरीत, यौगिक 8 के साथ पूर्व उपचार आईकेजेडएफ 1/3 गिरावट पर आईएमआईडी के प्रभाव को समाप्त कर दिया और lenalidomide और pomalidomide से कई myeloma कोशिकाओं को बचाया। यह CRBN की आनुवंशिक निष्क्रियता और हानिकारक CRBN उत्परिवर्तनों के साथ लाइन में है lenalidomide-प्रतिरोधी एकाधिक myeloma रोगियों में पाया और IMIDs31,32 के तंत्र में CRBN की आवश्यक भूमिका पर प्रकाश डाला गया . इसलिए होमो-प्रोटाक 8 IMiD प्रतिरोध के एक राज्य की नकल करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। IMiDs के अन्य प्रभाव जो अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं जैसे एंजियोजेनिकिटी या टीएनएफ के निषेध CRBN फ़ंक्शन के निषेध से प्राप्त हो सकते हैं और हमारा होमो-प्रोटाक आगे CRBN की निष्क्रियता की जांच करने के लिए उपयुक्त उपकरण हैं। इसके अलावा, यौगिक 8 द्वारा CRBN के रासायनिक प्रेरित दस्तक CRBN के नए अंतर्जात substrates की पहचान करने में मदद कर सकते हैं और CRBN के शारीरिक कार्यों को स्पष्ट. यह देखते हुए कि हमारे यौगिक 8 कैंसर सेल लाइन प्रसार पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, CRBN अवरोध अकेले कोई विरोधी ट्यूमर गतिविधि है. हालांकि, CRBN degraders नैदानिक कैंसर के अलावा अन्य रोगों में लागू हो सकता है. इस संबंध में, CRBN निष्क्रियता हाल ही में सेप्सिस के लिए प्रतिरोध प्रदान करने के लिए और चूहों में उच्च वसा-आहार प्रेरित मोटापे को रोकने के लिए दिखाया गया था 33,34,35.

अंत में, हम उत्पन्न और CRBN के पहले रासायनिक अवरोध करनेवाला है कि CRBN से संबंधित संकेतन और thalidomide और उसके एनालॉग के आणविक तंत्र पर भविष्य जैव चिकित्सा जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं मान्य.

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Disclosures

लेखकों के हित के एक संभावित वित्तीय संघर्ष की घोषणा नहीं करते.

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था (Emmy-Noether कार्यक्रम Kr-3886/2-1 और SFB-1074 जे.के.; FOR2372 से M.G.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1'-Carbonyldiimidazole TCI chemicals C0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) Sigma-Aldrich 385506 Compound 6
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % Alfa Aesar A12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 % Acros 148270250 Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) Carl Roth 3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB Cell signaling 15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbit Sigma HPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody Sigma 7074S
Ammonium Persulfate Roth 9592.2
Boc-Gln-OH TCI chemicals B1649
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7571
ChemiDoc XRS+ Bio-Rad 1708265
DMF, anhydrous, 99.8 % Acros 348435000 Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 % Acros 348445000 Extra Dry over Molecular Sieve
Glycine Sigma-Aldrich 15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated) Santa Cruz biotechnology sc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) Thermo Scientific 1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab Cell signaling 14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) Merck IPVH000010
Iodomethane, 99 % Sigma-Aldrich I8507 Highly toxic
Methanol Sigma-Aldrich 32213-2.5L
Mg132 Selleckchem S2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell Bio-Rad 1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658004
MLN4942 biomol (cayman) Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) Sigma T5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % Alfa Aesar A11801
Nonfat dried milk powder PanReac AppliChem A0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate Thermo Scientific 136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Thermo Scientific NP0008
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Pomalidomide Selleckchem S1567
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46430
sodium dodecyl sulfate Carl Roth 183.1
Sodium Chloride Sigma-Aldrich A9539-500g
TEMED Carl Roth 2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate Sigma-Aldrich 89761 Compound 5
Tricin Carl Roth 6977.4
Trizma base Sigma-Aldrich T1503-1kg
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
WesternBright ECL spray Advansta K-12049-D50

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References

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Lindner, S., Steinebach, C., Kehm, H., Mangold, M., Gütschow, M., Krönke, J. Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs. J. Vis. Exp. (147), e59472, doi:10.3791/59472 (2019).

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