Summary
Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.
Abstract
De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, alle door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van multipel myeloom, induceren alomtegenwoordig en afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3) via de cereblon (CRBN) E3 ubiquitine ligase voor proteasomale afbraak. IMiDs zijn recentelijk gebruikt voor het genereren van bifunctionele proteolyse gericht op chimeras (Protac's) om andere eiwitten op te richten voor alomtegenwoordige en proteasomale afbraak door de CRBN E3 ligase. We ontwierpen en synthetiseerden homobifunctionele Protac's op basis van pomalidomide en analyseerden hun vermogen om zelfgeleide alomtegenwoordige en afbraak van CRBN te induceren. Hier fungeert CRBN als beide, de E3 ubiquitine ligase en het doelwit op hetzelfde moment. De homo-PROTAC compound 8 DEGRADEERT crbn met een hoge potentie met slechts minimale resterende effecten op IKZF1 en IKZF3. CRBN inactivatie door compound 8 had geen effect op de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van verschillende multipel myeloom cellijnen. Deze homo-PROTAC abrogates de effecten van IMiDs in multipel myeloomcellen. Daarom kunnen onze homodimere pomalidomide-gebaseerde verbindingen helpen om de endogene substraten en fysiologische functies van CRBN te identificeren en het moleculaire mechanisme van IMiDs te onderzoeken.
Introduction
De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, allemaal goedgekeurd voor de behandeling van multipel myeloom, binden aan de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), een substraat adapter voor cullin4A-RING E3 ubiquitine ligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding van imids verbetert de affiniteit van CRL4crbn voor de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3), leidend tot hun alomtegenwoordige en afbraak (Figuur 1)4,5, 6 , 7 , 8. Aangezien IKZF1 en IKZF3 essentieel zijn voor multipel myeloomcellen, resulteert hun inactivatie in groeiremming. SALL4 werd onlangs gevonden als een extra imid-geïnduceerde Neo-substraat van crbn die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de teratogeniciteit en de zogenaamde contergan catastrofe in de jaren 1950 veroorzaakt door thalidomide9,10. Caseïne kinase 1α (CK1α) is daarentegen een lenalidomide-specifiek substraat van CRBN dat betrokken is bij het therapeutische effect in myelodysplastisch syndroom met chromosoom 5q deleties11.
Het vermogen van kleine moleculen om een specifiek eiwit voor afbraak te targeten, is een spannende implicatie voor de moderne Geneesmiddelenontwikkeling. Hoewel het mechanisme van thalidomide en zijn analogen werd ontdekt na hun eerste gebruik bij de mens, werden zogenaamde PRoteolyse targeting Chimeras (protac's) ontworpen om specifiek te richten op een eiwit van belang (POI) (figuur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protac's zijn heterobifunctionele moleculen die bestaan uit een specifieke ligand voor de POI verbonden via een linker aan een ligand van een E3 ubiquitine ligase zoals crbn of von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induceren de vorming van een voorbijgaande ternaire complex, dat de POI naar de E3 ubiquitine ligase leidt, resulterend in de alomtegenwoordige en proteasomale afbraak. De belangrijkste voordelen van Protac's ten opzichte van conventionele remmers is dat de binding aan een POI voldoende is in plaats van de remming ervan en daarom kunnen Protac's zich mogelijk richten op een veel breder spectrum van eiwitten, waaronder die welke als niet-Versleep baar werden beschouwd, zoals transcriptiefactoren15. Bovendien, chimerische moleculen handelen katalytisch en hebben daarom een hoge potentie. Na ubiquitine Transfer naar de POI, de ternaire complex dissocieert en is beschikbaar voor de vorming van nieuwe complexen. Zo zijn zeer lage PROTAC concentraties voldoende voor de afbraak van het doelwit eiwit23.
Hier beschrijven we de synthese van een geconjugeerde homo-PROTAC (compound 8) van pomalidomide-pomalidomide, die crbn aanwervent voor de afbraak van zichzelf24. De E3 ubiquitine ligase CRBN fungeert als zowel de recruiter en het doelwit op hetzelfde moment (Figuur 3). Om onze gegevens te valideren, hebben we ook een negatieve binding Control gesynthetiseerd (compound 9). Onze gegevens bevestigen dat de nieuw gesynthetiseerde homo-PROTAC specifiek is voor CRBN-degradatie en slechts minimale effecten heeft op andere eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van PROTAC moleculen
Let op: Raadpleeg voor gebruik alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSD'S). Een aantal van de chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Bereiding van tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 1)
- Voeg 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) en een katalytisch bedrag van 4-(Dimethylamino) pyridine (5 mg) aan een mengsel van BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 mL) in 100 mL ronde bodem kolf met roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm tijdens het roeren gedurende 10 uur totdat er een heldere oplossing wordt gevormd.
- Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een roterende verdamper, voeg EtOAc (200 mL) toe en breng het over in een scheitrechter. Was de organische laag met H2O (50 ml) en pekel (50 ml) en droog hem over na2dus4.
- Filtreer de oplossing door een korte pad silicagel (5 cm diameter en 5 cm hoogte) en eluaat met een verder volume (200 mL) van EtOAc.
- Damp het oplosmiddel in en droog het verkregen kleurloze vaste stof in vacuo.
- Bereiding van tert-butyl N-(1-methyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 2)
- Combineer compound 1 (2,28 g, 10 mmol) met gemalen Kaliumcarbonaat (2,76 g, 20 mmol) en DMF (25 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml. Voeg met behulp van een spuit iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) toe en rust de kolf uit met een geperforeerde rubberen septum. Plaats het reactievat in een bad met ultrasone trillingen voor 2 uur.
- Verdun het reactiemengsel met EtOAc (100 mL) en breng het over in een separatoire trechter. Was de organische laag met 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) en pekel (25 ml), en droog hem over na2dus4.
- Filter en damp het oplosmiddel in. Reinig het product per Kolomchromatografie over silicagel (kolom diameter 6 cm en 20 cm hoogte) met behulp van petroleumether/EtOAc (2:1).
- Bereiding van 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-yl) 4-fluoroisoindoline-1, 3-dione (Compound 3)
- Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.
- Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.
- Bereiding van 4-Fluoro-2-(1-methyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl) isoindoline-1, 3-dione (Compound 4)
- Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.
- Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.
- Bereiding van tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-] (2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] ethoxy] ethoxy] ethyl] carbamaat (samenstelling 7)
- Laad een ronde bodem kolf van 50 mL met tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] carbamaat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), samenstelling 3 (0,41 g, 1,50 mmol), droge DMF (10 ml) en Dierwt (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Uitrusten met een roer stang en een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.
- Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter, en concentraat in vacuo.
- Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 60 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:1 tot 1:2).
- Bereiding van homodimeer (compound 8)
- Combineer de α, ω-diamine linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dierwt (1,05 ml, 6,00 mmol) en een oplossing van 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) in droge DMSO (20 ml) in een ronde bodem kolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 18 uur.
- Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuuem.
- Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.
- Bereiding van heterodimer (compound 9)
- Los samengestelde 7 (0,83 g, 1,65 mmol) op in droge l2cl2 (10 ml). Voeg trifluorazijnzuur (10 mL) toe en roer het gele mengsel bij 40 °C gedurende 2 uur in een gesloten ronde bodem kolf van 50 mL.
- Verwijder de vluchtige stoffen en coverdampen met CH2cl2 (4x 5 ml). Droog het residu in vacuuem gedurende 10 uur.
- Het materiaal in droge DMF (20 mL) opnieuw oplossen. Voeg samenstelling 4 (0,44 g, 1,50 mmol) en dipea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) toe en rust de kolf uit met een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.
- Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met verzadigde NaHCO3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2O (50 ml), en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuo.
- Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.
- Elucidate en verifieer de molecuulstructuur (figuur 5a compound 8, 5b compound 9) door 1H NMR en 13C NMR spectra in DMSO-d6 op een nucleaire magnetische resonantie (NMR) Spectrometer. Controleer dat de zuiverheid van beide verbindingen hoger is dan 97% door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), het toepassen van een diode array detectie (DAD) bij 220 – 500 nm.
2. functionele validering van PROTAC moleculen
- Western Blot-analyse van CRBN-afbraak door Protac's
Opmerking: de effecten van samengestelde8en samengestelde9op CRBN eiwit niveau werden getest door Western Blot analyse. Bovendien kan de impact op IKZF1-en IKZF3-niveaus ook worden bevestigd (Figuur 6).-
Monstervoorbereiding
- Los verbindingen 8 en 9, lenalidomide (len), pomalidomide (POM), MG132 en mln-4924 in DMSO bij een concentratie van 10 mm, aliquot en bewaar bij-80 °c tot verder gebruik.
- Zaad 1 x 106 MM1S cellen in een 6-put plaat met 2,5 ml media en behandel cellen met 100 nm of 1 μM samengestelde 8 of 9 voor 24 uur.
- Oogst cellen na de behandeling en centrifugeer bij 700 x g, 5 min, 4 °c. Was celpellet met koud 1x PBS om de resterende media te verwijderen, te centrifugeren bij 700 x g, 5 min, 4 °c en supernatant weg te gooien. Herhaal deze stap één keer.
- Lyse cellen in lysisbuffer (25 mM tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1x protease & fosfatase inhibitor cocktail) gedurende 10 min op ijs, centrifugeer bij 320 x g gedurende 10 min, 4 °c. Oogst supernatant en bepaal de eiwitconcentratie door een bicinchoninïnezuureiwitassay (BCA-test) volgens het Protocol van de fabrikant.
- Denatuur eiwitten (15 – 30 μg/monster) met 1x LDS laad buffer (5% 2-mercaptoethanol) en kook 10 min, 75 °C.
-
SDS-PAGE
- Fix gel sandwich met een 10% scheiding gel [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8,45), 4 mL acrylamide 30%, 2,52 mL glycerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% ammonium PERSULFAAT (APS), en 9,75 ΜL TEMED] en een 4% stapelen gel [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS en 6 ΜL TEMED] in een elektrode assemblage-eenheid. Verwijder kammen, spoel putten met kathode buffer (100 mM tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) en laad monsters.
- Vul de anode-buffer (100 mM tris/HCl, pH 8,9) in de tank. Load eiwit monster uit stap 2.1.1.4 en voer SDS-PAGE uit op 70 V, 20 min, gevolgd door 115 V, 150 min bij constante spanning.
-
Immunoblotting en detectie van CRBN, IKZF1 en IKZF3
- Activeer PVDF-membraan (0,45 μm) in 100% methanol gedurende 1 min. evenwichts membraan en scheidende gel in 1x overdrachts buffer [10x overdrachts buffer (192 mM Glycine, 25 mM tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
- Monteer de blotting cassette volgens het Protocol van de fabrikant. Transfer gel bij 180 mA voor 90 min.
- Was membraan 3x in 1x TBS-T (25 mM tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Blok membraan in 5% niet-vetgedroogde melk (NFDM), TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.
- Incuberen membraan met primair antilichaam voor CRBN (1:500 in 5% BSA, TBS-T) met zacht schudden bij 4 °C, 's nachts.
- Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Inbroed membraan met anti muis (1:10.000 in 5% NFDM, TBS-T) of anti-konijn (1:5.000 in 5% NFDM, TBS-T) secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase HRP (1 uur bij kamertemperatuur.)
- Was membraan 2x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer met 1x TBS.
- Inincuberen membraan voor 2 minuten met HRP substraat oplossing volgens de protocollen van de fabrikant en detecteren chemiluminescentie in een chemiluminescentie detectie-apparaat.
- Was membraan 1x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Voor het vrijkomen van antilichamen, strip membraan in commercieel verkrijgbare strip buffer voor 15 min. was membraan 3x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.
- Reblokkeer membraan in 5% niet-vetgedroogde melk, TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1x TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur en reprobe met IKZF1, IKZF3 of tubuline volgens stap 2.1.3.4.
-
Monstervoorbereiding
- Competitie experimenten met MG132, MLN4942 of pomalidomide
Opmerking: om te bevestigen of crbn via het ubiquitin-proteasoom traject is afgebroken, hebben we competitie experimenten uitgevoerd met de proteasoomremmer MG132 en een neddylation activerende enzym (NAE) remmer MLN4942 (Figuur 7).- Zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-well plaat. Voorbehandelen van cellen met 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, of lenalidomide (100x), en incuberen 1 h bij 37 °C, 5% CO2.
- Voeg 100 nM compound 8 toe voor 3 uur bij 37 °c, 5% Co2.
- Oogst cellen voor Western Blot volgens stap 2.1.1.
- Levensvatbaarheid van de cel in multipel myeloom cellijnen
Opmerking: deze test wordt gebruikt om de impact op de levensvatbaarheid van de cel te testen en bovendien het effect van IMiDs op multipel myeloomcellen te antagoniseren door voor behandeling van de cellen met compound 8 (Figuur 8, figuur 9a, B).- Zaad 5 x 104 MM1S cellen per put in een 96-goed bord in biologische triplicaten voor levensvatbaarheid assay. Voor Western Blot analyse, zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-put plaat in biologische triplicates.
- Behandel cellen met DMSO of 100 nM, 1 μM of 10 μM samengestelde 8, samengestelde 9 of pomalidomide en inincuberen voor 24 h, 48 h of 96 h bij 37 °C, 5% Co2. Behandel voor reddingsexperimenten cellen met 100 nM-verbinding 8 voor 3 uur, vóór of na toevoeging van 1 μM pomalidomide en inincuberen voor 96 h.
- Meet 96-well plate luminescentie met een lichtgevende cel levensvatbaarheid Assay, volgens het Protocol van de fabrikant op een plaat lezer of oogst cellen uit de 6-well plaat voor Western Blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we het ontwerp, de synthese en de biologische evaluatie van een homodimere pomalidomide gebaseerde PROTAC voor de afbraak van CRBN. Onze protac communiceert gelijktijdig met twee crbn-moleculen en vormt ternaire-complexen die zelf-alomtegenwoordige en proteasomale afbraak van crbn induceren met slechts minimale resterende effecten op pomalidomide-geïnduceerde Neo-substraten IKZF1 of IKZF3.
Uit een reeks eerder gepubliceerde PROTAC moleculen op basis van pomalidomide was24, Compound 8 bijzonder efficiënt in de door chemische geïnduceerde afbraak van crbn. De synthese ervan kan als volgt worden bereikt (Figuur 4). Een 1, 1 '-carbonyldiimidazol-bevorderd condensatie van BOC-beschermde l-glutamine leidt tot de cyclized imide 1. De N-gemethyleerde analoge 2 is toegankelijk via alkylatie met methyljodide. Beide bouwstenen (1 en 2) worden na N-deprotection onder zure omstandigheden getransformeerd tot ftalimidederivaten (3 en 4) in de loop van een ring-opening/recyclization-reactie met behulp van 3- fluorophthalic anhydride. Thalidomide-analogen zijn in het algemeen vatbaar voor Hydrolytische ontleding en mogen alleen in de volgende stap worden gebruikt na voldoende droging. Samengestelde 3 is vatbaar voor een aromatische nucleofiele substitutie met primaire alifatische amines25; Deze conversie bleek alleen efficiënt te werken wanneer droge oplosmiddelen worden gebruikt. Het ontwerp van een echt homodimeric product impliceert de linker aansluiting van twee identieke functionele substructuren en de toepassing van symmetrische linker. De linker die deel uitmaakt van PROTAC 8 vertegenwoordigt een N-op-n, polyethyleen gebaseerde lineaire keten. De corresponderende α, ω-diamine 6 leidt tot de gewenste uiteindelijke verbinding 8 wanneer gereageerd met Building Block 3 in molaire RANTSOEN van 1:2 in DMSO bij 90 °c. Onder andere analytische gegevens24werd de structuur van 8 geverifieerd door NMR spectra (figuur 5a). Compound 9, ontworpen als een geschikte negatieve controle, heeft een slechts minimale, maar kritische structurele afwijkingen, in vergelijking met de actieve homo-protac 8. Het is bekend dat N-methylatie binnen het glutarimide-gedeelte de crbn-binding26,27aboliert. Eén portie pomalidomide van de negatieve controle verbinding 9 draagt een N-methyl residu. Het kan worden bereid door een eerste nucleofiele substitutie van 3 met het N-monoprotected linker Building Block 5, gevolgd door decolleté van de BOC-beschermende groep en een daaropvolgende koppeling met intermediair 4. Vanwege de asymmetrische structuur vertoonden sommige van de overeenkomstige koolstofatomen verschillende 13C NMR-signalen (Figuur 5b).
De homo-PROTAC 8 werd zeer potent waargenomen, wat leidde tot een bijna volledige proteasomale afbraak van crbn. De interpretatie van CRBN-, IKZF1-en IKZF3-eiwit spiegels in multipel myeloomcellen werd bevestigd door de Western Blot-analyse (Figuur 6, Figuur 7, figuur 9b), een semi-kwantitatieve standaardmethode, waarbij de verandering in eiwit expressie kan gemakkelijk worden gedetecteerd. De antilichamen die in dit papier worden gebruikt zijn van goede kwaliteit en de methode is een geoptimaliseerde standaardprocedure in ons laboratorium.
Bovendien was de afbraak van CRBN door compound 8 niet van invloed op de levensvatbaarheid van de cellen en verleende resistentie tegen imids (Figuur 8, figuur 9a), die in lijn is met crispr/Cas9-gemedieerde knock-out van crbn door sgrnas24. Het luminescentie signaal in de cel levensvatbaarheid test was gebaseerd op de ATP-release, die kan worden geïnterpreteerd als dode cellen. Deze methode kan eenvoudig worden uitgevoerd in een korte tijd met een groot aantal monsters. Een alternatieve methode voor het meten van levensvatbare/dode cellen is een Annexin V/7-AAD kleuring door Flowcytometrie.
Figuur 1: de E3 ubiquitine ligase CRBN is het belangrijkste doelwit van IMiDs. Immunomodulerende geneesmiddelen binden aan CRBN en rekruteren verschillende Neo-substraten voor proteasomale afbraak. IMiD-geïnduceerde afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren IKZF1 en IKZF3 is verantwoordelijk voor de effecten op multipel myeloomcellen en sommige van de immunomodulerende eigenschappen. Caseïne kinase 1α wordt selectief afgebroken door lenalidomide maar niet door de andere IMiDs en draagt bij aan de activiteit van lenalidomide in myelodysplastisch syndroom met verlies van chromosoom 5q. SALL4 werd onlangs ontdekt als een gemeenschappelijk doelwit van alle IMiDs die waarschijnlijk verband houden met de teratogeniciteit geïnduceerd door thalidomide en zijn analogen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Protac's degraderen het eiwit van belang (POI). Protac's zijn heterobifunctionele moleculen, waarbij een linker verbindt een ubiquitine ligase ligand aan een POI ligand. Door de vorming van ternaire complexen, een ubiquitine ligase, zoals crbn, dan alomtegenwoordig de POI, resulterend in de proteasomale afbraak. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bifunctionele homo-PROTAC voor de afbraak van de E3 ubiquitine ligase CRBN. In een op pomalidomide gebaseerde homo-PROTAC zijn twee ubiquitine ligase bindmiddelen aangesloten om cross-Ubiquitination van CRBN te induceren, wat resulteert in een chemisch geïnduceerde knockdown van CRBN. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: synthese van homodimer 8 en heterodimer 9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: 1H NMR (boven) en 13C NMR (onder) spectra. Spectra van compound 8 (a) en compound 9 (B) werden opgenomen in DMSO-d6 op een NMR-spectrometer. Chemische verschuivingen worden in delen per miljoen (ppm) gegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: effecten van verbindingen 8 en 9 op CRBN, IKZF1, en IKZF3. De homo-PROTAC compound 8 van Pomalidomide INDUCEERT crbn-afbraak met zwakke resterende effecten van Pomalidomide op IKZF1 en IKZF3. Samengestelde 9 die een methylgroep op een van de residuen van pomalidomide bevat, heeft daarentegen geen effect op de aangegeven concentraties (μM). MM1S cellen werden behandeld voor 24 h behandeling. Effecten op CRBN, IKZF1, IKZF3 en tubuline (ladings controle) werden geanalyseerd door Western Blot. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: de afbraak van crbn kan worden geblokkeerd door de proteasoomremmer MG132 of door MLN4942 die via de inhibitie van de neddylatie indirect de ligasen van ubiquitine blokkeert. De multipel myeloom cellijn MM1s werd voorbehandeld met 10 μM MG132, 10 μM MLN4924 voor 1 h vóór toevoeging van homo-PROTAC compound 8 bij 100 nm voor 3 uur gecombineerde behandeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Cellevens vatbaarheid test in MM1S multipel myeloomcellen. Effecten van compound 8 en negatieve binding controle samengestelde 9 op de levensvatbaarheid van de cel in de pomalidomide gevoelige MYELOOM cellijn MM1S na 24 h, 48 h en 96 h behandeling. De levensvatbaarheid van de cel werd gemeten na 4 dagen in triplicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Samengestelde 8 antagonseert het effect van pomalidomide in multipel myeloom cellijnen. Cellen werden voorbehandeld met 100 nM compound 8 voor 3 h. daarna werd 1 μM pomalidomide toegevoegd. De levensvatbaarheid van de cel werd gemeten na 4 dagen in triplicaten. p <0,001 volgens student t-toets (A). Western Blot-analyse voor CRBN, IKZF1, IKZF3 en tubuline (laad controle) na voor behandeling van MM1S cellen met 100 nM-verbinding 8 voor 3 uur, vóór toevoeging van 1 μM Pomalidomide (B). Herdrukt (aangepast) met toestemming van Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp van dergelijke homo-Protac's zoals hier beschreven voor CRBN is gebaseerd op de specifieke affiniteit van pomalidomide aan CRBN, die met succes is gebruikt in talrijke heterobifunctionele Protac's en resulteerde in de ontwikkeling van PROTAC 8 als een zeer selectieve CRBN-Degrader. De specificiteit van ons molecuul is al bevestigd door Proteomic analysen24. Voor genetisch gemedieerde knock-out, uitsluiting en validatie van bijwerkingen is uitdagend en tijdrovend. Bovendien is een chemisch geïnduceerde knockdown omkeerbaar, snel en direct toepasbaar op een breed spectrum van cellen en weefsel typen28.
De IMiDs thalidomide, lenalidomide en pomalidomide zijn een belangrijker geworden bij de behandeling van multipel myeloom, B-cell lymfoomen en myelodysplastisch syndroom. Imids bemiddelden hun activiteit door de specificiteit van de crbn-CRL4 E3 ligase te moduleren om de neo-substraten te degraderen IKZF1, IKZF3 of CK1α6,11,29. Bovendien is gebleken dat IMiDs de chaperonne-functie van CRBN op twee andere eiwitten, MCT-1 en BSG, die ook belangrijk zijn voor multipel myeloom groei30, afdoet. De afbraak van CRBN door de homo-bifunctionele PROTAC werd goed verdragen door de meeste multipel myeloom geteste cellijnen, wat impliceert dat CRBN inactivatie alleen niet voldoende is om het doden van multipel myeloomcellen te veroorzaken. In tegenstelling, voor behandeling met compound 8 ontraalde de effecten van IMIDS op IKZF1/3 afbraak en geredde multipel myeloomcellen van lenalidomide en pomalidomide. Dit is in lijn met genetische inactivatie van crbn en deleterieuze crbn mutaties gevonden in patiënten met lenalidomide-resistente multipel myeloom en benadrukt de essentiële rol van crbn in het mechanisme van imids31,32 . De homo-PROTAC 8 kan daarom een nuttig instrument zijn om een staat van imid resistentie na te bootsen. Andere effecten van IMiDs die nog niet volledig begrepen zijn, zoals remming van de angiogeniciteit of TNFα-afgifte, kunnen voortvloeien uit een remming van de CRBN-functie en onze homo-PROTAC zijn geschikte hulpmiddelen om de inactivatie van CRBN verder te onderzoeken. Bovendien kan de chemisch geïnduceerde knockdown van CRBN door compound 8 helpen om nieuwe endogene substraten van crbn te identificeren en de fysiologische functies van crbn te verhelmaken. Gezien het feit dat onze compound 8 had geen effecten op kanker cellijn proliferatie, crbn remming alleen heeft geen anti-tumor activiteit. CRBN-degraders kunnen echter klinisch toepasbaar zijn bij andere ziekten dan kanker. In dit verband, crbn inactivatie werd onlangs aangetoond dat het verlenen van resistentie aan sepsis en om te voorkomen dat high-fat-Diet-geïnduceerde obesitas in muizen 33,34,35.
Concluderend hebben we de eerste chemische remmer van CRBN gegenereerd en gevalideerd die als nuttig hulpmiddel kan dienen voor toekomstig biomedisch onderzoek naar CRBN-gerelateerde signalering en moleculair mechanisme van thalidomide en zijn analogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentieel financieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether programma KR-3886/2-1 en SFB-1074 tot J.K.; FOR2372 naar M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
