Summary
本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。
Abstract
免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイド、多発性骨髄腫の治療のためのすべてのFDA承認薬は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロスのユビキチン化および分解を誘導する(IKZF3)プロテアソメ分解のためのセレブロン(CRBN)E3ユビキチンリゲスを介して。IMiDsは最近、CRBN E3リゲスによるユビキチン化およびプロテアソーム分解のための他のタンパク質を標的とするキメラ(PROTAC)を標的とする二機能性プロテオリシスの生成に利用されている。ポマリドマイドベースのホモビ機能PROTACを設計・合成し、CRBNの自己指向ユビキチン化と分解を誘導する能力を解析した。ここで、CRBNは、E3ユビキチンライゲスとターゲットの両方を同時に機能する。ホモ-PROTAC化合物8は、IKZF1およびIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、高い効力を持つCRBNを分解します。化合物8によるCRBN不活性化は、細胞生存率および異なる多発性骨髄腫細胞株の増殖に影響を及ぼさなかった。このホモ-PROTACは、多発性骨髄腫細胞におけるIMiDsの効果を損なう。したがって、当社のホモディメリックポマリドミド系化合物は、CRBNの内因性基質と生理機能を同定し、IMIDsの分子機構を調るのに役立つ可能性があります。
Introduction
免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイドは、すべて多発性骨髄腫の治療のために承認され、E3ユビキチンリゲスセレブロン(CRBN)、カリン4A-RING E3ユビキチンリゲスの基板アダプターに結合する(CRL4CRBN)1,2,3.IMiDsの結合は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロス(IKZF3)に対するCRL4CRBNの親和性を高め、そのユビキチン化と劣化を引き起こし(図1)4、5、 6,7,8.IKZF1およびIKZF3は多発性骨髄腫細胞に不可欠であるため、それらの不活性化は増殖抑制をもたらす。SALL4は最近、サリドマイド9、10によって引き起こされた1950年代のテラトジェニシティといわゆるコンテルガン大惨事の原因となる可能性が高いCRBNの追加IMiD誘発ネオ基板として発見された。対照的に、カゼインキナーゼ1α(CK1α)は、染色体5q欠失11を有する骨髄異形成症候群における治療効果に関与するCRBNのレナリドミド特異的基質である。
分解のために特定のタンパク質を標的とする低分子の能力は、現代の薬剤開発にとってエキサイティングな意味を持っています。サリドマイドとその類似体のメカニズムは、ヒトで初めて使用された後に発見されたが、いわゆるPrオテオリシスTaはCヒデラス(PROTAC)と呼ばれ、目的のタンパク質(POI)を特異的に標的にするように設計されている(図)2)12,13,14,15,16,17,18.PROACは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)18、19、20、CRBNのようなE3ユビキチンリガーゼのリガンドにリンカーを介して接続されたPOIのための特定のリガンドからなるヘテロビ機能分子である。 21、22。PROTACは一過性三項複合体の形成を誘発し、POIをE3ユビキチンリゲスに導き、そのユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらす。従来の阻害剤に比べてPROTACの主な利点は、POIへの結合がその阻害よりも十分であり、したがって、PROTACは、薬物使用不能と考えられていたものを含む、はるかに広い範囲のタンパク質を標的にする可能性があることです。転写因子15.さらに、キメラ分子は触媒的に作用するため、高い効力を有する。POIへのユビキチン転移後、三項複合体は解離し、新しい複合体の形成に利用できる。したがって、非常に低いPROTAC濃度は、標的タンパク質23の分解のために十分である。
ここでは、それ自体の劣化のためにCRBNを募集するポマリドマイド-ポマリドマイド共役ホモ-PROTAC(化合物8)の合成について説明する24.E3ユビキチン・リガーゼCRBNは、リクルーターとターゲットの両方を同時に務めます(図3)。データを検証するために、負の結合制御(化合物9)も合成しました。 我々のデータは、新たに合成されたホモ-PROTACがCRBN分解に特異的であり、他のタンパク質に対する影響が最小限であることを確認します。
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Protocol
1. PROTAC分子の調製
注意:使用前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、有毒で発癌性です。適切な安全対策と個人用保護具をご利用ください。
- テルト-ブチルN-(2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物1)
- 1,1'-カルボニルジミダゾール(1.95g、12mmol)と触媒量4-(ジメチルミノ)ピリジン(5mg)をTHF(2.46g、10mmol)の混合物に加え、100mLのラウンドボトムフラスでフラスクを加えます。明確な溶液が形成されるまで攪拌しながら10時間還流で熱する。
- ロータリーエバポレータで減圧下の溶媒を取り出し、EtOAc(200mL)を加え、分離漏斗に移します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を洗浄し、Na2SO4の上に乾燥させます。
- シリカゲル(直径5cm、高さ5cm)の短いパッドを通して溶液を濾過し、EtOAcのさらなる容積(200 mL)で溶出します。
- 溶媒を蒸発させ、得られた無色固体を真空中で乾燥させる。
- テルト-ブチルN-(1-メチル-2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物2)
- 化合物1(2.28g、10mmol)と粉砕炭酸カリウム(2.76g、20mmol)とDMF(25 mL)を100mLの丸底フラスコに組み合わせます。 注射器を使用してヨードメタン(1.42g、0.62 mL、10 mmol)をドロップワイズに追加し、フラスコに穴あけゴム中隔を装備します。反応容器を超音波浴に2時間入れます。
- EtOAc(100 mL)で反応混合物を希釈し、分離漏斗に移します。有機層を1 N NaOH(2x 25 mL)、H2O(25 mL)、塩水(25 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させます。
- 溶媒を濾過し、蒸発させる。石油エーテル/EtOAc(2:1)を使用して、シリカゲル(6cmカラム直径と20cmの高さ)上のカラムクロマトグラフィーで製品を精製します。
- 2-(2,6-ジオキソピプリジン-3-yl)-4-フルオロイソインドリン-1,3-ジオン(化合物3)の調製
- 3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド1(1.14g、5mmol)、酢酸ナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で50mLの丸底フラスクに加え、バルフラスを含むフラスコを含みます。 混合物を120°Cで6時間加熱します。
- 冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。
- 4-フルオロ-2-(1-メチル-2,6-ジオキソピオリジン-3-yl)イソインドリン-1,3-ジオン(化合物4)
- 3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド2(1.21g、5mmol)、アセテートナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で100mLの丸底フラスクで凝縮します。 混合物を120°Cで6時間加熱します。
- 冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。
- テルブチルN-[2-[2-][2-[2-[2,6-ジオキソ-3-ピプリジル]-1,3-ジオキソ-イソインドリン-4-yl]アミノ[エトキシ]エトキシ[エトキシ]カルバメート化合物(7)
- 50mLの丸底フラスコをテルトで充電 -ブチルN -[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル[カルバメート(5,0.41g、 1.65 mmol)、化合物3(0.41g、1.50 mmol)、乾燥DMF(10 mL)およびDIPEA(0.39グラム、0.51 mL、3.0ミリル)。 攪拌棒と還流コンデンサーを装備します。アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。
- 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を塗り、フィルターを使用し、真空中に濃縮します。
- 石油エーテル/EtOAc(1:1~1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム径および高さ60cm)上のカラムクロマトグラフィーで粗質な製品を浄化します。
- ホモジマーの調製(化合物8)
- α、ω-ジアミンリンカー6(0.22g、0.22mL、1.50 mmol)、DIPEA(1.05mL、6.00mmol)、および50mLのラウンドボトムフラスクで3(0.83g、3.00 mmol)の溶液を50mLのラウンドボトムフラスクで組み合わせます。 アルゴン雰囲気下で18時間90°Cで熱する。
- 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を乾燥させ、フィルターを使用して真空中に濃縮します。
- EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。
- ヘテロダイマーの調製(化合物9)
- 乾燥CH2Cl2(10mL)に化合物7(0.83g、1.65mmol)を溶解する。 トリフルオロ酢酸(10mL)を加え、黄色の混合物を40°Cで2時間、閉じた50mLの丸底フラスコでかき混ぜます。
- 揮発性物質を除去し、CH2Cl 2(4x 5 mL)で凝ババポレートします。残渣を真空で10時間乾燥させます。
- 乾燥したDMF(20 mL)で材料をリディス溶解します。化合物4(0.44g、1.50 mmol)とDIPEA(0.78g、1.05 mL、6.00 mmol)を追加し、フラスコに還流凝縮器を装備します。 アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。
- 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。飽和NaHCO 3(50 mL)、H2 O(50 mL)、10%KHSO4(50 mL)、H2 O(50 mL)、塩水(50mL)で有機層を洗浄し、Na2 SO4上に乾燥させ、フィルターを真空中に濃縮します。
- EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。
- 核磁気共鳴(NMR)上のDMSO-d6における1H NMRおよび13C NMRスペクトルによる分子構造(図5A化合物8、5B化合物9)の解明と検証分光 器。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により、両方の化合物の純度が97%を超え、ダイオードアレイ検出(DAD)を220~500nmで適用することを確認してください。
2. PROTAC分子の機能的検証
- PROTACによるCRBN分解のウェスタンブロット分析
注:化合物の効果8およびコンパウンド9CRBNタンパク質レベルに関して、ウェスタンブロット分析により試験した。また、IKZF1 レベルおよび IKZF3 レベルへの影響も確認できます。図 6).-
サンプル調製
- 化合物8および9、レナリドミド(Len)、ポマリドミド(Pom)、MG132、およびMLN-4924を10mMの濃度で溶解し、アリコートをさらに使用するまで-80°Cで保存する。
- 2.5 mL媒体を用いて6ウェルプレートにシード1 x 106 MM1S細胞を入れ、100 nMまたは1 μM化合物8または9を24時間で処理します。
- 700 x g、5分、4°Cで治療と遠心分離機の後に細胞を収穫します。冷たい1x PBSでセルペレットを洗浄し、残りの培温を700xg、5分、4°Cで除去し、上清を廃棄します。 この手順を 1 回繰り返します。
- ライシスバッファー中のライゼ細胞(25 mMトリスHCl pH 7.4、150 mM NaCl、1%NP-40、1mM EDTA、5%グリセロール、1xプロテアーゼ&ホスファターゼ阻害剤カクテル)の氷上で10分間、遠心分離機を320 x gで10分間、10分間°C。上清を収穫し、メーカーのプロトコルに従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCAアッセイ)によってタンパク質濃度を決定する。
- 1x LDS負荷バッファー(5%2-メルカプトエタノール)を伴う変性タンパク質(15~30μg/サンプル)と沸騰10分、75°C。
-
SDS-ページ
- 10%分離ゲル[4 mL 3xゲルバッファー(3 Mトリス/HCl、 0.3% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS), pH 8.45), 4 mL アクリルアミド 30%, 2.52 mL グリセロール 50%, 1.395 mL H2O, 75 μL 11% ペルスルフェートアンモニウム (APS), および 9.75 μL TEMED と 9.75 μL TEMED とゲルを積み重ねます。 [1.992 mL 3xゲルバッファー、0.792 mL 30%アクリルアミド、3.168 mL H2O、36 μL 11%APS、および6 μL TEMED]を電極組立ユニットに入します。櫛を取り外し、カソードバッファー(100 mMトリス/HCl、100 mMトリシン、0.1%(w/v)SDS)、およびロードサンプルでウェルをフラッシュします。
- アノードバッファ(100 mMトリス/HCl、pH 8.9)をタンクに充填します。ステップ2.1.1.4からタンパク質サンプルをロードし、SDS-PAGEを70V、20分、続いて一定電圧で115V、150分で実行します。
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CRBN、IKZF1およびIKZF3の免疫ブロッティングと検出
- PVDF膜(0.45 μm)を100%メタノールで1分間平衡化し、ゲルを1x転写バッファーで分離[10x転写バッファー(192mMグリシン、25mMトリスベース/HCl、900mL H2O)、20%メタノール、0.1%SDS、p.8.p.H.SDSを活性化する。
- メーカーのプロトコルに従ってブロッティングカセットを組み立てます。ゲルを180mAで90分間転写します。
- 1x TBS-T(25 mMトリス/HCl、150 mM NaCl、pH 7.6、0.1%ツイエン20)で膜3xを室温でそれぞれ5〜10分間洗浄します。5%非脂肪乾燥乳(NFDM)で膜をブロックし、室温で1時間TBS-T。1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。
- CRBN(5%BSA、TBS-Tで1:500)の一次抗体を用いて膜をインキュベートし、一晩4°Cで穏やかに振ります。
- 1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。抗マウス(5%NFDMで1:10.000、TBS-T)または抗ウサギ(5%NFDMで1:5.000、TBS-T)をワサビペルオキシダーゼHRPに結合した二次抗体(室温で1時間)で膜をインキュベートする。
- 1X TBS-Tで膜2xを室温で5~10分間洗浄します。1x TBS でこの手順を 2 回繰り返します。
- メーカーのプロトコルに従ってHRP基板溶液で2分間膜をインキュベートし、化学発光検出装置で化学発光を検出します。
- 1X TBSで1xで1xを洗浄し、室温でそれぞれ5~10分間洗浄します。抗体の放出については、市販のストリッピングバッファー内のストリップ膜を15分間洗浄し、1X TBSで膜を3倍、室温でそれぞれ5~10分間洗浄する。
- 5%の非脂肪乾燥牛乳で膜を再ブロックし、室温で1時間TBS-T。1x TBS-Tで1xで膜を5~10分間室温で洗浄し、ステップ2.1.3.4に従ってIKZF1、IKZF3またはチューブリンで再プローブします。
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サンプル調製
- MG132、MLN4942またはポマリドミドとの競争実験
注:CRBNがユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されるかどうかを確認するために、プロテアソーム阻害剤MG132とネディリレーション活性化酵素(NAE)阻害剤MLN4942(図7)との競合実験を行った。- 種子1 x 106 MM1S細胞を6ウェルプレートでウェルあたり。10 μM MG132、10 μM MLN4942、またはレナリドミド(100x)を持つプレトリート細胞は、37°Cで1hをインキュベートし、5%CO2.
- 37 °C で 3 h の 100 nM化合物8を追加します。
- ステップ2.1.1に従ってウェスタンブロットの細胞を収穫する。
- 多発性骨髄腫細胞株における細胞生存率アッセイ
注:このアッセイは、細胞生存率への影響を試験するために使用され、さらに、化合物8を有する細胞の前処理によって多発性骨髄腫細胞に対するIMiDsの効果に拮抗する(図8、図9A、B)。- 生物学的三重分化における96ウェルプレート中のウェル当たり種子5 x 104 MM1S細胞は、生存率アッセイ用である。ウェスタンブロット分析の場合、生物学的三重分化における6ウェルプレートでウェル当たりシード1 x 106 MM1S細胞を種子化する。
- DMSOまたは100 nM、1 μM、または10 μM化合物8、化合物9またはポマリドミドで細胞を処理し、37°C、5%CO2で24時間、48時間、または96hのインキュベートを行います。 救助実験のために、1μMポマリドミドを添加する前または後に、100 nM化合物8を3時間で処理し、96時間インキュベートする。
- ウェスタンブロット分析用の6ウェルプレートからプレートリーダーまたは収穫細胞のメーカーのプロトコルに従って、発光細胞生存率アッセイで96ウェルプレート発光を測定します。
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Representative Results
ここでは、CRBNの分解に対するホモディメリックポマリドミドベースのPROTACの設計、合成及び生物学的評価について説明した。当社のPROTACは、2つのCRBN分子と同時に相互作用し、ポマリドミド誘発ネオ基板IKZF1またはIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、CRBNの自己ユビキチン化およびプロテアソーム分解を誘導する三項複合体を形成します。
以前に公表された一連のポマリドミド系PROTAC分子24のうち、化合物8はCRBNの化学的誘導分解において特に有効であった。その合成は以下のように行うことができる(図4)。1,1'-カルボニルジミダゾール促進されたBoc保護l-グルタミンの凝縮は、環化イミド1につながる。N-メチル化アナログ2は、ヨウ化メチルを含むアルキル化を介してアクセス可能である。 両方のビルディングブロック(1および2)は、酸性条件下でのN-脱保護後、3を用いたリング開閉/リサイクル反応の過程でフタリミド誘導体(3および4)に変換される。 フルオロフタリック無水物。サリドマイド類似体は、一般に加水分解の影響を受けやすく、十分な乾燥後の次のステップでのみ使用すべきである。化合物3は、原発性脂肪性アミン25を用いた芳香族核性置換の影響を受けやすい。この変換は、乾燥溶媒を使用した場合にのみ効率的に進行することが判明した。真のホモディメリック製品の設計は、2つの同一の機能サブ構造のリンカー接続と対称リンカーの適用を意味します。PROTAC 8の一部であるリンカーは、N -to-N、ポリエチレンベースの線形鎖を表します。 対応するα、ω-diamine 6は、90°CでDMSOで1:2のモル配分でビルディングブロック3と反応した場合に所望の最終化合物8につながる。 他の分析データ24のうち、8の構造をNMRスペクトル(図5A)により検証した。化合物9は、適切な負の対照として設計され、活性ホモ-PROTAC 8と比較して、最小限の、しかし重要な構造偏差しか有さない。グルタリミド部内のN-メチル化はCRBN結合26,27を廃止することを知られている。負対照化合物9の1つのポマリドミド部分は、N-メチル残基を担う。 N-単保護リンカービルディングブロック5を持つ3の第1の核性置換により調製することができ、続いてBoc保護群の切断および中間4へのその後の結合が続く。 その非対称構造のために、対応する炭素の一部は、明確な13C NMR信号を示した(図5B)。
ホモ-PROTAC8は非常に強力であることが観察され、CRBNのほぼ完全なプロテアソーム分解を引き起こしました。 多発性骨髄腫細胞におけるCRBN、IKZF1およびIKZF3タンパク質レベルの解釈は、ウェスタンブロット分析(図6、図7、図9B)により確認された。.式を簡単に検出できます。このホワイトペーパーで使用する抗体は品質が良く、この方法は当社のラボで最適化された標準的な手順です。
また、化合物8によるCRBNの分解は、SgRNA24によるCRBNのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトに沿ったIMiDs(図8、図9A)に対する細胞生存率および与えられた耐性に影響を及ぼさなかった。細胞生存率アッセイにおける発光シグナルはATP放出に基づいており、これは死細胞数として解釈できる。この方法は、サンプル数が多い短時間で簡単に行うことができます。生存/死細胞の測定のための別の方法は、フローサイトメトリーによるアネキシンV/7-AAD染色です。
図1:E3ユビキチンリゲスCRBNがIMIDsの主な標的である。免疫調節薬はCRBNに結合し、プロテアソーム分解のためにいくつかのネオ基板を募集する。IMiD誘発性リンパ転写因子IKZF1およびIKZF3のIMiD誘発分解は、多発性骨髄腫細胞および免疫調節特性の一部に及ぼす影響を担う。カゼインキナーゼ1αは、レナリドミドによって選択的に分解されるが、他のIMiDsではなく、染色体5qの損失を伴う骨髄異形成症候群におけるレナリドミドの活性に寄与する。SALL4は最近、サリドマイドとその類似体によって引き起こされる寺形原性に関連している可能性が高いすべてのIMIDの共通の標的として発見された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:PROTAcは目的のタンパク質(POI)を分解します。PROACはヘテロビ機能分子であり、リンカーはユビキチンリガードをPOIリガンドに接続する。三次複合体の形成によって、CRBNなどのユビキチンリゲスは、次いでPOIをユビキチン化し、そのプロテアソーム分解をもたらす。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:E3ユビキチンリゲスCRBNの分解に対する二機能ホモ-PROTAC。ポマリドミドベースのホモ-PROTACでは、2つのユビキチンリゲス結合剤がCRBNのクロスユビキチン化を誘導し、その結果CRBNの化学的に誘発されたノックダウンを引き起こす。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ホモダイマー8及びヘテロダイマー9の合成。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:1H NMR(上)及び13C NMR(下)スペクトル。 化合物8(A)及び化合物9(B)のスペクトルをNMR分光計上のDMSO-d6に記録した。 化学シフトは、100万分の1(ppm)の部分で与えられます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: CRBN、IKZF1、および IKZF3 に対する化合物 8 および 9 の影響。ポマリドミド系ホモ-PROTAC化合物8は、IKZF1およびIKZF3に対するポマリドマイドの弱い残留効果を伴うCRBN分解を誘導する。これに対し、ポマリドマイド残基の1つにメチル基を含む化合物9は、示された濃度(μM)では効果がない。MM1S細胞を24時間処理した。CRBN、IKZF1、IKZF3およびチューブリン(ローディング制御)に対する影響をウェスタンブロットで分析した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:CRBN分解は、プロテアソーム阻害剤MG132またはネディル化阻害を介して間接的にユビキチンリチウムを遮断するMLN4942によって遮断されうる。多発性骨髄腫細胞株MM1sを10μM MG132、10μM MLN4924を1時間前に前処理し、100nMでホモPROTAC化合物8を3時間の併用処理に添加した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8:MM1S多発性骨髄腫細胞における細胞生存率アッセイ化合物8および陰性結合制御化合物9が24時間、48hおよび96h処理後のポマリドマイド感受性骨髄腫細胞株MM1Sにおける細胞生存率に及ぼす影響。細胞生存率は、三回に4日後に測定した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9:化合物8は、多発性骨髄腫細胞株におけるポマリドミドの効果に拮抗する。細胞を100nM化合物8を3時間前に前処理し、その後1μMポマリドミドを添加した。細胞生存率は、三回に4日後に測定した。p <0.001 学生のt検定(A)によると。CRBN、IKZF1、IKZF3およびチューブリン(ロード制御)に対するウェスタンブロット分析は、1μMポマリドミド(B)を添加する前に、100nM化合物8を3時間用にMM1S細胞の前処理後に行った。 Steinebach, C. et al. 201824.著作権2019アメリカ化学会。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CRBNのためにここに説明するこのようなホモPROTACの設計は、多くのヘテロビ機能PROTACでうまく利用され、PROTAC 8の高度な開発をもたらしたCRBNに対するポマリドミドの特定の親和性に依存しています。選択的 CRBN デグレーダー。我々の分子の特異性は、プロテオミクス分析24によって既に確認されている。遺伝的に媒介されたノックアウトのために、 副作用の排除と検証は困難で時間がかかります。さらに、化学的に誘導されたノックダウンは可逆的で、迅速かつ直接細胞および組織タイプ28の広いスペクトルに適用可能である。
IMiDsサリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイドは、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫および骨髄異形成症候群の治療において主力となっている。IMiDsは、CRBN-CRL4 E3リゲスの特異性を調節して、ネオ基板IKZF1、IKZF3、またはCK1α6、11、29を分解することによって活動を仲介する。さらに、IMIDsは、多発性骨髄腫増殖にも重要である2つの他のタンパク質、MCT-1およびBSG上のCRBNのシャペロン機能を損なうことが示されている。ホモ二機能PROTACによるCRBNの分解は、試験されたほとんどの多発性骨髄腫細胞株によって十分に許容され、CRBN不活性化だけでは多発性骨髄腫細胞の死化を引き起こすには不十分であることを示唆した。対照的に、化合物8による前処理は、IKZF1/3分解に対するIMiDsの効果を損ない、レナリドミドおよびポマリドミドから多発性骨髄腫細胞を救い出した。これは、レナリドミド耐性多発性骨髄腫患者に見られるCRBNおよび有害なCRBN変異の遺伝的不活性化と一致しており、IMiDs31,32のメカニズムにおけるCRBNの本質的な役割を強調している。.したがって、ホモPROTAC 8は、IMiD抵抗の状態を模倣するのに有用なツールであることができます。血管新生性またはTNFα放出の阻害のようにまだ完全に理解されていないIMIDsの他の効果は、CRBN機能の阻害に由来する可能性があり、当社のホモPROTACはCRBNの不活性化をさらに調査するのに適したツールである。さらに、化合物8によるCRBNの化学的誘導ノックダウンは、CRBNの新しい内因性基板を同定し、CRBNの生理機能を解明するのに役立つ可能性がある。当社の化合物8が癌細胞株増殖に影響を及ぼさなかったことを考えると、CRBN阻害だけでは抗腫瘍活性は有しない。しかし、CRBN脱薬者は、癌以外の疾患において臨床的に適用可能である可能性がある。この点に関して、CRBN不活性化は最近、敗血症に対する耐性を付与し、マウス33、34、35における高脂肪食誘発肥満を予防することが示された。
結論として、我々は、サリドマイドとその類似体のCRBN関連シグナル伝達および分子機構に関する将来の生物医学的研究に有用なツールとして役立つCRBNの最初の化学阻害剤を生成し、検証した。
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Disclosures
著者は、潜在的な金銭的利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(エミーノエーテルプログラムKr-3886/2-1とSFB-1074からJ.K.まで)によってサポートされました。FOR2372 から M.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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