Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59472
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 2, 1
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.

Abstract

İmmünomodülatör ilaçlar (imids) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için tüm FDA onaylı ilaçlar, ikaros (IKZF1) ve Aiolos lenfoid transkripsiyon faktörlerinin mayası ve bozulma neden (IKZF3) proteasomal bozulma için cereblon (CRBN) E3 Ubiquitin ligaz üzerinden. İmids yakın zamanda Chimeras (protacs) hedefleyen bifonksiyonel proteoliz nesil için kullanılan edilmiştir crbn E3 ligaz tarafından mayası ve proteasomal bozulması için diğer proteinlerin hedef. Biz tasarlanan ve sentezlenmiş pomalidomür tabanlı homobifunctional protacs ve kendi kendini yönettiği mayası ve crbn bozulması teşvik yeteneğini analiz. Burada, CRBN hem E3 Ubiquitin ligaz hem de hedef aynı anda hizmet vermektedir. Homo-PROTAC bileşik 8 IKZF1 ve IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile yüksek bir potens ile crbn düşer. Bileşik 8 tarafından crbn inaktivasyonu hücre canlılığı ve farklı Multipl myelom hücre hatları proliferasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Bu homo-Protac multipl miyelom hücrelerinde imids etkilerini CPAP. Bu nedenle, bizim homodimeric pomalidomür bazlı bileşikler CRBN 's endojen substratlar ve fizyolojik fonksiyonları belirlemek ve IMiDs moleküler mekanizmasını araştırmak için yardımcı olabilir.

Introduction

İmmünomodülatör ilaçlar (IMiDs) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için onaylanmış, E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN) bind, cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligaz için bir substrat adaptörü (CRL4crbn)1,2,3. İmids bağlayıcı CRL4crbn lenfoid transkripsiyon faktörleri ikaros (IKZF1) ve Aiolos (IKZF3), kendi mayası ve bozulma yol açan benzeşimi geliştirir (Şekil 1)4,5, 6 , 7 , 8. bu yana IKZF1 ve IKZF3 multipl miyelom hücreleri için gerekli olan, büyüme inhibisyonu onların inaktivasyon sonuçları. SALL4 son zamanlarda, thalidomür9,10neden 1950 ' lerde teratogenisite ve sözde Contergan felaketinden sorumlu büyük olasılıkla crbn ek bir İmid kaynaklı Neo-substrat olarak bulundu. Buna karşılık, kasein kinaz 1α (CK1α), kromozom 5q silme11ile myelodisplastik sendromunda terapötik etkiye BULAŞMıŞ crbn lenalidomür spesifik bir substrat.

Küçük moleküllerin bozulma için spesifik bir protein hedeflemesini yeteneği modern ilaç gelişimi için heyecan verici bir ima. Thalidomür ve onun analogları mekanizması insanlarda ilk kullanımından sonra keşfedilen iken, bu nedenle PRoteolysis targeting Chimeras (protacs) olarak adlandırılan özellikle bir faiz (POI) bir protein hedef için tasarlanmıştır (Şekil 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs, crbn veya von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20gibi bir E3 Ubiquitin ligaz bir ligand için bir bağlayıcı ile bağlı POI için belirli bir ligand oluşur heterobifetertional moleküller 21,22. Protacs bir geçici Üçlü Kompleks oluşumunu teşvik, E3 Ubiquitin ligaz için POI yönlendirmek, onun mayası ve proteasomal bozulması sonuçlanan. PROTACs konvansiyonel inhibitörler üzerinde önemli avantajları bir POı için bağlayıcı yerine onun inhibisyonu daha yeterli olduğunu ve bu nedenle PROTACs potansiyel olarak kabul edildi gibi proteinlerin çok daha geniş bir spektrum hedef olabilir böyle undruggable olarak transkripsiyon faktörleri15. Buna ek olarak, chimerik molekülleri katalytically hareket ve bu nedenle yüksek bir potens var. İÇN 'ye Ubiquitin transferinden sonra, Üçlü Kompleks ayrışıp ve yeni kompleksleri oluşumu için kullanılabilir. Böylece, çok düşük PROTAC konsantrasyonları hedef protein23bozulması için yeterlidir.

Burada bir pomalidomür-pomalidomür konjuge homo-Protac sentezini açıklamak (bileşik 8) kendini bozulması için crbn acemi24. E3 Ubiquitin ligaz CRBN aynı zamanda hem işveren hem de hedef olarak hizmet vermektedir (Şekil 3). Verilerimizi doğrulamak için, aynı zamanda negatif bağlama kontrolü sentezlenmiş (bileşik 9). Verilerimiz yeni sentezlenmiş homo PROTAC 'ın CRBN bozulması için spesifik olduğunu ve diğer proteinlerde sadece minimal etkilere sahip olduğunu teyit ediyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PROTAC moleküllerinin hazırlanması

DIKKAT: kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın. Bu sentezler kullanılan kimyasalların birkaç toksik ve kanserojen vardır. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanın.

  1. Tert-butil N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (bileşik 1) hazırlanması
    1. 1, 1 '-carbonyldiimidazol Ekle (1,95 g, 12 mmol) ve bir katalitik miktarı 4-(dimethylamino) pyridine (5 mg) bir karışımı için Boc-gln-OH (2,46 g, 10 mmol) THF (50 mL) içinde 100 mL yuvarlak alt Flask bir karıştırın bar ve bir reflü kondansatör ile donatılmıştır. Net bir çözüm oluşuncaya kadar karıştırırken 10 h için reflü ısı.
    2. Döner buharlaştırıcı ile azaltılmış basınç altında solvent çıkarın, EtOAc ekleyin (200 mL) ve ayırma hunisine aktarın. Organik katmanı H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın ve na2so4üzerine kurutun.
    3. Solüsyonu Silis jeli (5 cm çap ve 5 cm yükseklikte) kısa bir yastık ile filtreleyin ve EtOAc 'ın başka bir hacmi (200 mL) ile atlatın.
    4. Solvent Buharlık ve vakum içinde elde edilmiş renksiz katı kurutun.
  2. Tert-butil N-(1-metil-2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (bileşik 2) hazırlanması
    1. Bileşik 1 (2,28 g, 10 mmol) ile kombine edilen potasyum karbonat (2,76 g, 20 mmol) ve Dmf (25 ml) bir 100 ml Yuvarlak alt Flask ile birleştirin. Bir şırınga kullanarak iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) Drop-Wise ekleyin ve bir delinmiş kauçuk septum ile Flask donatmak. 2 h için bir ultrasonication banyo içine reaksiyon gemisi yerleştirin.
    2. EtOAc ile reaksiyon karışımı seyreltir (100 mL) ve ayırma hunisine aktarın. Organik katmanı 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) ve salamura (25 ml) ile yıkayın ve na2so4üzerine kurutun.
    3. Çözücüyü filtreleyin ve Buharlık yapın. Petrol eter/EtOAc (2:1) kullanılarak silika jel (6 cm sütun çapı ve 20 cm yükseklikte) üzerinde sütun Kromatografi ile ürün arındırın.
  3. 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-il) 6-fluoroisoindolin-1, 3-Dione (bileşik 3) hazırlanması
    1. 3-fluorofilik anhidrit (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) ve buzul asetik asitte (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir 6,0 ml Yuvarlak alt Flask içinde sodyum asetat (0,50 g, 50 mmol) çözeltisi birleştirin ve bir reflü kondansatör ile donatılmıştır. 6 h için 120 °C ' de karışımı ısıtın.
    2. Soğutma sonra, H2o (100 ml) üzerine mor karışımı dökün ve 10 dakika boyunca karıştırın. filtrasyon ile oluşturulan katı toplamak, h2O (3 × 5 ml) ve petrol eter (3 × 5 ml) ile yıkayın ve vacuo kuru.
  4. 4-Fluoro-2-(1-metil-2, 6-dioxopiperidin-3-il) isoindoline-1, 3-Dione (bileşik 4) hazırlanması
    1. 3-fluorofilik anhidrit (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) ve buzul asetik asit (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir reflü kondenser ile donatılmış bir 6,0 ml Yuvarlak alt Flask içinde sodyum asetat (0,50 g, 100 mmol) bir çözelti birleştirin. 6 h için 120 °C ' de karışımı ısıtın.
    2. Soğutma sonra, H2o (100 ml) üzerine mor karışımı dökün ve 10 dakika boyunca karıştırın. filtrasyon ile oluşturulan katı toplamak, h2O (3 × 5 ml) ve petrol eter (3 × 5 ml) ile yıkayın ve vacuo kuru.
  5. Tert-butil Nhazırlanması-[2-[2-[2-[[2-(2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-il] amino] etoxy] etoxy] etil] carbamate (bileşik 7)
    1. 50 mL yuvarlak alt Flask ile tert-butil N-[2-[2-(2-aminoetoksi) etoxy] etil] karbamat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), bileşik 3 (0,41 g, 1,50 mmol), Kuru Dmf (10 ml) ve dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Bir karıştırın bar ve bir reflü kondansatör ile donatın. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 10 h.
    2. Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na2so4üzerinde kuru, filtre, ve vacuo konsantre.
    3. Petrol eter/EtOAc (1:1-1:2) gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 60 cm yükseklikte) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.
  6. Homodimer hazırlanması (bileşik 8)
    1. Α, ω-diamin bağlayıcı 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1,05 ml, 6,00 mmol) ve kuru DMSO 'da 3 (0,83 g, 3,00 mmol) çözeltisi (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir 50 ml Yuvarlak alt Flask ve bir reflü kondansatör ile donatılmış birleştirin. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 18 saat.
    2. Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na2so4üzerinde kuru, filtre ve pentalaktilmolochnye konsantre.
    3. Petrol eter/EtOAc (1:2) için EtOAc gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 50 cm yüksekliği) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.
  7. Heterodimerdir hazırlanması (bileşik 9)
    1. Kuru CH2CL2 (10 ml) içinde bileşik 7 (0,83 g, 1,65 mmol) çözülür. Trifluoasetik asit (10 mL) ekleyin ve sarı karışımı 40 °C ' de 2 h için kapalı bir 50 mL yuvarlak alt Flask ile karıştırın.
    2. CH2CL2 (4X 5 ml) ile volatiller ve koevaporate çıkarın. 10 h için pentalaktilmolochnye kalıntı kuru.
    3. Malzemesi kuru DMF (20 mL) olarak yeniden çözünür. Bileşik 4 (0,44 g, 1,50 mmol) ve dıpea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) ekleyin ve Flask 'ı bir reflü kondansatörle donatın. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 10 h.
    4. Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları doymuş NaHCO3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2o (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na üzerinde kuru2so4, Filter ve vacuo konsantre.
    5. Petrol eter/EtOAc (1:2) için EtOAc gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 50 cm yüksekliği) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.
    6. Molekül yapısını (Şekil 5A bileşik 8, 5B bileşik 9) 1H NMR ve 13C NMR Spectra DMSO-d6 ' da nükleer manyetik rezonansa (NMR) göre doğrulayın Spektrometre. Her iki bileşiğin saflığının sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) yoluyla% 97 ' den yüksek olduğunu kontrol edin, 220 – 500 Nm 'de bir diyot dizi algılaması (DAD) uygulanır.

2. PROTAC moleküllerinin fonksiyonel doğrulama

  1. Protacs tarafından crbn bozulması Batı leke Analizi
    Not: bileşik efektleri8ve bileşik9crbn protein düzeyinde Batı leke analizi ile test edildi. Buna ek olarak, IKZF1 ve IKZF3 seviyeleri üzerinde etkisi de teyit edilebilir (Şekil 6).
    1. Numune hazırlama
      1. 10 mM konsantrasyonda DMSO 'da 8 ve 9, Lenalidomür (len), Pomalidomür (POM), MG132 ve mln-4924 bileşikleri çözülür ve daha fazla kullanım kadar-80 °c ' de depolar.
      2. Tohum 1 x 106 MM1S hücreleri ile 6-kuyu plaka 2,5 ml medya ve tedavi hücreleri Ile 100 Nm veya 1 μM bileşik 8 veya 9 için 24 h.
      3. Tedavi sonra hasat hücreleri ve Santrifüjü 700 x g, 5 dk, 4 °c. Kalan medyayı çıkarmak için soğuk 1x PBS ile yıkama hücresi Pelet, 700 x g, 5 dk, 4 °c santrifüjle ve supernatant atın. Bu adımı bir kez yineleyin.
      4. Lizis tampon içinde Lyse hücreleri (25 mm Tris HCl pH 7,4, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm EDTA, 5% gliserol, 1x proteaz & fosfataz inhibitörü kokteyli) buz üzerinde 10 dakika için, santrifüjlü 10 dk, 4 °c için 320 x g . Hasat süpernatant ve bir bisinkoninik asit protein tahlil (BCA tahlil) tarafından üreticinin protokole göre protein konsantrasyonu belirlemek.
      5. 1x LDS yükleme tampon (5% 2-mercaptoethanol) ve kaynatma 10 dk, 75 °C ile (15 – 30 μg/örnek) denature proteinleri.
    2. SDS-SAYFA
      1. % 10 ayıran jel ile jel sandviç Fix [4 mL 3x jel tampon (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) sodyum dodecil sülfat (SDS), pH 8,45), 4 mL akrilamid 30%, 2,52 mL gliserol% 50, 1,395 mL H2O, 75 μL 11% amonyum Persülfat (APS), ve 9,75 ΜL temed] ve% 4 istifleme jeli [1,992 mL 3x jel tampon, 0,792 mL% 30 akrilamid, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS ve 6 ΜL temed] bir elektrot montaj ünitesinde. Taraklar, katot tampon ile floş kuyuları çıkarın (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS), ve yük örnekleri.
      2. Dolgu anot tampon (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) tank içine. Adım 2.1.1.4 yükleme protein örneği ve SDS-PAGE 70 V, 20 dakika, ardından 115 V, 150 dk sabit voltajda çalıştırın.
    3. CRBN, IKZF1 ve IKZF3 immunoblotting ve algılama
      1. PVDF membranı (0,45 μm) 1 dakika boyunca% 100 metanol içinde aktive et, 1x transfer tamponunda Equilibrate membran ve ayırma jeli [10X transfer tampon (192 mM gcine, 25 mM Tris-Base/HCl, 900 mL H2O),% 20 metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Üreticinin protokolüne göre kasma kaseti birleştirin. 90 dk için 180 mA at transfer jeli.
      3. Yıkama membran 3x 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% ara 20) için 5 – 10 dakika her oda sıcaklığında. Blok membran 5% yağ olmayan kurutulmuş süt (NFDM), TBS-T için 1 saat oda sıcaklığında. Her biri oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS-T membran 3x yıkayın.
      4. CRBN için primer antikor ile membran (1:500,% 5 BSA, TBS-T), 4 °C ' de nazik sallayarak, bir gecede.
      5. Her biri oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS-T membran 3x yıkayın. Titreşim önleyici membran (1:10.000% 5 NFDM, TBS-T) veya tavşan karşıtı (1:5.000% 5 NFDM, TBS-T) Sekonder antikor (Oda sıcaklığında 1 saat).
      6. Oda sıcaklığında her biri 5 – 10 dk için 1X TBS-T içinde 2x yıkama membranı. 1x TBS ile bu adımı iki kez yineleyin.
      7. Üreticinin protokollerine göre HRP substrat solüsyonu ile 2 dakika boyunca membranı inkük ve bir kemiluminesans algılama cihazında kemiluminesans tespit etme.
      8. Her oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS 'de 1 adet yıkama membranı. Antikorların salınımı için, ticari olarak kullanılabilir sıyırma tamponunda şerit membran 15 dak. 1/3 ' te 1X TBS 'de her oda sıcaklığında 5 – 10 dakika yıkayın.
      9. Membran% 5 yağlı kurutulmuş sütte reblock, oda sıcaklığında 1 saat için TBS-T. Oda sıcaklığında her biri 5 – 10 dk, IKZF1, IKZF3 veya tübülin ile adım 2.1.3.4 göre yeniden prob için 1x TBS-T membran 3x yıkayın.
  2. MG132, MLN4942 veya pomalidomür ile rekabet denemeleri
    Not: crbn 'nin Ubiquitin-proteozom yolu üzerinden bozulup düşmediğini onaylamak için, proteasom inhibitörü MG132 ve bir neddylation aktivasyonu enzim (Nae) inhibitörü MLN4942 (Şekil 7) ile rekabet denemeleri gerçekleştirdik.
    1. Tohum 1 x 106 MM1S hücreler başına iyi bir 6-iyi plaka. 10 μM MG132 μM MLN4942 veya lenalidomür (100x) ile ön tedavi ve 37 °C, 5% CO2' de 1 saat inkübe edin.
    2. Ekle 100 nM bileşik 8 için 3 h 37 °c, 5% Co2.
    3. 2.1.1 adıma göre Batı leke için hasat hücreleri.
  3. Multipl myelom hücre hatlarında hücre canlılığı
    Not: Bu tahlil hücre canlılığı üzerindeki etkisini test etmek için kullanılır ve ek olarak, bileşik 8 ile hücrelerin ön tarafından Multipl myelom hücrelerde imids etkisini kışkırtma (Şekil 8, Şekil 9a, B).
    1. Tohum 5 x 104 MM1S hücreler başına iyi bir 96-Well plaka için biyolojik Çoğalt canlılığı tahlil. Batı leke analizi için, tohum 1 x 106 MM1S hücreler başına iyi bir 6-biyolojik triplicates iyi plaka.
    2. Hücreleri DMSO veya 100 nM, 1 μM veya 10 μM bileşik 8, bileşik 9 veya pomalidomür ile tedavi edin ve 24 saat, 48 h veya 96 h için 37 °C, 5% Co2' de inkük edin. Kurtarma deneyleri için, 1 μM pomalidomür ve 96 h için inkük eklenmeden önce veya sonra 3 h için 100 nM bileşik 8 ile hücreleri tedavi edin.
    3. Ölçü 96-kuyu plaka Luminesans bir ışıldayan hücre canlılığı tahlil ile, bir plaka okuyucu veya hasat hücreleri üzerinde üreticinin protokole göre 6-kuyu plaka Batı leke analizi için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada CRBN bozulması için bir homodimerik pomalidomür tabanlı PROTAC tasarım, sentez ve biyolojik değerlendirme açıklanmıştır. Bizim PROTAC iki CRBN molekülleri ile aynı anda etkileşime girer ve pomalidomür kaynaklı Neo-substrat IKZF1 veya IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile CRBN kendi kendine ubiquitination ve proteasomal bozulması indükler Üçlü kompleksleri formları.

Daha önce yayınlanan bir dizi pomalidomür tabanlı PROTAC molekülleri24, bileşik 8 crbn kimyasal kaynaklı bozulması özellikle verimlidir. Sentezini aşağıdaki gibi yapılabilir (Şekil 4). Bir 1, 1 '-karbonildiimidazol-Boc korumalı l-glutamin yoğunlaşması cyclized İmid yol açar 1. N-metilated analog 2 , metil iyolik ile alkilasyon yoluyla erişilebilir. Her iki yapı taşları (1 ve 2), asidik koşullarda N-deprotection sonrası, 3-bir halka açma/reyclization reaksiyonu sırasında phthalimide türevleri (3 ve 4), dönüştürülür fluorofilik anhidrit. Thalidomür analogları, genel olarak, hidrolitik ayrışma duyarlı ve sadece yeterli kuruma sonra bir sonraki adımda kullanılmalıdır. Bileşik 3 , primer alifatik aminlerle aromatik bir çekirdekteki ikame hassasiktir25; Bu dönüşüm sadece kuru çözücüler kullanıldığında verimli bir şekilde devam etmek için bulunmuştur. Gerçek homodimerik ürün tasarımı iki özdeş işlevsel alt yapıları ve simetrik bağlayıcı uygulama bağlayıcı bağlantısı anlamına gelir. PROTAC 8 parçası olan bağlayıcı bir n-to-n, polietilen tabanlı doğrusal zincir temsil eder. Karşılık gelen α, ω-diamin 6 , 90 °c ' de dmso 'da 1:2 molar rasyon içinde 3 yapı bloğu ile reaksiyon gösterdiğinde istenen final bileşiği 8 ' e yol açar. Diğer analitik veriler arasında24, 8 yapısı NMR Spectra tarafından doğrulandı (Şekil 5A). Uygun bir negatif kontrol olarak tasarlanan bileşik 9, aktif homo-Protac 8' e kıyasla sadece minimal, ancak kritik yapısal sapmaları vardır. Glutarimid kısmı içinde N-metilasyon crbn bağlayıcı kaldırılıyor bilinmektedir26,27. Negatif kontrol bileşiğin bir pomalidomür bölümü 9 ayılar bir N-metil kalıntı. İlk nükleodik ikame ile hazırlanabilir 3 N-monoprotected bağlayıcı yapı bloğu 5, Boc koruma grubu ve ara 4için bir sonraki bağlantı bölünmesiyle takip. Asimetrik yapısı sayesinde, bazı karşılık gelen Karbonlar, farklı 13C NMR sinyalleri gösterdi (Şekil 5B).

Homo-PROTAC 8 , son derece güçlü olduğu gözlendi, crbn neredeyse tam bir proteasomal bozulması yol. Multipl myelom hücrelerinde crbn, IKZF1 ve IKZF3 protein düzeylerinin yorumlanmasında Batı leke Analizi (Şekil 6, Şekil 7, Şekil 9B), yarı niceliksel standart yöntem, protein değişimi ifade kolayca algılanabilir. Bu yazıda kullanılan antikorlar kaliteli ve Yöntem laboratuvarımızda optimize edilmiş bir standart işlemdir.

Buna ek olarak, CRBN 'nin bileşik 8 ' in bozulması, sgRNAs24tarafından crbn 'nin Crispr/Cas9-aracılı nakavt ile birlikte olduğu hücre performanslarını ve IMiDs (Şekil 8, Şekil 9a) direncini etkilemez. Hücre canlılığı tahlil içinde lüminesans sinyali ATP serbest dayalı, hangi ölü hücre sayısı olarak yorumlanır olabilir. Bu yöntem, yüksek sayıda numune ile kısa sürede kolayca gerçekleştirilebilir. Uygulanabilir/ölü hücrelerin ölçümü için alternatif bir yöntem, Akış sitometrisi ile bir Annexin V/7-AAD boyama olduğunu.

Figure 1
Şekil 1: E3 Ubiquitin ligaz CRBN IMiDs ana hedefidir. İmmünomodülatör ilaçlar CRBN 'ye bağlanır ve proteasomal bozulma için birkaç Neo-substrat işe. Lenfoid transkripsiyon faktörlerinin IMiD kaynaklı bozulması IKZF1 ve IKZF3 Multipl myelom hücrelerinin üzerindeki etkilerden ve bazı immünomodülatör özelliklerden sorumludur. Kasein kinaz 1α, lenalidomür tarafından seçmeli olarak bozulur, diğer IMiDs değil, Miyelodisplastik sendromda lenalidomür aktivitesine, kromozom 5q kaybına katkıda bulunur. SALL4 son zamanlarda thalidomür ve onun analogları tarafından indüklenen teratogenisite ile bağlantılı büyük olasılıkla tüm IMiDs ortak bir hedef olarak keşfedilen. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Protacs faiz proteini (POı) zayıflatabilir. PROTACs, bir bağlayıcı bir Ubiquitin ligaz ligand bir POı ligand bağlanır heterobifeter moleküllerdir. Üçlü kompleksleri oluşumuna göre, CRBN gibi bir Ubiquitin ligaz, daha sonra POı ubiquitinates, proteasomal bozulması ile sonuçlanan. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: E3 Ubiquitin ligaz CRBN bozulması Için Bifunctional homo-PROTAC. Bir pomalidomür tabanlı homo-Protac, iki Ubiquitin ligaz bağlayıcılar crbn çapraz-ubiquitination crbn kimyasal olarak indüklenmiş bir nakavt sonuçlanan neden bağlı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: homodimer 8 ve heterodimerdir 9 sentezi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: 1H NMR (top) ve 13C NMR (alt) spektrumları. Bileşik 8 (A) ve bileşik 9 (B) spektrumları DMSO-d6 ' da NMR spektrometre üzerinde kaydedildi. Kimyasal vardiyalar milyon başına (ppm) parçalar halinde verilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: bileşiklerin 8 ve 9 ' unda CRBN, IKZF1 ve IKZF3 etkileri. Pomalidomür tabanlı homo-PROTAC bileşik 8 IKZF1 ve IKZF3 üzerinde pomalidomide zayıf kalan etkileri ile crbn bozulma indükler. Buna karşılık, pomalidomür kalıntılarından birinde metil grubu içeren bileşik 9 ' da belirtilen konsantrasyonlarda (μM) hiçbir etkisi yoktur. MM1S hücreleri 24 saat tedavi için tedavi edildi. Crbn, IKZF1, IKZF3 ve tübülin üzerindeki etkileri (yükleme kontrolü) Batı Blot tarafından incelendi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: CRBN bozulması, proteasom INHIBITÖRÜ MG132 veya MLN4942 tarafından dolaylı olarak neddylation inhibisyonu ile Ubiquitin ligazlarını bloke edebilir. Multipl myelom hücre hattı MM1s, 3 h kombine tedavi için 100 nM 'de homo-PROTAC bileşik 8 ' e eklenmeden önce 1 h Için 10 μm MG132, 10 μm MLN4924 ile önceden tedavi edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: MM1S multipl miyelom hücrelerinde hücre canlılığı tahlil. Bileşik 8 ve negatif bağlama kontrol bileşiği 9 ' un pomalidomür duyarlı myelom hücre hattında hücre canlılığı üzerinde etkileri MM1S sonra 24 saat, 48 h ve 96 h tedavi. Hücre canlılığı 4 gün sonra triplicates olarak ölçülmüştür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: Bileşik 8 çoklu miyelom hücre hatlarında pomalidomür etkisini antagonize. Hücreler 100 nM bileşik 8 ile önceden tedavi edildi 3 h. daha sonra 1 μM pomalidomür eklendi. Hücre canlılığı 4 gün sonra triplicates olarak ölçülmüştür. p <0,001 öğrenci t-test (A) göre. Crbn, IKZF1, IKZF3 ve tübülin (yükleme kontrolü) için Batı leke Analizi 100 Nm bileşik 8 ile MM1S hücrelerin ön sonra 3 h için, 1 μM pomalidomür (B) ilavesi önce. Steinebach, C. ve al. 201824' den izin ile yeniden baskılı (adapte). Copyright 2019 Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRBN için burada açıklanan gibi homo-PROTACs tasarımı CRBN için pomalidomür spesifik benzeşimi dayanır, hangi başarıyla sayısız heterobifunktional PROTACs kullanılmıştır ve PROTAC gelişimi sonuçlandı 8 bir yüksek olarak Seçici CRBN düşürücü. Molekülün özgüllüğü zaten proteomik analizlerle onaylandı24. Genetik aracılı nakavt için, yan etkilerin dışlama ve doğrulanması zorlu ve zaman alıcı bir işlemdir. Buna ek olarak, kimyasal kaynaklı bir geri dönüşümsüz, hızlı ve doğrudan geçerli geniş bir yelpazede hücreler ve doku türleri28için uygulanabilir.

IMiDs thalidomür, lenalidomür ve pomalidomür Multipl myelom, B-hücreli lenfomalar ve myelodisplastik sendromun tedavisinde bir ana yer haline gelmiştir. İmids Neo-substratlar IKZF1, IKZF3 veya CK1α6,11,29zayıflatmak için crbn-CRL4 E3 ligaz özgüllüğü modülasyon tarafından faaliyetlerini Arabulmak. Buna ek olarak, imids diğer iki protein üzerinde crbn 'nin refakatçi fonksiyonunu abrogate gösterildi, MCT-1 ve BSG, multipl miyelom büyüme için de önemlidir30. CRBN 'nin homo-Bifunctional PROTAC tarafından bozulması, test edilen en Multipl myelom hücre hatları tarafından iyi tolere edildi ve CRBN inaktivasyon tek başına Multipl myelom hücrelerinin öldürülmesine neden olmak için yeterli olmadığını ima etti. Buna karşılık, bileşik 8 ile ön tedavi IKZF1/3 bozulma üzerinde imids etkilerini feshetmiş ve lenalidomür ve pomalidomür multipl miyelom hücreleri kurtardı. Bu, lenalidomür dirençli multipl miyelom hastalarında bulunan crbn ve zararlı crbn mutasyonlarının genetik inaktivasyonu ile uyumlu ve imids mekanizmasında crbn 'nin temel rolünü vurgular31,32 . Homo-PROTAC 8 bu nedenle İmid direnci bir devlet taklit etmek için kullanışlı bir araç olabilir. Henüz anjiyojenik veya TNFα salınımı inhibisyonu gibi tam olarak anlaşılmayan IMiDs 'in diğer etkileri CRBN fonksiyonunun inhibisyonunu elde edebilir ve homo-PROTAC, CRBN 'nin inaktivasyonunu daha da incelemek için uygun araçlardır. Buna ek olarak, karma 8 tarafından crbn kimyasal indüklenmiş nakavt crbn yeni endojen substratlar belirlemek ve crbn fizyolojik fonksiyonları aydınlatmak yardımcı olabilir. Bizim bileşik 8 kanser hücre hattı proliferasyon üzerinde hiçbir etkisi vardı göz önüne alındığında, crbn inhibisyonu tek başına hiçbir anti-tümör aktivitesi vardır. Ancak, CRBN parçalanıcıları kanserden başka hastalıklarda klinik olarak uygulanabilir. Bu bağlamda, crbn inaktivasyonu son zamanlarda sepsis direnç görüşmek ve yüksek yağ-diyet kaynaklı obezite fare 33,34,35önlemek için gösterilmiştir.

Sonuç olarak, crbn 'nin ilk kimyasal inhibitörlerini, thalidomür ve onun analogları ile ilgili sinyal ve moleküler mekanizmayla ilgili gelecekteki Biyomedikal araştırmalar için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir şekilde üretti ve doğrulıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar faiz potansiyel bir mali çatışma bildirmeyin.

Acknowledgments

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından destekleniyordu (Emmy-Noether programı KR-3886/2-1 ve SFB-1074-J.K.; FOR2372)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1'-Carbonyldiimidazole TCI chemicals C0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) Sigma-Aldrich 385506 Compound 6
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % Alfa Aesar A12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 % Acros 148270250 Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) Carl Roth 3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB Cell signaling 15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbit Sigma HPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody Sigma 7074S
Ammonium Persulfate Roth 9592.2
Boc-Gln-OH TCI chemicals B1649
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7571
ChemiDoc XRS+ Bio-Rad 1708265
DMF, anhydrous, 99.8 % Acros 348435000 Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 % Acros 348445000 Extra Dry over Molecular Sieve
Glycine Sigma-Aldrich 15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated) Santa Cruz biotechnology sc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) Thermo Scientific 1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab Cell signaling 14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) Merck IPVH000010
Iodomethane, 99 % Sigma-Aldrich I8507 Highly toxic
Methanol Sigma-Aldrich 32213-2.5L
Mg132 Selleckchem S2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell Bio-Rad 1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658004
MLN4942 biomol (cayman) Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) Sigma T5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % Alfa Aesar A11801
Nonfat dried milk powder PanReac AppliChem A0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate Thermo Scientific 136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Thermo Scientific NP0008
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Pomalidomide Selleckchem S1567
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46430
sodium dodecyl sulfate Carl Roth 183.1
Sodium Chloride Sigma-Aldrich A9539-500g
TEMED Carl Roth 2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate Sigma-Aldrich 89761 Compound 5
Tricin Carl Roth 6977.4
Trizma base Sigma-Aldrich T1503-1kg
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
WesternBright ECL spray Advansta K-12049-D50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Tags

Kimya sayı 147 CRBN PROTAC IMID pomalidomür Ubiquitin ligaz Multipl myelom proteasom
Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm,… More

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm, H., Mangold, M., Gütschow, M., Krönke, J. Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs. J. Vis. Exp. (147), e59472, doi:10.3791/59472 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter